方法文章

增强型简化表示亚硫酸氢盐测序法用于单碱基分辨率下的DNA甲基化分析

DOI：

10.3791/52246

⸱

2015年2月24日

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1Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, 2Institute for Computational Biomedicine, Weill Cornell Medical College, 3Department of Physiology and Biophysics, Weill Cornell Medical College, 4Department of Pathology, University of Michigan

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

增强型简化表示亚硫酸氢盐测序是一种基于限制性内切酶消化结合胞嘧啶亚硫酸氢盐转化的DNA甲基化分析测序文库制备方法。该方案需要50 ng起始材料，可获得在基因组GC富集区域的碱基对分辨率数据。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA甲基化模式图谱在正常组织和病变组织中均受到广泛研究。目前已建立多种方法用于检测细胞中的胞嘧啶甲基化模式。简化基因组重亚硫酸盐测序（Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing）旨在检测富含GC的基因组位点上具有单碱基分辨率的定量胞嘧啶甲基化模式。该方法通过结合限制性内切酶消化与重亚硫酸盐转化来实现。增强型简化基因组重亚硫酸盐测序（Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing, ERRBS）可提高生物学相关基因组位点的覆盖范围，已被用于分析人、小鼠及其他生物DNA中的胞嘧啶甲基化谱。ERRBS首先对DNA进行限制性内切酶消化，以产生低分子量的片段用于文库构建。这些片段随后进行标准的下一代测序文库制备流程。在最终扩增步骤前，对未甲基化的胞嘧啶进行重亚硫酸盐转化，从而实现对覆盖区域内胞嘧啶甲基化水平的单碱基定量解析。该实验方案可在四天内完成。尽管测序前三个碱基复杂度较低，ERRBS文库在使用指定测序对照通道时仍可获得高质量数据。随后进行序列比对与生物信息学分析，所得数据可轻松整合至多种全基因组分析平台。ERRBS仅需少量起始材料，因此适用于处理人类临床样本，并广泛适用于各类科研应用。本视频展示了ERRBS实验方案中的关键步骤。

引言

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胞嘧啶上的DNA甲基化（5-甲基胞嘧啶）是一种在哺乳动物细胞中至关重要的表观遗传标记，参与多种生物学过程，包括但不限于基因组印记、X染色体失活、发育以及基因表达调控1-8。对恶性肿瘤及其他疾病中DNA甲基化模式的研究已确定了与特定疾病相关的甲基化特征，增进了对疾病发病机制的理解，并推动了潜在生物标志物的发现9-17。 目前已有多种用于检测表观基因组中DNA甲基化状态的实验方案。这些方法可分为基于亲和富集、基于限制性内切酶以及基于亚硫酸氢盐转化的检测技术，后续通常结合微阵列或测序平台进行分析。此外，还有一些方法跨越了上述分类，包括但不限于联合亚硫酸氢盐限制性内切酶分析法18和简化基因组亚硫酸氢盐测序（RRBS19）。

RRBS 最初由 Meissner 等人19,20 描述。该方案引入了一个富集基因组中 GC 富集区域的步骤，随后进行亚硫酸氢盐测序，从而获得具有单碱基分辨率且成本效益较高的定量数据21,22。GC 富集区域通过 MspI（C^CGG）限制性内切酶进行靶向，胞嘧啶甲基化状态则通过亚硫酸氢盐转化（未修饰的胞嘧啶脱氨为尿嘧啶）后经聚合酶链式反应（PCR）扩增来解析。RRBS 能够覆盖大部分基因启动子和 CpG 岛，仅需全基因组测序一小部分的测序量；然而，其对 CpG 海岸区及其他具有生物学意义的基因间区域的覆盖有限。自最初报道以来，多个研究团队已发表更新的 RRBS 方案，改进了方法学并提升了对这些基因组区域的覆盖度23-25。增强型简化基因组亚硫酸氢盐测序（Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing, ERRBS）相较于 RRBS，在文库构建步骤和数据分析比对策略方面进行了优化26。ERRBS 能在生成的数据中呈现更多的 CpG 位点，并显著提高所有被检测基因组区域的覆盖度26。该方法已被用于解析人类患者及其他动物样本中的 DNA 甲基化模式26-30。

本文所述的ERRBS方案详细介绍了完成实验所需的全部步骤，所用数据通过代表性的人类DNA生成（样本来源于先前报道的、去标识化的患者样本31，以及一名正常人类供体的CD34+骨髓样本）。该方案包含自动化的片段大小筛选步骤，可缩短每个样本的处理时间，并提高文库片段大小选择的准确性。本方案结合了一系列成熟的分子生物学技术：首先使用对甲基化不敏感的限制性内切酶（MspI）消化高分子量DNA，随后进行末端修复、A尾添加以及甲基化接头的连接；接着对富含GC的片段进行大小筛选，再经亚硫酸氢盐转化和PCR扩增后用于测序。亚硫酸氢盐转化方法此前已有描述32，而数据分析与应用的详细综述不在本文范围内，但为读者提供了相关建议和参考文献。该方案可在四天内完成，适用于微量起始材料（50 ng或更少）。按本方案操作可获得每个CpG位点的高覆盖度数据，不仅足以进行差异甲基化位点和区域的鉴定，还可用于检测表观遗传多态性，如Landan et al.33 所述。

方案

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注意：本研究已获得威尔康奈尔医学院机构审查委员会的批准（方案编号 0805009783），并按照赫尔辛基宣言的规定进行。

注意：使用前请查阅相关材料的安全数据表（在本方案中以“注意”标示）。所用的多种试剂具有毒性，建议采取适当的安全防护措施（包括个人防护装备和通风橱）。

注意：除非另有说明，本方案中的所有步骤均在室温下进行

1. 基因组DNA的制备与消化

  1. 以 50 微升（µl）无 DNase 水中的 50 ng 高质量基因组 DNA（> 人类 DNA 大小超过 40 千碱基）作为起始材料。根据制造商推荐的方法，使用基于荧光的定量检测法对 DNA 进行定量。
  2. 将 50 ng DNA 与 2 µl MspI（100,000 单位/毫升）、10 µl 相应的 10× 反应缓冲液以及无 DNase 水混合，使反应总体积达到 100 µl。
  3. 将反应液置于 37 °C 的热循环仪或水浴中孵育至少 18 小时。
  4. DNA 提取与沉淀
    1. 使用苯酚-氯仿抽提法纯化已消化的 DNA。
      1. 向步骤 1.3 中的每个反应液加入 200 μl 的 10 毫摩尔/升（mM）三（羟甲基）氨基甲烷（Tris-Cl）pH 8.0 缓冲液，使总体积达到 300 μl。
      2. 在通风橱中，向 DNA 溶液中加入 150 µl Tris-乙二胺四乙酸（TE）饱和苯酚和 150 µl 氯仿混合液（1:1；注意：有危险），短暂涡旋混匀。
      3. 在室温下，以 20,800 × g 在微量离心机中离心 10 分钟。
      4. 将上一步所得的上层水相（约 300 µl）转移至新管中。
    2. 使用乙醇沉淀法沉淀已消化的 DNA。
      1. 向每管中加入 1 µl 糖原（20 毫克/毫升）、1/10 体积（30 µl）的 3 M pH 5.2 醋酸钠溶液和 2.5 体积（750 µl）室温 100% 乙醇。高速涡旋混匀。
      2. 在 4 °C 下，以 20,800 × g 在微量离心机中离心 45–60 分钟。
      3. 迅速倒置管子，并用手腕快速轻弹管壁，使管子在纸巾上滑过，快速去除乙醇。确保 DNA 沉淀仍附着在管壁上。
      4. 向每管中加入 600 µl 室温 70% 乙醇。观察沉淀从管壁脱落。轻轻翻转管子 5 次以混匀。
      5. 在 4 °C 下，以 20,800 × g 在微量离心机中离心 45–60 分钟。
      6. 迅速倒置管子，并用手腕快速轻弹管壁，使管子在纸巾上滑过，去除乙醇。
      7. 小心吸除残留液体，尽可能去除所有乙醇。可使用带有无 DNase 10 µl 吸头的真空装置吸除残液，必要时让沉淀在空气中干燥，以彻底去除残留乙醇。
        注：避免过度干燥沉淀，否则会影响下一步重悬时的溶解性。
      8. 将 DNA 沉淀重悬于 30 µl 10 mM Tris-Cl（pH 8.5）（缓冲液 EB）中。
        注：为防止 MspI 消化产生的“粘性”CG 突出端重新退火，必须在同一天内完成从本步骤至连接步骤（方案步骤 4）的全部操作。

2. 末端修复

  1. 将30 µl MspI消化的DNA（来自步骤1.4.2.8）转移至冰上（4 °C）的PCR管中，并加入表1中的试剂。
  2. 在热循环仪中，于20 °C孵育末端修复反应30分钟，热盖开启。
  3. 使用商业化的基于离心柱的纯化试剂盒纯化DNA产物，以去除未掺入的dNTPs及其他反应试剂；该试剂盒依据制造商建议，在高盐缓冲液条件下结合DNA，并在低盐缓冲液条件下洗脱DNA。用32 µl Buffer EB洗脱DNA产物。

3. A尾添加

  1. 将步骤 2.3 中的 32 µl DNA 溶液转移至冰上（4 °C）的 PCR 管中，并加入表 2 中所列的试剂。
  2. 在热循环仪中，于 37 °C 孵育 A-tailing 反应 30 分钟，热盖开启。
  3. 使用基于商品化柱的纯化试剂盒纯化 DNA 产物，以去除未掺入的 dATP 及其他反应试剂；该试剂盒依据制造商建议，在高盐缓冲液条件下结合 DNA，并在低盐缓冲液条件下洗脱 DNA。用 10 µl Buffer EB 洗脱。

4. 连接接头

  1. 将10 µl的A尾DNA转移至冰上（4 °C）的PCR管中
  2. 按照表3中详述的成分向DNA中加入连接反应试剂，并按照表4中详述的成分加入接头
  3. 在热循环仪中于16 °C孵育连接反应过夜，热盖保持开启状态
  4. 使用固相可逆固定化（SPRI）磁珠分离法，按照试剂制造商的建议纯化连接产物。例如，使用Agencourt AMPure XP磁珠时，磁珠体积与样品体积的比例为1.8X（对于50 µl的连接反应，使用90 µl磁珠）。用30 µl无DNase的水洗脱产物。
    1. 连接后的DNA可在进行片段大小选择前于-20 °C保存

5. 大小筛选

注意：根据 DNA 起始量选择第 5.1 节中的自动化片段筛选方案或第 5.2 节中的手动凝胶回收片段筛选方案。对于起始 DNA 量为 25 ng 或以上的样本，可采用自动化片段筛选方案（使用如 Pippin Prep 等仪器）。当 DNA 起始量较低（5–10 ng）时，必须采用手动凝胶回收方法。

  1. 使用 Pippin Prep 对输入 DNA 量为 25 ng 或更高的样本进行片段大小选择（图 2A）。
    1. 在 Pippin Prep 上创建一个新的片段大小选择程序。
    2. 选择“2% DF Marker L”作为胶条。点击“使用内部标准”按钮。确认“Ref lane”编号与实际加样孔编号一致。
    3. 为每个孔选择“Range”作为收集模式。在每个孔的 "BP Start" 中输入 135，在 "BP End" 中输入 410，在 "BP Pause" 中输入 240。
    4. 保存该程序。
    5. 向来自连接反应（步骤 4.3）的每份 30 µl 样本中加入 10 µl Marker L，使总体积达到 40 µl。按照标准 Pippin Prep 操作流程准备凝胶胶条和仪器。
    6. 从样本孔中移除 40 µl 电泳缓冲液，并将步骤 5.1.5 中的 40 µl 样本加入无染料凝胶胶条的 5 个孔中。
      注意：无染料琼脂糖凝胶胶条对于适配子连接的 DNA 片段的片段大小选择至关重要，因为溴化乙锭的存在可能改变叉状适配子结合片段的迁移特性。
    7. 选择在步骤 5.1.1 中创建的程序，并开始运行。
    8. 当运行在 240 个碱基对（bp）处暂停时，从每个使用的孔对应的洗脱模块中收集 40 µl 洗脱液（低片段组分：135–240 bp）。仪器将为每个孔单独暂停。在每个孔于 240 bp 处暂停时，重复步骤 5.1.5–5.1.7。
    9. 用 40 µl 新鲜电泳缓冲液通过移液吹打三次清洗洗脱模块，弃去 40 µl 洗涤缓冲液。额外重复清洗步骤两次，并彻底去除洗脱模块中的残留液体。清洗洗脱模块可减少低片段组分 DNA 向高片段组分收集中的残留。
    10. 加入 40 µl 新鲜电泳缓冲液，重新密封洗脱模块并继续运行。
    11. 当仪器提示洗脱完成时，从每个洗脱模块中收集 40 µl 洗脱液至新管中。此洗脱液包含高片段组分（240–410 bp）。若同时运行多个凝胶胶条，在进行亚硫酸氢盐转化前，将片段大小选择后的样本保存于 4 °C。
  2. 使用手动凝胶回收法进行片段大小选择（图 2B）
    1. 制备含 0.2 µg/ml 溴化乙锭的 1.5% 琼脂糖凝胶（注意安全）。
    2. 在凝胶两侧相邻的孔中加入用上样缓冲液配制的 50 bp 和 100 bp DNA 标准物。
    3. 向纯化后的连接产物中加入 2 μl 6X 橙色 G 上样染料。将每个样本的全部体积分别上样至独立的孔中，样本之间至少跳过一个孔，以避免交叉污染。
    4. 以每厘米 3.5 伏的电压进行电泳，直至 DNA 标准物完全分离且橙色 G 染料迁移至凝胶底部（至少一小时）。
    5. 使用洁净的剃刀片切下 DNA 标准物条带，并在紫外透射仪上观察（注意安全）。切勿将样本暴露于紫外光下。使用剃刀片或移液器吸头标记标准物的 150 bp、250 bp 和 400 bp 条带。标记标准物条带可使后续样本切胶无需暴露于紫外光下。
    6. 将标准物条带与凝胶其余部分对齐。以标记的条带为参照，切下包含 150–250 bp 文库组分（低片段）的一块凝胶，以及另一块包含 250–400 bp 文库组分（高片段）的凝胶。将这两块凝胶分别放入不同的离心管中。
    7. 对所有样本重复切胶操作，每次使用洁净的剃刀片处理每个凝胶孔。
    8. 使用凝胶回收试剂盒，按照制造商提供的操作说明纯化低片段和高片段文库组分。每份样本洗脱至 40 µl EB 缓冲液中。为确保在步骤 7 中对低片段和高片段文库组分均能高效进行 PCR 扩增，在亚硫酸氢盐转化步骤中需将两组分作为独立样本分别处理。

6. 亚硫酸氢盐转化

  1. 根据制造商的建议设置亚硫酸氢盐转化对照（例如，Universal Methylated Human DNA Standard 试剂盒）。在亚硫酸氢盐转化过程中，对照样品的处理方式应与待测样品完全相同。
  2. 使用商业试剂盒按照制造商推荐的方案进行亚硫酸氢盐转化。应选用在处理和纯化过程中模板降解和 DNA 损失较少、同时能实现高亚硫酸氢盐转化率的商业试剂盒。若使用 EZ DNA Methylation 试剂盒，则按制造商推荐的方案操作，但以下步骤除外：将样品置于热循环仪中按如下程序孵育：55 个循环：95 °C 30 秒，50 °C 15 分钟，最后在 4 °C 保存。
  3. 用 40 µl 无 DNase 水洗脱样品。应在完成亚硫酸氢盐转化的同一天进行富集 PCR（步骤 7）。经亚硫酸氢盐处理的 DNA 富含 AU 且为单链，稳定性较差。
  4. 通过 Sanger 测序验证所用对照的亚硫酸氢盐转化效率，确保非甲基化胞嘧啶的转化率高于 99%。

7. 扩增 PCR

  1. 根据表5中的试剂，为每个文库片段配制PCR预混液（优化用于FastStart Taq DNA聚合酶）。
  2. 将PCR预混液加入每个40 µl的亚硫酸氢盐转化后的文库片段中，通过移液混匀。将200 µl反应体系均分为四份，每份50 µl，分装至四个PCR管中。
  3. 在PCR仪中按照以下程序扩增反应：将加热盖温度设为100 oC，先在94 °C下预变性5分钟；进行18个循环的变性、退火和延伸步骤：94 °C变性20秒，65 °C退火30秒，72 °C延伸1分钟；最后在72 °C下终延伸3分钟，然后在4 °C下保存。
    注意：对于起始材料量较低（少于10 ng）或首次使用本方案的用户，建议进行18个PCR循环。可根据需要调整PCR循环数（对于50 ng起始DNA，可低至14个循环；参见表6）。

8. 纯化 PCR 反应产物

  1. 将每组4个反应（每个文库组分包含四个50 µl的PCR反应）合并。
  2. 根据生产商的建议，使用SPRI磁珠法（或其他可去除未掺入引物及其他PCR反应试剂的方法）纯化PCR产物。以下步骤已针对Agencourt AMPure XP试剂进行优化。
    1. 向低分子量组分的扩增产物中加入1.7倍体积的SPRI磁珠（200 μl PCR产物对应340 μl）。
    2. 向高分子量组分的扩增产物中加入1.1倍体积的SPRI磁珠（200 μl PCR产物对应220 μl）。
    3. 按照生产商的建议进行PCR产物纯化，洗涤步骤使用800 µl 70%乙醇。
    4. 用50 µl无DNase的水洗脱，并加入1M Tris缓冲液，使每个文库的Tris-Cl浓度达到10 mM，pH 8.5。将文库储存于-20 °C。

9. 文库质量控制

  1. 根据制造商推荐，使用针对双链DNA的荧光定量检测法对文库进行定量。基于分光光度法的测量结果不可靠。预期浓度范围为：较低文库组分10 - 50 ng/µl，较高文库组分3 - 15 ng/µl。
  2. 使用生物分析仪（bioanalyzer）及高灵敏度DNA试剂盒评估文库片段大小和质量。观察文库产物并确定各文库组分的平均片段长度。较低文库组分的平均长度通常在180至210 bp之间，较高文库组分通常在280至310 bp之间。

10. 准备测序文库

  1. 按如下方法计算每个文库组分的摩尔浓度：
    1. 使用步骤 9.2 中获得的图谱对每个文库组分进行片段大小分析。例如，若使用生物分析仪，请使用“区域（region）”功能，并覆盖所评估文库组分的起始和终止位置。
    2. 记录每个文库组分的平均片段大小（单位：bp）。
    3. 使用以下公式计算每个文库组分的摩尔浓度（DNA 的纳摩尔浓度）：DNA 纳摩尔浓度 = [(ng/1000)/(bp×660)]×10^9，其中 ng 表示以 ng/μl 为单位的浓度（如步骤 9.1 所测得），bp 表示文库组分的平均片段大小，660 表示标准双链 DNA 碱基对的分子量。例如：一个片段大小为 326 bp、浓度为 14.2 ng/μl 的文库，其 DNA 纳摩尔浓度为 66 nM。
  2. 为每个文库组分配制 10 µl 浓度为 2 nM 的溶液，使用无 DNase 的水进行稀释。
  3. 将文库组分混合：对每个制备的样本文库，取 10 µl 浓度为 2 nM 的低片段组分与 10 µl 浓度为 2 nM 的高片段组分混合。该混合物即为用于测序的最终 ERRBS 文库。
  4. 对 ERRBS 文库进行测序
    1. 上机时目标密度为每平方毫米 600,000–650,000 个簇（建议上机浓度为 7–8 皮摩尔）。
    2. 在 HiSeq 2500 测序仪的高通量模式下，对文库进行至少单端 51 个循环的测序。
    3. 使用指定的对照泳道（参见讨论部分了解其原理）。

11. 数据分析

注意：有关推荐使用的命令和脚本的完整详细信息，请参阅补充代码文件 1 和 2。

  1. 使用测序仪制造商提供的软件（例如：Illumina 的 CASAVA v1.8.2）将碱基识别文件（.bcl 文件）转换为每个样本对应的独立 FASTQ 文件。如果使用测序核心平台，此步骤可能由平台提供并/或在测序计算机上自动完成。
  2. 对测序读段进行过滤，保留通过质量筛选的读段（详见补充代码文件 1）。CASAVA 生成的 FASTQ 文件包含通过和未通过质量筛选的读段。使用自定义脚本，利用序列标识符中的 <is filtered> 元素，仅保留通过质量筛选的读段。
  3. 使用能够去除接头序列的软件工具（如 Flexbar37），从过滤后的 FASTQ 文件中读段的 3' 端切除接头序列。设置最小重叠长度（-ao）为 6，去除接头后保留的最小读段长度（--m）为 21，允许错配数的阈值（-at）为 2，其余参数使用默认值。作为 Flexbar 的替代方案，步骤 11.3 中可使用任何具备接头去除功能的软件（例如：cutadapt38、trimmomatic39）。
  4. 使用 Bismark41 将经过过滤和接头切除的测序读段比对至经亚硫酸氢盐转化的人类参考基因组 hg19（全基因组比对策略），并确定每个胞嘧啶的甲基化背景。Bismark 是一种定制的短读段比对工具，可将经亚硫酸氢盐处理的读段比对至一个所有“C”被转换为“T”的参考基因组，并返回 CpG、CHG 和 CHH 背景下胞嘧啶的甲基化状态。通常将种子长度（-l）设为读段长度以提高比对准确性，其余参数使用默认值。
  5. 比对完成后，首先按染色体、然后按起始位置、最后按链方向对已比对的读段进行排序。
  6. 使用自定义脚本（详见补充代码文件 2 中的脚本命令），遍历 Bismark 输出的已排序甲基化调用结果，计算每种胞嘧啶甲基化背景（CpG、CHG、CHH）下亚硫酸氢盐转化的胞嘧啶（T；代表未甲基化的 C）和未转化的胞嘧啶（代表甲基化的 C）的甲基化百分比得分，仅保留 Phred 质量得分不低于 20 且覆盖深度至少为 10× 的胞嘧啶。
    注：输出结果为每种胞嘧啶背景的甲基化得分文件，各列分别为：位置、链、覆盖深度、胞嘧啶百分比和胸腺嘧啶百分比；对于 CHG 和 CHH 背景，另包含一列表示下一个碱基（H）。
  7. 使用自定义脚本（详见补充代码文件 2 中的脚本命令）根据甲基化得分计算转化率，并输出所考虑的其他胞嘧啶（CHG 和 CHH 背景）总数、平均转化率和中位转化率。分别计算两条链的转化率，并对整个文库进行汇总统计。平均转化率定义为非 CpG 背景下的 C 数量（包括转化和未转化）占总 C 数量的比例。CHG 或 CHH 背景下的胞嘧啶通常未甲基化，因此在测序数据中表现为胸腺嘧啶。
  8. 使用 Bismark 提供的 bismark2SAM_v5_xm.pl41 和 SAMTOOLS42 生成比对读段的 BAM 文件，并使用自定义脚本将 CpG 甲基化调用结果转换为 wiggle 格式文件。后处理输出可进一步转换为其他格式（如 bedgraph），并在基因组浏览器（如 UCSC Genome Browser43 或 IGV44）中查看。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

图1 概述了ERRBS流程，突出了关键步骤，这些步骤将在下文所述方案中详细说明。ERRBS文库使用50 ng输入DNA制备。

评估所制备文库的质量。文库制备通常会产生 150-250 bp 和 250-400 bp 的片段（图 3A-C）。不同样本之间的文库片段大小分布存在轻微差异是正常的。请注意，在较小和较大的文库片段中均会出现非常强的 DNA 条带，提示特定序列的富集。MspI 消化可导致在人类基因组中以 190 bp、250 bp 和 310 bp 存在的一类重复 DNA 序列在 ERRBS 文库中富集。这三个重复序列构成了 ERRBS 文库的特征性标志20（见 图 3A-C 和 图 3G）。代表性文库使用单端读长在新一代测序仪上进行测序。当在 Illumina HiSeq 2500 测序仪上以推荐的文库浓度上样时，预期簇密度为每 mm2 500,000–700,000。在此簇密度下，81.6% ± 3.14%（n = 81）的簇能够通过过滤（图 4A）。由于文库插入片段末端复杂度较低（MspI 识别位点：C^CGG），测序过程中前三个碱基的荧光强度值和质量分数变化较大（图 4B-C）；然而，若包含独立的对照通道（见讨论部分），85% 的碱基质量分数将达到 30 或以上（Q30 值；图 4D）。

按照本方案所述进行数据比对和胞嘧啶甲基化检测，可获得单碱基分辨率的数据（表7）。对于人类基因组，在HiSeq 2500高通量模式下，一个ERRBS文库在单个测序通道中进行51个循环的单端测序，通常可产生153,194,882 ± 12,918,302条总读段，经质量过滤和接头序列修剪后，可用于分析流程的读段数为152,231,183 ± 13,189,678条。ERRBS文库的平均比对效率通常为62.95% ± 5.92%，可检测到3,183,594 ± 713,547个CpG位点，每个CpG位点的最低覆盖深度为10x，平均覆盖深度为84.94 ± 16.29（n = 100）。

ERRBS 方案适用于多重测序（参见补充文件1：多重测序的方案优化）。代表性测序运行的数据汇总见图5。将多重测序运行的数据（51个循环的单端测序；每泳道两个文库，n = 128；每泳道三个文库，n = 11；每泳道四个文库，n = 11）与ERRBS文库的整泳道测序（51个循环的单端测序，n = 100）进行比较，同时也对单个泳道数据进行下采样，以模拟每泳道50%、33%和25%的读长（即每泳道分别对应2、3和4个样本的多重测序，n = 3）。随着每个样本的测序读长数量随多重因子增加而减少，覆盖度不低于10×的CpG位点数量以及每个CpG位点的平均覆盖度也随之降低（图5和表8）。非CpG位点的平均转化率预期为99.85% ± 0.04%（n = 400）。若转化率低于99%，可能提示亚硫酸氢盐转化不充分，从而导致假阳性甲基化水平升高。

使用 R 2.15.245 中的 methylKit 软件包26（命令详情见补充代码文件 1）分析了从代表性人基因组 DNA 制备的 ERRBS 文库数据。该数据可在常用的基因组浏览器中进行可视化展示（图 6A）。胞嘧啶甲基化数据均等地来源于两条链（图 6B），并覆盖了所有可能的胞嘧啶甲基化水平范围（图 6C）。对代表性人 DNA 样本的技术重复进行分析，结果显示数据结果之间具有高度一致性（图 6D），并覆盖了广泛基因组位点中的 CpG 位点（图 6E 和 图 6F），这与先前报道的结果一致26。技术重复通常产生较高的 R2 值（大于 97%），而生物学重复的 R2 值范围为 0.92 至 0.9626，不同人细胞类型之间的比较则会产生低于 0.86 的 R2 值（数据未显示）。

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图1：ERRBS实验流程步骤流程图。图表所示步骤可在常规工作日内完成。 * 表示一个潜在的暂停节点（连接反应纯化后、片段大小选择前，即实验步骤5），在此处样品可在继续后续流程前于 -20 °C 冻存。

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图 2： 片段大小选择流程。（A） ERRBS Pippin Prep 流程中所用设置的截图（参见实验方案第 5.1.2–5.1.6 节）：（1）选择胶块类型；（2）选择所用标准品；（3）为每条泳道选择收集模式；（4）输入收集的碱基对范围；（5）保存该流程。（B） 第 5.2 节实验方案中所用手动凝胶提取步骤：（1）电泳后可见的 DNA 分子量标记；（2）使用刀片标记用于片段大小选择的范围；（3）切下的样品图像（较低片段：150–250 bp，较高片段：250–400 bp）。请点击此处查看此图的放大版本。

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图3： 使用生物分析仪对人源DNA样本制备的代表性ERRBS文库进行质量控制的结果。（A） 类似凝胶的图像，显示标准分子量标记（1）、较低文库组分（Pippin Prep分离的135-240 bp组分）；2）以及较高文库组分（Pippin Prep分离的240-410 bp组分）；3）。（B） 预期较低文库组分的生物分析仪电泳图。 （C） 预期较高文库组分的生物分析仪电泳图。 D-F） 低质量文库制备的代表性数据。标准分子量标记（1）、较低文库组分（2）和较高文库组分（3）的类凝胶图像（D）。箭头标记的150 bp处条带显示接头过量。较低（E）和较高文库组分（F）的电泳图，150 bp处出现过量接头峰（箭头标记）。（G） 用于测序的混合ERRBS文库的生物分析仪电泳图。红色曲线代表高质量的混合文库，其中较高和较低组分比例均等；蓝色曲线代表混合文库质量不达标，无法用于测序，因其较高和较低组分比例不均。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图4： 在HiSeq 2500测序仪高输出模式下进行的代表性ERRBS 51个循环单端测序运行的测序图谱。（A） 两个载有ERRBS文库泳道中的簇密度（K/mm2 = 每平方毫米1,000个簇；蓝色）以及通过过滤的簇密度（绿色）。（B） 在一个载有ERRBS文库的泳道中，前30个循环中观察到的典型荧光强度。注意前三个循环荧光强度中来自MspI酶切的CGG特征信号。（C） 一个ERRBS泳道中每个循环碱基质量值达到或超过30（%>Q30）的比例。（D） 一个ERRBS泳道中所有循环的碱基质量值分布。蓝色表示低于Q30，绿色表示大于或等于Q30。在此泳道中，84.7%的碱基质量值达到或超过30。

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图5： 测序输出结果。多重测序和每泳道单样本测序运行的实验数据（以绿色方框表示）以及通过对三个ERRBS文库的测序运行进行模拟下采样获得的数据（以蓝色方框表示；每次测序运行采样五次）的箱线图，测序运行来自51个循环的单端测序。 多重因子对应于每泳道测序的ERRBS文库数量。1 = 整个泳道或100%的读段，代表每泳道一个ERRBS文库的数据；2 = 50%泳道，代表每泳道两个ERRBS文库的数据；3 = 33%泳道，代表每泳道三个ERRBS文库的数据；4 = 25%泳道，代表每泳道四个ERRBS文库的数据。（A） 每个多重因子对应的读段数，即分析的序列数量。（B） 每个多重因子对应的测序数据覆盖的CpG位点数量。（C） 每个多重因子对应的每个CpG位点的平均覆盖深度。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6： 由人基因组DNA制备的ERRBS文库的代表性数据。 （A） 加州大学圣克鲁兹分校（UCSC）基因组浏览器43中一条ERRBS测序通道的代表性数据图像。y轴标尺表示每个胞嘧啶的甲基化水平（0–100%），覆盖深度至少为10倍。上方自定义轨道代表正链，下方自定义轨道代表负链。图示区域为chr12:6,489,523-6,802,422（hg19），包含该基因组区域内的refseq基因及CpG岛。（B） 来自代表性人CD34+骨髓样本中正链和负链上CpG覆盖度的分布直方图。（C） 来自代表性人CD34+骨髓样本中两条链上CpG甲基化水平的分布直方图。（D） 人DNA样本代表性技术重复之间的CpG甲基化水平相关性散点图。（E） 饼状图，展示由人基因组DNA制备的代表性样本中，在ERRBS中被覆盖的CpG位点注释到CpG岛（浅绿色）、CpG岸区（灰色）及其他区域（白色）的比例。（F） 饼状图，展示在ERRBS中被覆盖的CpG位点注释到基因启动子区（红色）、外显子（绿色）、内含子（蓝色）及基因间区（紫色）的比例。请点击此处查看此图的放大版本。

试剂体积备注
10x T4 DNA连接酶反应缓冲液10 µl
脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液混合物4 µl每种核苷酸浓度为10 mM的混合液
T4 DNA聚合酶5 µl3,000 单位/ml
DNA聚合酶I大（Klenow）片段1 µl5,000 单位/ml
T4多核苷酸激酶5 µl10,000 单位/ml
无DNase水45 µl

表1：末端修复反应试剂。 末端修复反应中使用的试剂名称及用量（实验步骤2.1）。

试剂体积备注
10x 反应缓冲液5 µl例如，NEBuffer 2
1 mM 2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸 (dATP)10 µl
Klenow 片段 (3’→5’ 外切酶缺陷型)3 µl5,000 单位/ml

表2： A加尾反应试剂。 A加尾反应中使用的试剂名称及用量（实验步骤3.1）。

试剂体积备注
15 µM 变性接头（溶于无DNase水）3 µlPE接头1.0和PE接头2.0；序列和参考信息见表4
10x T4 DNA连接酶反应缓冲液5 µl
T4 DNA连接酶1 µl2,000,000 单位/ml
无DNase水31 µl

表3：接头连接反应试剂。 接头连接反应中使用的试剂名称及用量（实验步骤4.2）。

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表 4：ERRBS 实验方案中所用的寡核苷酸。 在 ERRBS 实验方案的连接反应（实验步骤 4）和 PCR 扩增步骤（实验步骤 7）中所使用的寡核苷酸列表。请点击此处查看此表格的放大版本。

试剂体积备注
含 18 mM 氯化镁的 10x FastStart High Fidelity 反应缓冲液20 µl
10 mM dNTP 溶液混合物5 µl
25 µM PCR PE 引物 1.04 µl参见 表 4
25 µM PCR PE 引物 2.04 µl参见 表 4
FastStart High Fidelity 酶2 µl5 单位/µl FastStart Taq DNA 聚合酶
无 DNase 水125 µl

表4：ERRBS实验方案中使用的寡核苷酸。 在ERRBS实验方案的连接反应（方案步骤4）和PCR扩增步骤（方案步骤7）中所用寡核苷酸的列表。

试剂体积备注
含 18 mM 氯化镁的 10x FastStart High Fidelity 反应缓冲液20 µl
10 mM dNTP 溶液混合物5 µl
25 µM PCR PE 引物 1.04 µl参见 表 4
25 µM PCR PE 引物 2.04 µl参见 表 4
FastStart High Fidelity 酶2 µl5 单位/µl FastStart Taq DNA 聚合酶
无 DNase 水125 µl

表5： PCR反应试剂。 PCR扩增反应中使用的试剂名称及用量（实验步骤7.1）。

实验步骤试剂/方案细节输入DNA量
5-10 ng25 ng50 ng
1MspI酶1 µl2 µl2 µl
MspI消化反应体积50100100
4连接反应中的接头1 µl2 µl3 µl
连接反应体积20 µl25 µl50 µl
5片段大小选择方案仅手工凝胶Pippin Prep或手工凝胶Pippin Prep或手工凝胶
7PCR引物浓度25 µM25 µM14个循环使用10 µM；18个循环使用25 µM
PCR循环数181814-18

表6： 起始材料量在5-50 ng范围内的实验方案步骤调整。 本实验方案中的多个步骤需根据起始材料量调整试剂使用量，以从不同量的起始材料中生成高质量文库。此处列出了关键试剂用量的调整。请相应调整反应中缓冲液和水的体积。

染色体碱基位置链覆盖度freqCfreqT
chr110564R36685.5214.48
chr110571F42391.258.75
chr110542F43291.28.8
chr110563F42994.645.36
chr110572R36696.993.01
chr110590R37088.1111.89
chr110526R350928
chr110543R36892.937.07
chr110525F43391.928.08
chr110497F43588.7411.26

表7： 代表性ERRBS数据。在完成数据比对和胞嘧啶甲基化水平测定后，可获得碱基对数据。 对于每个被覆盖的CpG位点，如上所述的比对流程将确定其基因组坐标（列：chr = 染色体，Base 和 Strand）、特定位点的覆盖度（Coverage），以及检测到的胞嘧啶与胸腺嘧啶的百分比（分别为 freqC 和 freqT）。

每通道 ERRBS 文库数量唯一比对读段的平均数量覆盖的 CpG 位点平均数量每个 CpG 位点的平均测序深度
1152,231,184 ± 13,189,6783,183,594 ± 713,54785 ± 16
277,680,837 ± 7,657,0582,674,823 ± 153,494 49 ± 9
349,938,156 ± 2,436,8652,552,186 ±- 76,62439 ± 2
434,457,208 ± 4,441,6861,814,461 ± 144,33928 ± 4

表8： 单样本与多重ERRBS文库测序的代表性参数。 显示的是每通道51个循环的单端测序运行所得数据：每通道唯一比对的读段数、覆盖的CpG位点数量以及每个CpG位点的平均覆盖深度，数据来源于每通道测序单个ERRBS文库（n = 100）、每通道两个ERRBS文库（n = 128）、每通道三个ERRBS文库（n = 11）以及每通道四个ERRBS文库（n = 11）的结果，数值以均值±标准差表示。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案可获得生物相关基因组区域胞嘧啶甲基化的碱基对分辨率数据。当前方案已针对50 ng起始材料进行优化，但亦可调整以适用于不同量的输入材料（5 ng或以上）。26这将需要对方案中的某些步骤进行调整，如所示。 表6ERRBS文库适用于双端测序，通过超过51个循环的读长测序可进一步提高基因组覆盖度。多重测序可降低每个样本的测序成本，但会导致数据中每个CpG位点的覆盖深度降低图5 和 表8），无法提供足够的覆盖深度，以进行需要每个CpG位点高覆盖度的分析（例如 如Landan所述 等33最后，本实验方案（或任何基于亚硫酸氢盐的方案）无法区分甲基化胞嘧啶与羟甲基化胞嘧啶。46,47然而，所生成的数据可与其他实验方案的结果进行整合48,49 以阐明不同的修饰类型，以及最近报道的其他胞嘧啶修饰50，如果这些内容会引起兴趣的话。

高质量的文库如图3A-C所示，合并后进行测序时会产生如图3G（红色轨迹）所示的峰图，表明两个文库组分的摩尔浓度相等。文库构建失败可能发生在实验流程的任何步骤中。若使用降解的DNA进行处理，则所得文库中MspI片段不会富集，从而导致按照本方案所述测序参数获得的CpG覆盖度较低。若某一酶失活或意外遗漏于某一步反应中，将无法获得预期的文库。若连接反应效率低下、接头浓度高于预期和/或引物浓度在最终扩增步骤中成为限制性因素，均可能导致文库构建失败。文库中过量的接头（在生物分析仪结果中表现为约150 bp处的峰；图3D-F）也会干扰测序，因为文库和过量接头会无差别地发生簇生成。尽管此类文库可能表现出看似正常的测序结果，但其中相当一部分测序读段仅为接头序列。若在文库中观察到过量接头，最好在材料允许的情况下，使用最佳输入量与接头比例重新进行文库构建。最后，为确保文库的PCR扩增效率，在整个亚硫酸氢盐转化和PCR富集步骤中，应将较小和较大的文库组分保持为独立的样品。若未如此操作，则在PCR扩增过程中，大小不同的文库组分扩增效率将出现差异（如图3G蓝色轨迹所示），并可能导致测序时各文库组分所覆盖的基因组位点代表性不均。用户可选择在亚硫酸氢盐转化后立即加入定量PCR步骤，以进一步确定扩增所构建文库所需的最优PCR循环数。

ERRBS 文库构建方案包含多个关键步骤，各步骤中建议使用特定的试剂。在末端修复步骤中，使用四种核苷酸的 dNTP 混合物可对不含 CG 突出末端的产物进行末端修复，例如由 MspI 酶的星号活性产生的片段或原始 DNA 样本中存在的机械剪切 DNA 片段，从而提高结果中 CpG 位点的代表性。在连接步骤中，必须使用高浓度连接酶（2,000,000 单位/mL）和甲基化接头，以确保连接反应高效，并防止后续的亚硫酸氢盐转化影响接头序列——这些序列对数据的准确比对至关重要。在 PCR 步骤中，必须使用能够扩增经亚硫酸氢盐处理的富含 GC 的 DNA 片段的聚合酶，以实现高特异性。最后，为彻底去除多余的接头和引物，建议采用 SPRI 磁珠纯化法（例如：Agencourt AMPure XP），而非基于离心柱的纯化方法，用于连接产物和 PCR 产物的分离。

为了获得高质量的数据，确保高效的亚硫酸氢盐转化至关重要。所提供的对照使用户能够在测序前评估转化效率。作为替代方案，可使用非人类来源的DNA（如λ DNA）作为内参对照（spike-in）。由于物种差异，此类对照可直接用于后续测序分析例如 如 Yu 所用 等34然而，如果使用了外源添加的对照序列（spike-in），则除非在文库测序之前对其进行特异性扩增并独立测序，否则无法用于测定文库测序前的转化效率。所测定的转化率基于非CpG位点的甲基化状态，因此在非CpG背景下胞嘧啶甲基化水平较高的情况下（例如胚胎干细胞），该方法可能不适用；此时可采用平行样本或其他方法来评估转化效率。

ERRBS文库测序存在一些独特的注意事项。由于MspI识别切割位点（C^CGG；见图4B、C），所测序的文库片段前三个碱基几乎完全非随机，这可能导致测序过程中尽管表观簇密度较高，但因簇定位不佳而导致低质量读段，进而造成显著的数据丢失。为克服这一障碍，建议在独立通道中加入高复杂度文库作为专用对照（如PhiX对照或其他类型文库）。高复杂度文库在测序前四个碱基中具有均衡的A、C、T和G分布。合适的对照通道可包括RNA-seq、ChIP-seq、全基因组测序文库，或测序仪制造商提供的对照（例如 PhiX Control v3）。当指定为相应测序运行的对照通道时，该对照可用于生成测序前四个碱基的矩阵，以实现簇位置的准确识别。由此获得的高质量读段可使每个CpG位点的平均覆盖度提高5.2倍（n = 4）。此外，也可采用此前描述的“暗测序”（dark sequencing）方法来克服这一技术难题23。其他测序参数应遵循制造商标准操作程序。最后，数据分析中选择的每个CpG位点的覆盖度将由用户根据具体研究需求决定。10x覆盖度阈值可支持高覆盖度分析策略，但若研究需要，该阈值也可适当降低。

对ERRBS数据分析的全面讨论超出了本文的范围，但可以使用开源工具来确定差异甲基化的胞嘧啶和区域31,51-53。其他分析注意事项和方法已有详尽描述54,55，建议读者查阅相关文献，选择最适合计划中分析工作的工具。

与其他已发表的方法相比，ERRBS 提供了一个为期四天的实验流程，按照所述方法操作可获得高重复性。该方法已通过与金标准 MassARRAY EpiTYPER26 的对比验证，具有成本效益，适用于高覆盖度测序数据，并可根据不同起始材料量（有利于临床样本处理及低丰度细胞类型）和测序策略进行灵活调整。ERRBS 能在生物学相关位点提供单碱基分辨率，可用于与其他全基因组技术（如转录因子结合、染色质重塑、表观遗传标记及其他感兴趣的胞嘧啶修饰谱型分析）联合的整合分析。在这些研究中使用 ERRBS 数据有助于构建全面的分子研究策略，支持对生物模型和人类疾病的高维度分析。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢原始ERRBS报告的所有作者。感谢Mame Fall提供的技术协助。我们感谢威尔康奈尔医学院表观基因组学核心实验室提供的技术服务和帮助。本工作获得了Sass基金会Judah Folkman奖学金、NCI K08CA169055和ASH-AMFDP12005（授予FGB）、NIH R01HG006798和R01NS076465、Irma T. Hirschl和Monique Weill-Caulier慈善信托基金以及STARR联盟（I7-A765）（授予CEM）的资助，以及LLS SCORE基金（7006-13，授予AMM）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
MspINew England BiolabsR0106M100,000 单位/毫升
NEBuffer 2New England BiolabsB7002SMspI 酶的反应缓冲液；方案步骤 1.2
苯酚溶液Sigma-AldrichP4557用 10 mM Tris HCl（pH 8.0）平衡；参见 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557 上的安全与操作说明
氯仿Sigma-AldrichC2432参见 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432 上的安全与操作说明
糖原Sigma-AldrichG176719–22 毫克/毫升
NaOAcSigma-AldrichS78993 M，pH 5.2
乙醇Sigma-AldrichE7023200 证明，用于分子生物学
Buffer EBQiagen1908610 mM Tris-Cl，pH 8.5
三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）Sigma-AldrichT1503配制 1 M、pH 8.5 的溶液
Tris-乙二胺四乙酸（TE）Sigma-AldrichT9285按制造商推荐稀释为 1× 缓冲液
T4 DNA 连接酶反应缓冲液New England BiolabsB0202S10× 浓度
脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液混合物New England BiolabsN0447L每种核苷酸 10 mM
T4 DNA 聚合酶New England BiolabsM0203L3,000 单位/毫升
DNA 聚合酶 I 大片段（Klenow 片段）New England BiolabsM0210L5,000 单位/毫升
T4 多核苷酸激酶New England BiolabsM0201L10,000 单位/毫升
QIAquick PCR 纯化试剂盒Qiagen28104用于方案步骤 2.3 中的 DNA 产物纯化
2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸（dATP）PromegaU1201100 mM
Klenow 片段（3'→5' 外切酶缺陷型）New England BiolabsM0212L5,000 单位/毫升
MinElute PCR 纯化试剂盒Qiagen28004用于方案步骤 3.3 中的 DNA 产物纯化
T4 DNA 连接酶New England BiolabsM0202M2,000,000 单位/毫升
甲基化接头寡核苷酸试剂盒IlluminaME-100-0010
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881用于实施磁珠纯化步骤的方案部分（步骤 4.3 和 8.2）。使用前平衡至室温。
Pippin Prep 凝胶盒，2% 琼脂糖，无染料Sage ScienceCDF2010含内部标准品
认证低分子量超纯琼脂糖Bio-Rad161-3106
Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液Sigma-AldrichT4415
溴化乙锭溶液Sigma-AldrichE151010 毫克/毫升
50 bp DNA 标准分子量标记NEBN3236S
100 bp DNA 标准分子量标记NEBN3231S
凝胶上样染料，橙色（6×）NEBB7022S
手术刀 刀片 编号 11Fisher Scientific3120030
QIAquick 凝胶回收试剂盒Qiagen28704
EZ DNA 甲基化试剂盒Zymo ResearchD5001用于方案步骤 6.2
EZ DNA 甲基化-快速试剂盒Zymo ResearchD5030步骤 6.2 的替代方案
通用甲基化人 DNA 标准品Zymo ResearchD5011用作亚硫酸氢盐转化对照
FastStart 高保真 PCR 系统Roche03553426001
Qubit dsDNA 高灵敏度检测试剂盒Life TechnologiesQ32854基于荧光的 DNA 定量检测；用于方案步骤 1.1、9.1 和 10.1
DynaMag-2 磁力架Life Technologies12321D
高灵敏度 DNA 检测试剂盒Agilent Technologies5067-4626
2100 BioanalyzerAgilent Technologies
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
HiSeq 2500Illumina
Pippin PrepSage Science
Qubit 2.0 荧光计Life TechnologiesQ32872
TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HSIlluminaGD-401-3001
TruSeq SBS Kit v3-HSIlluminaFC-401-3002
TruSeq RNA 样品制备IlluminaRS-122-2001用于文库多重分析的条形码接头；多重分析方案见补充文件。
微量离心机
涡旋混合器
干式恒温金属浴
热循环仪
水浴锅
凝胶电泳系统
电泳电源
凝胶成像系统
紫外或蓝光透射仪

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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