人脂肪来源基质细胞的分离与富集以增强成骨作用

摘要

利用细胞表面标志物和成骨基因，可在单细胞水平上定义人脂肪来源基质细胞内的转录异质性。我们描述了一种利用流式细胞术分离具有增强成骨潜能的细胞亚群的方案，该方案可用于增强颅面骨骼的重建。

摘要

骨髓来源的间充质基质细胞（BM-MSCs）被认为是基于干细胞的组织工程应用中的“金标准”。然而，其获取过程可能伴随显著的供体部位并发症。相比之下，脂肪来源的基质细胞（ASCs）更为丰富且易于获取，使其成为BM-MSCs的一种有吸引力的替代选择。与BM-MSCs类似，ASCs可分化为成骨谱系细胞，并可用于组织工程应用，例如接种于支架材料上用于修复颅面部骨骼缺损。ASCs来源于消化后的脂肪组织中的基质血管组分（SVF），该组分是ASCs、血管内皮细胞和壁细胞、平滑肌细胞、周细胞、成纤维细胞以及循环细胞的异质性混合物。流式细胞术分析表明，ASCs的表面标志物谱与BM-MSCs相似。尽管已有若干发表的研究确立了ASC表型的标志物，但对于如何鉴定这一异质性群体中的成骨前体细胞，目前仍缺乏共识。本实验方案描述了如何分离并利用一种具有增强成骨能力的ASC亚群，以修复临界尺寸的颅骨缺损。

引言

干细胞群体的异质性尚未被完全理解，这仍是开发临床有效的干细胞治疗应用的主要障碍之一。对干细胞异质性群体进行表征的最常用方法之一是采用细胞分选技术，例如基于荧光激活的细胞分选（FACS），根据细胞表面标志物的表达谱对其进行分离。随着分选方法日益复杂，人们得以识别出更多具有不同功能的细胞亚群。基于微流控的技术正越来越多地被用于单细胞水平的基因表达分析。在微流控芯片中进行多重定量聚合酶链式反应（qPCR），可实现高效、可靠、高分辨率的单细胞转录分析。^1-5

在之前一项使用48个基因的单细胞转录谱分析的研究中，发现ASCs之间存在显著的转录异质性。⁶ 然而，基因 MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 的分布与一群具有高度成骨转录特征的细胞簇表现出强烈关联。为了根据这一成骨基因表达谱分离细胞，研究人员将表面抗原表达模式与转录模式进行关联分析，随后发现内皮素（CD105）的表面标志物表达与ASCs增强的成骨分化潜能密切相关。除CD105表达外，表面受体Thy-1（CD90）的表达——一种由Chen et al. 早前证实与成骨前体细胞相关的糖基磷脂酰肌醇锚定膜蛋白——也被发现与成骨相关基因表达相关联。^6,7 这些发现为前瞻性地从异质性较强的ASC群体中分离出具有更高成骨能力的亚群提供了可能，从而促进基于细胞的骨组织工程应用。

方案

注意：所有患者样本均在获得知情同意后采集，实验方案已通过斯坦福大学机构审查委员会（方案编号 #2188 和 #9999）的审查和批准。

1. 细胞分离与培养：

1. 从接受腹部、侧腹和/或大腿区域择期脂肪抽吸术的健康女性患者中获取人皮下脂肪组织。确保已获得机构审查委员会（IRB）对从人组织中分离ASCs的方案的批准，并在处理此类材料时遵循机构的安全防护措施。
2. 为从脂肪抽吸物中获取基质血管组分（SVF），首先用等体积的1×无菌磷酸盐缓冲液（PBS）清洗脂肪抽吸物三次。小心吸除并弃去底部水相层。
3. 配制胶原酶消化缓冲液：0.075% I型胶原酶溶于Hank’s平衡盐溶液（HBSS）中。配制FACS缓冲液：PBS中含2% FBS、1% P188和1%青霉素-链霉素。使用市售的0.22 μm孔径快速流速聚醚砜滤器过滤上述两种溶液。
4. 为消化清洗后的脂肪组织，加入等体积的胶原酶消化缓冲液，并将消化容器稳妥置于摇动水浴中，在37 °C下消化60分钟（约180次/分钟）。
   注意：最好使用比所需体积更大的消化容器，以便在振荡过程中实现最大程度的消化（即，250 ml胶原酶消化缓冲液与250 ml清洗后的脂肪组织置于1L无菌烧瓶中）。
5. 加入等体积的FACS缓冲液以中和酶活性，并在室温下静置5分钟。随后在4 °C下以233 × g离心20分钟。
6. 小心吸除并弃去上清液，注意不要扰动高密度的SVF沉淀。
7. 根据沉淀物大小，用5–10 ml室温红细胞裂解缓冲液重悬沉淀。室温静置5分钟 ，然后在室温下以233 × g离心5分钟。
8. 吸除上清液，并根据沉淀物大小加入5–10 ml传统生长培养基重悬沉淀（DMEM/10% FBS/1%青霉素-链霉素溶液[pen-strep]）。
9. 将细胞悬液通过100 μm尼龙细胞滤器过滤，以去除细胞碎片。
10. 在4 °C下以233 × g离心5分钟，弃去上清液，注意不要破坏沉淀。
11. 根据沉淀物大小，用5–10 ml传统生长培养基重悬沉淀。
12. 将2 × 10⁶个细胞接种于15 cm标准培养皿中，在37 °C、21% O₂、5% CO₂条件下过夜建立原代培养。维持培养物处于亚融合状态，以防止在37 °C、21% O₂、5% CO₂条件下使用生长培养基时发生自发性分化。
    注意：一个完全融合的15 cm培养皿中的细胞密度约为4–6 × 10⁶个细胞。

2. 染色

1. 在染色/分选前，将ASCs在传统生长培养基中于37 °C、21% O₂、5% CO₂条件下培养36小时。
2. 使用Accutase从培养板上消化ASCs（按照制造商的操作说明）。
3. 用FACS缓冲液（含2% FBS和1%青霉素-链霉素的PBS）洗涤细胞一次。
4. 在4 °C下以233 × g离心5分钟。
5. 弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。根据细胞数量和所需抗体用量，将细胞重悬于0.5–1 mL FACS缓冲液中。
   注意：细胞悬液的体积应根据FACS抗体制造商的建议确定抗体浓度。但如果首次使用某种抗体，通常建议进行抗体浓度滴定，起始浓度可设为1:100。
6. 使用血细胞计数板计数总细胞数。
7. 将100 μL等分试样保留于1.5 mL离心管中，用于未染色样本及单色对照（根据所用荧光抗体的数量设置）。
8. 加入适当浓度的荧光标记单克隆抗体（根据制造商说明预先确定浓度），避光冰上孵育20–30分钟。
   1. 标记成骨亚群：将抗CD90抗体（APC标记抗人CD90（Thy1））或抗CD105抗体（FITC标记抗人CD105（endoglin））用FACS缓冲液按1:50稀释。
   2. 标记其他细胞群体（例如，造血细胞和内皮细胞）：将抗CD45抗体（Pacific Blue标记抗人CD45）、抗CD34抗体（APC标记抗人CD34）和/或抗CD31抗体（PE标记抗人CD31）用FACS缓冲液按1:50稀释。
   3. 若未使用直接偶联抗体，可采用生物素标记的一抗与相应的链霉亲和素偶联二抗（如Streptavidin PE-Cy7）联合使用，稀释比例为1:100。
9. 孵育后，用FACS缓冲液洗涤细胞两次：将离心管加满FACS缓冲液，在4 °C下以233 × g离心5分钟，吸除上清液。
10. 将细胞重悬于400–500 μl FACS缓冲液中，并通过70 μm尼龙细胞滤网过滤，以去除细胞团块。
11. 将标记后的细胞转移至带滤膜帽的FACS管中，分析期间始终保持样本在冰上。

3. 荧光激活细胞分选

注意：以下步骤要求操作者具备荧光激活细胞分选（FACS）的相关知识，或需由熟练的技术人员协助完成。

1. 使用适当的FACS软件设计分析图，以检测前向散射（FSC）、侧向散射（SSC）、藻红蛋白-得克萨斯红（PE-Texas Red）、太平洋蓝（Pacific Blue）、异硫氰酸荧光素（FITC）、别藻蓝蛋白（APC）以及用于标记细胞的任何其他荧光染料。
2. 上样至细胞分选仪前，轻轻涡旋振荡每个样品以重悬细胞。
3. 首先分析未染色样本，以设定总细胞群的门控，排除细胞碎片，并确定自发荧光基线。
4. 向未染色样品中加入碘化丙啶（PI），并进行分析，以观察总细胞群体中活细胞的群体。围绕该群体设置门控。
5. 针对每种荧光染料分析单色对照样本，以设置荧光补偿。
6. 分析染色样本以确定分选门的位置。
7. 加入PI对染色样本进行死细胞染色。
8. 分选标记的细胞群体。将细胞分选至含有培养基的1.5 ml离心管或15 ml锥形管中。
9. 当获得所需数量的细胞后，手动停止分选。
10. 使用FACS，通过分析一小部分（例如所获细胞群体的500个细胞。
    注意：此步骤用于确认分选后细胞群体的纯度。理想情况下，纯度应大于90-95%。
11. 分选完成后，立即在 4 °C 下以 233 × g 离心 5 分钟，然后重悬于 1 ml 含 10% FBS 的新鲜培养基中。
    注意：培养基的用量可根据细胞沉淀的大小适当增加。
12. 接种于明胶包被的培养板上以提高细胞存活率。根据最终细胞产量，将300,000个细胞接种至6孔板的每孔中，或将100,000个细胞接种至12孔板的每孔中。

结果

使用CD90作为成骨能力增强细胞的标志物，可分离出高度富集的人类ASCs群体（图1A、1B）。ASCs用Pacific Blue标记的抗人CD45抗体、FITC标记的抗人CD105抗体以及APC标记的抗人CD90抗体进行染色。分选后，通过分选后分析测定，细胞纯度高于98%。

基于转录谱对细胞群进行定义，使得两种新型亚群得以前瞻性分离。为表征各具潜力亚群（CD90）的成骨潜能⁺ 和 CD105^低），以及未分选群体的相应指标 体外细胞在成骨分化培养基中培养14天，具体方法如前所述 ^6,8,9碱性磷酸酶染色（用于骨形成早期检测）¹⁰第7天时，CD90的表达显著增加⁺ 与其他组相比的人群图2A）。这在宏观观察和定量分析后均被观察到（图2A）。类似地，茜素红染色（一种用于检测细胞外基质矿化及终末成骨分化指标的实验方法）⁹在第14天显示CD90<...

讨论

目前，从人脂肪组织的基质血管组分（SVF）中分离出均一的脂肪源性干细胞（ASCs）亚群仍然是一个具有挑战性但值得追求的目标。其中，分离具有促成骨潜能的ASC亚群尤为理想，因为这类细胞可用于研究骨骼组织的形成与稳态。然而，脂肪组织的SVF在干细胞能力及分化潜能方面具有显著的异质性¹¹。这种异质性的分子基础无法通过细胞混合群体来理解，而必须依赖单细胞分析¹²。通过这一方法，可鉴定出与ASC成骨分化潜能密切相关的表面标志物。

如上述方法所述，成功富集ASCs最关键的因素除了所使用的抗体外，还与FACS过程中采用的抗体密切相关。必须谨慎选择对目标细胞表面标志物具有高亲和力的抗体。理想情况下，应使用直接偶联的一抗，而不是需要多步操作的间接染色法，因为后者会增加细胞死亡、细胞丢失和误差累积的风险。此外，在FACS过程中进行一些细微优化可提高细胞活力，包括将细胞分选至低温容器中、始终将细胞置于冰上、将细胞分选至含有培养基的容器中，以及将分选获得的细胞群体接种到预先用10%明胶包被的培养板上。进行分选后纯度分析非常重要，以确保分选细胞的纯度。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
一次性 250 ml 锥形管	Corning (Thomas Scientific)	2602A43
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	Gibco	15140-122
DMEM，高糖，含 GlutaMAX 补充剂	Gibco	10566-016
PBS，pH 7.4	Gibco	10010-023
聚维酮碘 - 抗菌消毒液	Purdue	PFC-67618015017
Hank's 平衡盐溶液，1×	Cellgro	21-023-CV
胎牛血清，经认证，美国来源	Gibco	16000-044
来自 Clostridium histolyticum 的胶原酶	Sigma-Aldrich	C0130-5G
ACCUTASE 细胞解离溶液	Stem Cell Technologies	7920
APC 标记小鼠抗人 CD90 抗体	BD Pharmingen	559869
FITC 标记小鼠抗人 CD105（内皮糖蛋白）抗体	BD Pharmingen	561443
抗人 CD45 eFluor 450 抗体（Pacific Blue 替代品）	eBioscience	48-9459-41
抗人 CD34 APC 抗体	eBioscience	17-0349-41
抗人 CD31（PECAM-1）PE 抗体	eBioscience	12-0319-41
链霉亲和素 PE-Cy7	eBioscience	25-4317-82
BD FACS Aria II 仪器	BD Biosciences
BD FACSDiva 软件	BD Biosciences