利用荧光技术改进的蛋白质印迹法（Western blotting）使得检测蛋白质表达的微小变化成为可能，从而实现定量分析。本文介绍了一种在多种物种和组织类型中检测多种蛋白质的可靠方法，并提供了解决常见技术问题的策略。
本文内容
摘要
摘要
20世纪70年代末，首次公开报道了蛋白质印迹法（western blot）的使用，该技术用于检测复杂生物样品中特定蛋白质的存在及其相对丰度。自那时以来，蛋白质印迹技术已成为分子生物学家实验手段中的常用组成部分。在PubMed数据库中以“western blot”为关键词进行粗略检索可知，截至2014年，已有超过22万篇已发表的论文使用了该技术。尤为重要的是，近十年来，成像技术的进步与高灵敏度荧光标记物的开发相结合，显著提高了检测灵敏度，并进一步拓展了线性检测范围。其结果是，如今已发展出真正可定量的基于荧光的蛋白质印迹法（QFWB），使生物学家能够以前所未有的灵敏度和准确性开展比较性表达分析。目前存在多种“优化”的蛋白质印迹方法，并在不同实验室中被使用。然而，由于这些方法往往需要进行细微但未明确记录的操作步骤调整，因此在实际应用中常难以重复。本实验方案详细描述了一种成熟且可靠的QFWB方法，并提供了相应的故障排除策略。
引言
蛋白质印迹（Western blotting，WB）是一种分析技术，最初于20世纪70年代末期开发，用于检测复杂生物样品（如组织匀浆）中是否存在目标蛋白质1。由于该技术依赖关键的抗体-抗原相互作用，通常被称为蛋白质免疫印迹。该方法包含五个明确的步骤：1）按蛋白质的等电点进行电泳分离；2）将蛋白质转移至硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜；3）使用针对目标蛋白的特异性一抗进行标记；4）孵育针对一抗的二抗；5）显影检测。
随着时间的推移，可视化技术不断发展，以提高安全性和灵敏度。最早的蛋白印迹（Western blot, WB）实验采用放射性标记探针，随后发展为比色法，再演变为目前更为广泛使用的化学发光法（ECL）。放射性标记是将放射性同位素直接连接到特异性抗原的探针上，而比色法和ECL方法则采用间接标记技术，使用酶作为报告分子，例如碱性磷酸酶或链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）2。通过密度测定法测量显色或发光产物的标记强度，信号的强弱可反映样品中目标蛋白含量的多少。ECL方法灵敏度更高，因此更受青睐2，但这三种方法最初均基于X光胶片成像，之后逐步建立了更为先进的数字成像技术3。蛋白印迹数字成像技术的进步，不仅使研究人员能够判断目标蛋白在样品中是否存在，还可通过与其他样品比较，推断特定蛋白的表达水平，因此可称为“半定量”分析。近年来，一种真正实现定量且灵敏度更高的蛋白印迹技术被开发出来，该技术通过测定荧光信号强度，直接反映样品中单个蛋白的含量与表达水平：即定量荧光蛋白印迹技术（QFWB）。
在比较QFWB与ECL标记方法时，使用荧光二抗可产生线性检测曲线4。这与ECL技术形成对比，后者通常仅在蛋白上样量低于5 μg时呈现信号线性，而信号饱和则与蛋白表达水平直接相关，即与普遍表达的管家基因相关5,6。这种差异很可能是由于生物素化二抗上存在更多的结合位点，使亲和素-ECL底物更易结合，从而更易导致信号饱和。这正是ECL基础免疫印迹法通常被称为“半定量”的主要原因之一7。在检测表达水平微小差异时，信号饱和点至关重要，可能引起测量结果不准确。近年来，随着高通量蛋白质组学技术的发展，其灵敏度不断提高，并能识别更细微的表达差异，使得研究对真正定量的Western印迹验证实验的依赖日益增加8,9。因此，采用灵敏、稳健且真正定量的方法至关重要。
许多独立实验室已采用各种“优化”的蛋白质印迹（Western blotting）方法，但由于方法学上的细微调整在正式记录的实验方案中往往不明显，这些方法通常难以建立或重复。本文提供了一种经过验证且可靠的快速荧光蛋白质印迹（QFWB）实验方案，并进一步提供了在实施过程中可能遇到的常见问题的实用解决方案与优化策略。
该方案最初针对小鼠脑组织匀浆进行优化，但此后已成功应用于多种组织样本和物种4,9,10。文中包含了针对特定故障排除问题所需的潜在方案调整。
方案
本方案采用 commercially 生产的缓冲液、凝胶和转膜套装进行优化，以减少变异性并提高重复性。有关所需耗材的完整列表，请参见材料清单。
使用I-Blot快速转膜和LI-COR Odyssey成像系统的荧光Western Blot实验方案
1. 样品制备
- 缓冲液的选择与配制
- 选择合适的提取缓冲液用于样品匀浆，并确保该缓冲液与后续所有实验技术兼容。在样品分离前配制提取缓冲液：RIPA缓冲液（25 mM Tris-HCl (pH 7.6)，150 mM NaCl，1% NP-40，1% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS），并加入5%蛋白酶抑制剂混合物。
注意：市面上有多种不同类型的提取缓冲液，其选择取决于目标蛋白在细胞内的定位。常见的提取缓冲液包括但不限于 RIPA 缓冲液（适用于全细胞、线粒体及核组分）、NP-40 裂解缓冲液（适用于全细胞或膜结合蛋白）以及 Tris-Triton 缓冲液（适用于细胞质骨架结合蛋白）。然而，某些提取缓冲液中的化学去垢剂虽有助于蛋白的溶解或甚至使其失活，但在使用特定蛋白定量检测方法时，可能会干扰蛋白浓度的测定。 即， 二辛可宁酸（BCA）法。请查阅试剂盒制造商关于化学物质与该检测方法相容性的使用说明。
- 选择合适的提取缓冲液用于样品匀浆，并确保该缓冲液与后续所有实验技术兼容。在样品分离前配制提取缓冲液：RIPA缓冲液（25 mM Tris-HCl (pH 7.6)，150 mM NaCl，1% NP-40，1% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS），并加入5%蛋白酶抑制剂混合物。
- 蛋白质提取/溶解
- 使用剪刀和/或手术刀手动剪碎组织样本，随后在预冷的提取缓冲液中（组织重量与缓冲液体积比约为1:10 w/v），使用玻璃匀浆器或带聚丙烯头的手持式电动匀浆器进行匀浆，直至形成均匀一致的匀浆液。
注意：对于较小、珍贵或难以获得的样本，基于去污剂的提取方法在比例低至1:5时仍可有效。 - 匀质化后，将样品在 20,000 x g 离心 20 分钟，温度为 4 °C. 去除含有可溶性蛋白的上清液，并于 -80 °C 直至需要时再使用。保留不溶性沉淀物，以便日后如有需要可进行更严格的进一步提取。进入蛋白质测定步骤1.3。
- 使用剪刀和/或手术刀手动剪碎组织样本，随后在预冷的提取缓冲液中（组织重量与缓冲液体积比约为1:10 w/v），使用玻璃匀浆器或带聚丙烯头的手持式电动匀浆器进行匀浆，直至形成均匀一致的匀浆液。
- 蛋白质测定
- 使用BCA、Bradford或类似方法测定各提取样品中的蛋白质浓度。计算标准曲线时，确保决定系数（R²值）大于或等于0.99，以保证样品中蛋白质丰度测定结果的最高准确性。15.
注意：所有通过QFWB进行比较的样品必须使用相同的标准曲线进行检测。
- 使用BCA、Bradford或类似方法测定各提取样品中的蛋白质浓度。计算标准曲线时，确保决定系数（R²值）大于或等于0.99，以保证样品中蛋白质丰度测定结果的最高准确性。15.
- 样品制备
- 规划并记录两块相同凝胶的加样顺序：凝胶1用于转膜，凝胶2作为上样对照。将对照和“处理”样本依次加样，以避免因转膜效率低或结果不明确而引入偏差。
- 计算每个样品所需的蛋白质体积。在神经元分离物中检测蛋白质时，标准的蛋白质上样量为 15 μg. 将每份样品补足至 10 μl 用 dH₂O 定容2O. 添加 5 μl 上样缓冲液，涡旋混匀后加热 98 °C 2 分钟。
- 加入阳性对照样本（如重组蛋白），以帮助识别目标条带。但需按照生产商的说明书正确制备阳性对照样本，避免错误选择条带。参见 图1.
图 1. 阳性对照的选择。在实验中加入阳性对照可确认所检测到的信号真实存在。然而，在使用实验样本之前，必须谨慎验证对照是否正常工作。A) 按照生产商推荐的 1 μg/ml 浓度上样融合蛋白 TREM 2，但在 110 kDa 处观察到的信号与数据表中预测的分子量（60–70 kDa）不符。B) 加入还原剂并孵育后，融合蛋白的信号出现在预测的分子量位置。然而，由于还原过程减弱了蛋白信号，因此需要增加蛋白上样量。
2. 蛋白质的电泳分离
- 制备4-12% Bis/tris凝胶（1.0 mm）
注意：梯度凝胶可用于在较宽的分子量范围内实现更好的蛋白质分离。- 选择并配制MES或MOPS电泳缓冲液（每槽1 L），用dH2O稀释。MES缓冲液对分子量在3.5–160 kDa范围内的蛋白质分辨率更佳；而MOPS运行缓冲液适用于检测200 kDa以上的高分子量蛋白质，但对低于15 kDa的低分子量蛋白质分辨率较差。
- 取出梳子，并撕去覆盖凝胶底部的胶带。使用1 ml移液器用运行缓冲液轻轻冲洗加样孔。将运行缓冲液充满加样孔，并确保凝胶中无气泡残留。
- 凝胶制备与上样
- 将凝胶插入电泳槽中，并向凝胶间的空隙加入运行缓冲液，以确保所有密封处均有效密封。
- 在凝胶1和凝胶2的第一个加样孔中各加入3 μl分子量标准品。随后在其余加样孔中每孔加入10 μl样品。
注意：除蛋白ladder外，凝胶1与凝胶2必须完全一致。用于凝胶2的预染分子量标准品必须为蓝色，且在使用总蛋白染色时可见，以便在Odyssey成像仪的700通道中清晰显示。 - 两块凝胶上样完成后，向电泳槽中加入剩余的运行缓冲液，并盖紧盖子。
- 电泳
- 以80 V电压运行4分钟，确保样品以均匀方式进入聚丙烯酰胺凝胶基质。随后将电压提高至180 V，运行50分钟，或直至观察到样品染料迁移至凝胶底部。
注意：可采用更高电压以缩短电泳时间。然而，这可能导致“笑脸”状条带，即凝胶中间泳道的样品比两侧泳道跑得更快，这是由于温度升高所致14。
- 以80 V电压运行4分钟，确保样品以均匀方式进入聚丙烯酰胺凝胶基质。随后将电压提高至180 V，运行50分钟，或直至观察到样品染料迁移至凝胶底部。
3. 上样对照凝胶的总蛋白染色
- 使用胶铲从胶盒中取出凝胶 2，切除加样孔和凝胶底部，并对凝胶进行标记以辅助定位。
- 将约 30 ml 蛋白染色液倒入方形培养皿（尺寸约为 12 × 12 cm）中。将凝胶 2 放入染色液中，确保溶液完全覆盖凝胶，然后在室温下振荡染色至少 1 小时。
- 倒掉蛋白染色液，用蒸馏水洗涤凝胶 3 次，然后进行可视化检测。进入步骤 6.3 进行观察。
4. I-Blot 半干快速蛋白质转印
注意：使用 I-Blot 仪器进行蛋白质转移所需的所有试剂均为专为 I-Blot 方法设计的商用产品，详见材料列表。
- 准备“底部”转膜堆叠。揭开锡箔盖，直接从凝胶槽中用运行缓冲液润湿。用蒸馏水预润湿滤纸。
- 重复步骤 3.1，将凝胶 1 放置在已准备好的“底部”转膜堆叠上。
- 将预润湿的滤纸覆盖在凝胶上。用滚轴轻轻滚动滤纸与凝胶，确保各层之间无气泡残留。
- 取下顶部转膜堆叠的锡箔盖，将顶部堆叠放置在滤纸和底部堆叠之上。滚动整个转膜“三明治”结构，以排除任何夹层气泡。
- 从转膜堆叠试剂盒中取出海绵，放置在 I-Blot 仪器的盖子上。将转膜三明治结构放入 I-Blot 仪器的指定位置，然后牢固关闭盖子。启动 I-Blot 程序，选择程序 3，运行 8.5 分钟进行转膜。
- 若蛋白信号较弱或高/低分子量蛋白比例不均，建议测试制造商推荐的转膜时间，尤其是在使用半干式“快速”转膜方法时。可通过运行简单的优化实验，使用相同上样量的重复样本来确定最佳的转膜电压与时间组合，如图 2所示。
图 2. 使用 I-Blot 优化转膜过程。 A) 一块凝胶上加样 DNA 标准品以及三份重复的 15 μg 小鼠全脑匀浆样本，并将凝胶切成三部分。其中一部分未进行转膜，另两部分分别转膜 7.5 分钟（按照制造商推荐方案）和 8.5 分钟。随后用 Instant Blue 蛋白染色剂对凝胶各部分染色，在红外成像仪的 680 通道扫描并进行定量分析。 B) 定量结果的图形展示，显示在转膜 0、7.5 和 8.5 分钟后各凝胶中残留蛋白含量的差异。注意，增加 1 分钟转膜时间可使蛋白转移量额外增加约 45%。 请点击此处查看该图的放大版本。
5. 蛋白质的抗体检测
- 膜的制备与封闭
- 从I-Blot仪中取出转膜组件，移除顶部和滤纸层，暴露出底部转膜组件上的凝胶。
- 使用手术刀沿凝胶边缘切割，并在膜上保留一个三角形切口以用于方向定位。完成膜的修剪后，对凝胶进行蛋白染色以检测转膜效率，或直接弃去凝胶。
- 迅速将膜转移至含有5 ml 1x PBS的洁净50 ml离心管（或等效容器）中，并置于机械滚轮（或轨道摇床）上持续振荡。
注意：必须避免膜干燥。在半干转过程中，膜会发热。在打开转膜组件前应等待2分钟，以便其冷却并减缓拆解过程中的干燥速度。在洗涤和孵育过程中使用滚轮和离心管进行振荡，可显著减少所需溶液的体积。 - 用1x PBS洗涤膜3次，每次5分钟。弃去1x PBS，加入未稀释的封闭缓冲液，在室温下封闭至少30分钟。
- 一抗的配制
- 根据生产商说明书，将一抗用含0.1% Tween20的5 ml封闭缓冲液稀释。将膜与配制好的一抗在4 °C下孵育过夜，并持续振荡。
注意：封闭缓冲液通常直接使用未稀释液，但如果一抗特异性足够高，也可用PBS将其稀释至1:4。 - 弃去一抗溶液，用1x PBS洗涤膜6次，每次5分钟。
- 根据生产商说明书，将一抗用含0.1% Tween20的5 ml封闭缓冲液稀释。将膜与配制好的一抗在4 °C下孵育过夜，并持续振荡。
- 二抗的选择与配制
- 若仅为对照目的评估仅使用二抗的标记情况，则省略上述步骤5.2.1和5.2.2，直接进入步骤5.3，以确定样本特异性的二抗条带模式。参见图3。
图 3. 二抗的优化。 A) 使用多种荧光标记的二抗，对15 μg小鼠（M）、绵羊（O）和马（E）神经组织匀浆进行多物种比较，检测仅使用二抗时的非特异性标记情况。L为分子量标准蛋白。在使用驴抗山羊800抗体时，仅绵羊组织匀浆出现与二抗的交叉反应。B) 还需确认在使用其他组织样本时是否发生非特异性标记，例如，小鼠腓肠肌组织（上样量15 μg）。该样本与驴抗小鼠680二抗发生交叉反应，但在使用小鼠脑组织匀浆时未出现此现象。
- 按照生产商推荐的浓度，用含 0.1% Tween20 的封闭缓冲液配制荧光标记的二抗 680 或 800（红色或绿色通道）。将膜置于避光条件下，室温孵育 90 分钟，持续振荡。
- 弃去二抗溶液，用 1× PBS 洗涤膜 6 次，每次 5 分钟。进入第 6 步——检测成像。
- 若蛋白 Marker 显色效果不理想，可尝试使用多种二抗对预染蛋白 Marker 进行检测，作为合适的补充步骤。并非所有市售的二抗均能清晰显示所有商用预染蛋白 Marker 中的各条带。
- 若目标条带不可见，可更换不同宿主来源的二抗，i.e., 使用驴抗兔二抗替代羊抗兔二抗，是一种合适的方案调整。参见 Figure 4。由于对特定一抗缺乏足够的特异性，二抗的宿主物种有时会影响显色效果。
图 4. 二抗特异性的故障排除。 对多种组织样本（每泳道 15 μg 蛋白质）——脂肪、肌肉、肝脏和骨骼——使用 ERK 一抗孵育，并分别与三种不同的二抗进行孵育的 Western 印迹结果。上图：使用 LI-COR 山羊抗兔 680 二抗标记，脂肪和骨骼样本中仅出现微弱信号，肝脏和肌肉样本中未检测到信号。中图：将上图的膜剥离后，采用 ECL 方法并使用 HRP 标记的山羊抗兔二抗重新孵育。此时肌肉和肝脏样本中可见条带，脂肪和骨骼样本中的信号也更强。下图：将上图和中图的膜再次剥离后，使用 LI-COR 驴抗兔 680 二抗重新孵育，该二抗对 ERK 一抗具有更高的亲和力。此时肌肉和肝脏样本中均可见明显条带，脂肪和骨骼样本的信号强度也进一步增强。请点击此处查看该图的放大版本。
6. 可视化
注意：所有图像均使用 LI-COR Odyssey Classic 成像仪及配套的 Image Pro 分析软件（版本 3.1.4）获取。
- 旋转并打开计算机和成像仪。启动成像软件，并创建一个新文件。参见图5。
图5. 蛋白质印迹的可视化与定量。 扫描一张蛋白质印迹图，显示小鼠腓肠肌样品（上样量30 μg）使用Annexin V一抗（36 kDa）和山羊抗兔800二抗进行检测。膜在800通道中扫描并成像。为定量目标蛋白（Annexin V），在样品1的目标条带周围绘制一个矩形框。然后将该矩形框复制并粘贴至其余样品泳道，以确保测量相同区域。软件会自动计算所绘形状周围的背景值，但也可手动调整，以准确定义背景测量范围。下表列出了每个绘制区域的定量测量结果，包括总信号值、背景值以及扣除背景后的净信号值。这些数据可导出至电子表格程序，用于计算表达量比值（基于相对荧光强度），并进一步进行统计学分析。请点击此处查看该图的放大版本。
- 打开成像仪的盖子。在成像仪左下角的玻璃表面滴加少量1×PBS，然后将膜放置在PBS液滴上。确保膜与成像仪的坐标轴对齐，并在膜与网格坐标轴之间留出1 cm的间隙。
- 轻轻滚动膜片，确保玻璃与膜之间无气泡残留。
- 计数膜在x轴和y轴方向所占据的方格数。关闭成像仪盖子。在计算机软件中输入膜所占据的方格数。
- 选择适当的通道以扫描膜，该通道取决于二抗所标记的荧光标签。 即， 700 通道或 800 通道，分别对应使用 680 或 800 荧光标记抗体的情况。进行双重标记时，需在两个通道中分别扫描。
注意：在进行双重标记之前，先优化单个蛋白质的标记。 - 选择扫描膜的强度：若目标蛋白丰度较高，则使用低强度扫描；若一抗对目标蛋白的亲和力较差，则选择高强度扫描。 即， 5级。按下开始以启动扫描。进入步骤6.4。
- 加载对照凝胶的可视化（图6).
图6. 总蛋白标记与分析 A) 总蛋白标记凝胶的 photograph 20 μg 每泳道加入马颈交感神经节匀浆 BA 面板凝胶在 680 通道扫描结果。 C) 利用成像软件对总蛋白染色凝胶进行定量分析所得的测量结果图。通过分子量标记物确定的测量范围， 即， 30-110 kDa 范围内的蛋白被用于生成测量直方图，以确保组间样本的标准误（SEM）较低，表明每份样本中的总蛋白水平在凝胶上分布均匀。 请点击此处以查看此图的放大版本。- 按照步骤 6.1 和 6.2 进行操作。
- 在成像仪底部角落（网格坐标起点处）的玻璃上倒入蒸馏水。
- 将凝胶放置于水面上，调整位置使加样孔与网格的 x 轴或 y 轴垂直。凝胶与网格的 x 轴和 y 轴之间需留出 1 cm 的间隙，记录凝胶在网格轴向上所占的方格数。关闭成像仪盖子。
- 在计算机软件中输入凝胶所占的方格数。
- 选择 700 通道以扫描总蛋白染色凝胶。
注意：蓝色在700通道中发出荧光。 - 将强度设置为5，然后按开始。
- 扫描图像的定量分析
- 调整亮度和对比度按钮以获得最佳图像质量。如果背景噪声较高，请以较低强度重新扫描膜，并使用高质量扫描设置。
注意：任何调整都不会改变扫描时获取的荧光数据。 - 旋转图像 90°, 180° 和 270° 以便以期望的方向观察，且不对所获取的数据进行任何更改。然而，在“自由旋转”中对方向进行大于 3°以像素值获取的数据可能会失真，从而影响定量结果。
- 从形状菜单中选择一种形状——通常使用矩形——并围绕样品泳道1中目标条带（WB）或整个泳道（总蛋白凝胶）进行绘制。
- 将该形状复制并粘贴至样本2泳道中目标条带或整条泳道。对每个样本的各个目标条带及每条泳道重复此操作，适用于总蛋白凝胶。
- 检查背景测量是否未包含相邻泳道中的信号。软件可自动扣除背景，背景区域可选择为所绘制形状周围整个边缘，或指定为形状的上方/下方，或左侧和右侧。 Alternatively，可手动设定自定义背景框。
- 以任意荧光单位显示每种绘制形状的形状表信号。背景信号将自动从总信号中扣除。
- 将图像导出为 TIF 文件以便在不同软件中查看。请勿导出图像后使用非 Image Pro 软件进行处理，否则会修改成像设备获取的原始数据，导致产生虚假数据。
- 在对上样对照凝胶进行双重标记定量或多次测量以生成和汇总标准误差数据时，重复步骤 6.4.3–6.4.7。
- 调整亮度和对比度按钮以获得最佳图像质量。如果背景噪声较高，请以较低强度重新扫描膜，并使用高质量扫描设置。
7. 可视化后处理
- 将膜保存在1×PBS中，或干燥保存以备长期储存，以便将来对其他目标蛋白进行重新检测和膜剥离。
- 膜的剥离与重新检测。见图7。
图7. 膜的剥离与重新检测。 经不同剥离步骤后，使用红外成像系统扫描的膜的代表性示例。A。首次免疫检测使用CSP一抗（兔源），在700通道扫描。B。第一次剥离后，使用ROCK2抗体（兔源）重新检测，并在800通道成像。橙色箭头表示剥离和重新检测后仍残留的CSP一抗信号。由于ROCK2条带位于更高的分子量位置（白色箭头），因此不影响其检测。C。第二次剥离后，使用β-Spectrin抗体（山羊源）重新检测，并在800通道观察。D。第三次剥离后，使用α-synuclein抗体（兔源）重新检测。E。第四次剥离后，使用泛素抗体（小鼠源）重新检测，并在800通道成像。此时仍可见上一轮抗体（α-synuclein）的残留信号（橙色箭头）。F。第五次剥离后，使用CALB2抗体（兔源）重新检测，并在700通道成像。所用二抗包括：山羊抗小鼠800cw、山羊抗兔680rd、山羊抗兔800cw、驴抗山羊800cw（见材料列表）。泳道标签：L — 蛋白质分子量标记，1/2 — 样品1/2。请点击此处查看该图的放大版本。- 将膜置于含有约30 ml Revitablot剥离缓冲液的方形培养皿中，在室温下持续振荡孵育5–20分钟。
- 用PBS洗涤膜3次，然后在成像仪上重新扫描，以确认荧光信号已完全去除——每次剥离后均应重复此步骤。
- 若仍有荧光残留，可延长膜的孵育时间。每次剥离后均需重新扫描膜，以确认无残留的二抗信号。
注意：为确保膜完整性不受破坏，避免产生不良的高背景与信号比，膜的剥离与重新检测最多不应超过3次。
结果
由于QFWB检测的灵敏度和线性检测范围高于传统的ECL检测，因此必须采取若干关键的对照措施，以确保获得准确的数据，从而有助于有效的结果解读。首先，应设置阳性对照样本，如图1所示。其次，需优化转膜条件，以确保高分子量和低分子量蛋白从凝胶向膜的转移效率一致，如图2所示。第三，需对抗体进行优化，尤其是常被忽视的二抗优化，因为二抗可能产生非特异性条带，干扰对目标蛋白的正确解读，参见图3。第四，当某蛋白理论上应存在却无法检测到时，可能也是由于二抗的问题，此时可通过使用来自不同宿主物种的二抗来解决，参见图4。第五，与传统使用的单一组成型表达蛋白作为内参标准相比，总蛋白标记与分析是一种更为稳健且可量化的定量方法3。许多此类单一内参蛋白在神经退行性疾病模型中以及不同组织样本之间均被发现存在差异表达，且在同一组织内的表达均匀性也可能发生变化3。因此，通过总蛋白分析，结合各泳道在不同分子量范围内的蛋白上样量比较与定量，可生成上样对照凝胶图谱，用以确认各样本上样量的一致性，并显示标准误差，如图6所示。重要的是，所有这些故障排除技术和对照措施的有效性，取决于操作人员所采用分析工具的灵敏度与一致性（图5）。最后，由于QFWB技术具有更高的灵敏度、更低的背景信号、双色检测能力以及膜在长期储存条件下的稳定性等优势，其在膜的剥离与重复杂交方面比ECL更具灵活性。参见图7。
讨论
在开展任何实验之前，充分的考虑与规划至关重要，这最终将决定所用技术的成败。利用蛋白质印迹（WB）进行蛋白质检测的技术进步，在选择合适的抗体、转膜及显影方法时，可能会带来大量潜在的障碍。幸运的是，通过谨慎使用检查清单并采取适当的对照措施，荧光定量蛋白质印迹（QFWB）可被常规用于检测蛋白质的存在，以及样品间日益细微的表达差异。本方案提供了荧光定量蛋白质印迹的全面操作指南，并介绍了一些故障排除策略，以帮助避免和/或克服与此技术相关的诸多常见问题。
为保持灵敏度并获得真正可定量和可比较的测量结果，关键步骤包括：1）从组织样本中进行高效的蛋白质提取；2）样本制备；3）通过总蛋白分析确定准确的蛋白上样量；4）使用I-Blot实现蛋白质的最佳转膜；5）在含有0.1% Tween20的封闭缓冲液中配制一抗和二抗；以及6）利用红外成像仪及相关软件进行正确的可视化和分析。
红外荧光检测具有真正的定量性，与更传统的化学发光（ECL）检测技术相比，灵敏度更高3,11。该检测系统具有多种功能，因此不仅限于定量全组织印迹（QFWB）。该系统能够在低倍率下对免疫组织标记进行成像，从而实现对整个组织切片的可视化与定量分析12。在分辨率方面，这代表了一个潜在的未来发展方向，即远红成像在定量评估方面有望媲美传统显微镜下的常规免疫荧光成像。
然而，由于对蛋白质表达的微小变化具有更高的敏感性，因此必须确保变异程度尽可能最低，并采取严格的对照措施和稳健的实验方案。这包括从组织样本中进行严谨的蛋白质提取，随后制备总蛋白染色凝胶，以确认上样量的一致性；优化一抗和二抗的使用条件，以判断信号检测的真实性；并根据制造商提供的指南测试转膜时间，以实现高效的蛋白质转移。
然而，即使在对 WB 条件进行优化后，进行 Western blot 实验时仍可能存在一些尚未充分探讨的问题。这些问题包括但不限于蛋白质溶解以及提取缓冲液的选择。某些缓冲液可能干扰蛋白质浓度测定，而某些组织特别难以溶解，需要更高效的处理方法，例如使用 M 管等自动化研磨密闭容器配合 Macs 组织解离仪。此外，将提取后和未提取的样品在 -80 °C 下妥善保存这一简单的控制措施，可能决定了在提取后立即获得理想标记结果，还是数周后出现不良结果。
现代定量荧光Western印迹（QFWB）方法已被证实比传统的ECL等技术更灵敏，能够检测蛋白质表达的细微差异，并且具有更高的灵活性，可实现同时双重标记3。为了实现准确的定量和统计分析，Western印迹实验方案必须具有高度的稳健性和可重复性。本实验方案灵敏度高、重复性好，可常规用于多种不同组织样本和物种中蛋白质的检测3，并可在同一次QFWB实验中对低丰度和高丰度蛋白质进行定量，从而减少试剂消耗和每项实验所需时间11。此外，该技术的灵敏度提高使其可用于验证日益流行的组学（-omic）研究9,14，但准确性至关重要，必须严格采取适当的对照措施，以避免获得错误的数据。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢以下机构提供的经费支持：BBSRC 研究所战略项目基金 - CF & TMW；BBSRC 东部生物科学博士培训项目资助——LG；爱丁堡达尔文信托基金——MLH。我们还要感谢 Barry McColl 博士允许我们在本文中纳入 TREM2 优化实验。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RIPA 裂解缓冲液 | Fisher Scientific UK Ltd | 10230544 | |
| M 管 | Miltenyi Biotec Inc. | 130-093-236 | |
| iBlot 转膜套装，PVDF 常规 | Life Technologies, UK | IB401001 | |
| MagicMark XP 西部蛋白标准品（20–220 kDa） | Life Technologies, UK | LC5602 | 用于凝胶 1 的 Western blotting |
| SeeBlue 预染蛋白标准品 | Life Technologies, UK | LC5625 | 用于凝胶 2 总蛋白染色凝胶 |
| NuPAGE LDS 上样缓冲液 4x | Life Technologies, UK | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液（仅用于 Bis-Tris 凝胶）(20x) | Life Technologies, UK | NP0002 | |
| NuPAGE Novex 4–12% Bis-Tris 凝胶 1.0 mm，12 孔 | Life Technologies, UK | NP0322BOX | |
| 磷酸盐缓冲液片剂 | Sigma-Aldrich, UK | P4417-100TAB | |
| Micro BCA 蛋白定量试剂盒 | Fisher Scientific UK Ltd | 10249133 | |
| Odyssey 封闭缓冲液 | Li-Cor Biosciences | P/N 927-40000 | |
| IRDye 680RD 山羊抗兔 IgG (H+L)，0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68071 | |
| IRDye 680RD 驴抗小鼠 IgG (H+L)，0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68072 | |
| IRDye 800CW 山羊抗兔 IgG (H + L)，0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-32211 | |
| IRDye 800CW 驴抗山羊 IgG (H + L)，0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-32214 | |
| ODYSSEY CL 近红外成像系统 | Li-Cor Biosciences | 索取报价 | |
| iBlot 7 分钟转膜系统 | Life technologies, UK | 该型号已停产 | |
| InstantBlue 蛋白染色液 | Expedeon, UK | ISB1L | |
| Revitablot 西部印迹 stripping 缓冲液 | Rockland Immunochemicals Inc. | MB-085-0050 |
参考文献
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology. 1992 (24), 145-149 (1979).
- Walker, J. M. Protein Protocols on CD-ROM. , Humana Press Inc. Totowa, NJ, USA. (1998).
- Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. Chapter. 10, 10(2008).
- Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PLoS One. 8 (8), 72457(2013).
- Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative Western blots. Exp. Anim. 60, 193-196 (2011).
- Colella, A. D., et al. Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology. Anal Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).
- Zellner, M., et al. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. Electrophoresis. 29, 3621-3627 (2008).
- Kielar, C., et al. Molecular correlates of axonal and synaptic pathology in mouse models of Batten disease. Hum Mol Genet. 18, 4066-4080 (2009).
- Mutsaers, C. A., Lamont, D. J., Hunter, G., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. Label-free proteomics identifies Calreticulin and GRP75/Mortalin as peripherally accessible protein biomarkers for spinal muscular atrophy. Genome Med. 5 (10), 95(2013).
- Wishart, T. M., et al. Dysregulation of ubiquitin homeostasis and β-catenin signaling promote spinal muscular atrophy. J Clin Invest. 124 (4), 1821-1834 Forthcoming.
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
- Hawes, J. J., Brunzell, D. H., Wynick, D., Zachariou, V., Picciotto, M. R. GalR1, but not GalR2 or GalR3, levels are regulated by galanin signalling in the locus coeruleus through a cyclic AMP-dependent mechanism. J Neurochem. 93 (5), 1168-1176 (2006).
- Bond, D., Primrose, D. A., Foley, E. Quantitative evaluation of signaling events in Drosophila S2 cells. Biol Proceed Online. 10 (1), 20-28 (2008).
- Wishart, T. M., et al. Differential proteomics analysis of synaptic proteins identifies potential cellular targets and protein mediators of synaptic neuroprotection conferred by the slow Wallerian degeneration (Wlds) gene. Mol Cell Proteomics. 6, 1318-1330 (2007).
- Silva, J. M., McMahon, M. The fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis. J. Vis. Exp. (84), 51149(2014).
重印与许可
申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表
申请许可