直接诱导人外周血造血祖细胞生成神经干细胞

Tongguang Wang; Elliot Choi; Maria Chiara G. Monaco; Eugene O. Major; Marie Medynets; Avindra Nath

doi:10.3791/52298

方法文章

直接诱导人外周血造血祖细胞生成神经干细胞

DOI：

10.3791/52298

⸱

2015年1月28日

Tongguang Wang¹ , Elliot Choi¹ , Maria Chiara G. Monaco² , Eugene O. Major² , Marie Medynets¹ , Avindra Nath¹

¹Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, ²Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

本文内容

摘要

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已建立一种方法，可直接从外周血细胞中富集的造血祖细胞诱导生成人类神经干细胞。

摘要

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人类疾病特异性的神经元培养物对于生成体外用于人类神经系统疾病的研究模型。然而，难以获取原代人类成体神经细胞培养物带来了独特的挑战。近年来，诱导性多能干细胞（iPSC）技术的发展提供了一种替代方法，可通过患者特异性的iPSC从皮肤成纤维细胞中获得神经细胞培养物，但该过程耗时耗力，需要特殊的专业技术和大量资源，且通常需要数月时间。这限制了该技术在神经系统疾病研究中的广泛应用。为克服上述部分问题，我们开发了一种直接从人类成体外周血中获取神经干细胞的方法，从而绕过iPSC的诱导过程。该方法通过富集人类成体外周血中的造血祖细胞并进行培养体外并使用含有转录因子 Sox2、Oct3/4、Klf4 和 c-Myc 的仙台病毒载体进行转染。转染后细胞发生形态学改变，并通过添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和血管内皮生长因子（VEGF）的人类神经前体细胞培养基进一步筛选。所获得的细胞表达神经干细胞标志物，如 nestin 和 SOX2。这些神经干细胞可在特定的分化培养基中进一步分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。利用易于获取的人外周血样本，该方法可用于获取神经干细胞，进而分化为神经细胞以用于体外神经系统疾病的建模可能推动与这些疾病发病机制及治疗相关研究的进展。

引言

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体外神经元培养已被用作神经系统疾病研究的基本工具。在这些研究中，最常用的模型是原代动物（主要是啮齿类）神经细胞培养¹^,2以及来源于胶质瘤或其他肿瘤的人类神经细胞系。然而，人们已认识到啮齿类与人类细胞之间存在显著差异，许多基于啮齿类动物的研究发现无法在人类中重现。此外，随着大规模基因组信息分析技术的快速发展，以及基因编辑和全基因组测序技术的日益简便，研究趋势越来越倾向于发现易感疾病基因，并阐明其在特定疾病中的功能与作用，这使得目前有限的人类神经细胞系的应用更加受限。理论上，从患者神经系统组织直接获取的原代人类神经细胞培养是最佳选择，但这类样本难以获得，因此必须寻求替代方法。近年来，已有若干方法被探索，其中两种尤为突出。随着利用小鼠和人类体细胞生成诱导性多能干细胞（iPSC）技术的发展³^,4，可进一步将这些细胞分化为神经细胞^5-7。然而，iPSC的生成与鉴定过程耗时耗力，技术要求高，有时甚至难以实现。此后不久，另一种方法被开发出来，即直接将体细胞转化为神经元细胞⁸^,9。但由于所获得的神经元不具备增殖能力，限制了其在需要大量细胞的深入研究和药物筛选中的应用。为了结合上述两种技术的优势，多个研究团队已开始探索直接从体细胞诱导生成神经干细胞/前体细胞的方法^10-12，该方法避免了iPSC生成与鉴定的繁琐过程，同时仍能提供足够数量的神经干细胞用于后续的....

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方案

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1. 从成人全血中富集造血祖细胞

注意：造血祖细胞或 CD34+ 细胞可从多种来源获得的外周血单个核细胞（PBMC）中纯化，这些来源包括脐带血、白细胞分离物和全血，常用基于密度梯度离心的方法进行分离。此处列出的方法以全血为例。

从全血中分离外周血单个核细胞（PBMC）：
1. 通过插入件的中心孔，用移液器将 4.5 ml 淋巴细胞分离液加入 SepMate 管中。
2. 用等体积含 2% 人血清（v/v）的无菌 DPBS 稀释血液样本。例如，将 5 ml 样本与 5 ml DPBS + 2% 人血清混合稀释。
3. 沿管壁缓慢加入稀释后的样本，注意不要直接通过中心孔倾倒。
4. 在室温下以 1,200 × g 离心 10 分钟。
5. 小心移除 PBMC 层上方的上清液。
6. 将 PBMC 层（浑浊层）收集至新管中。
7. 向管中加入 15 ml 含 2% 人血清的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），在室温下以 150 × g 离心 10 分钟，关闭刹车。
8. 弃去上清液，将沉淀重悬于 15 ml 含 2% 人血清的 DPBS 中，并计数细胞数量。
9. 在室温下以 690 × g 离心 10 分钟，完全移除管中所有上清液。
10. 将细胞重悬于 15 ml 含 1% 抗生素（v/v）和 10% ....

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结果

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CD34细胞的质量对于神经干细胞转导的成功至关重要。高质量的CD34细胞在培养的最初几天内会增殖，表现为非贴壁、形态均一的圆形细胞，悬浮于培养容器底部上方（图1A）。成功感染后会形成细胞团簇，并随时间逐渐扩大（图1B），而在细胞培养过程中也可能出现非特异性的细胞团簇，其体积虽可增大，但细胞间的连接较为松散。贴壁细胞通常在转染后约三至五天出现，多呈双极形态，并进一步增殖形成单层细胞（图1C）。经神经前体细胞培养基筛选后，大部分贴壁细胞表达nestin和SOX2，但不表达OCT4（图2）。诱导获得的神经干细胞可进一步分化为神经元和胶质细胞（图3）。

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讨论

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提供了一种从外周造血祖细胞直接生成神经干细胞的详细方案。

与成纤维细胞相比，人外周血更容易获取。采用本方案，可从10 ml全血中富集出超过1 × 10⁵个造血祖细胞，即CD34阳性细胞。尽管通常难以完全避免血小板污染，但通过较低速度的离心可有效减少污染，且该污染不会影响神经干细胞的生成。然而，CD34细胞的质量和数量将决定最终神经干细胞的产量。CD34细胞的质量可通过其对CD34培养基的反应进行粗略判断。良好的反应，即CD34细胞在培养基中快速增殖，是后续成功转化的关键。若CD34细胞未能增殖，甚至出现显著的细胞丢失，则转化将变得困难，并导致所得细胞增殖能力下降。因此，建议仅使用高质量的CD34细胞启动转化实验。尽管对于经验丰富的研究人员而言，1 × 10⁵个CD34细胞已足够，但初学者可使用3 × 10⁵个细胞。

使用仙台病毒可提供一种非整合、高效且便捷的方法，将转录因子导入靶细胞¹⁴^,15。最初用于诱导多能干细胞（.......

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披露

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）院内基金资助。

致谢

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作者无任何利益冲突需要披露。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
淋巴细胞分离介质	Lonza	17-829E	1x
SepMate	Stemcell Technologies	15415	15 ml
人血清	Invitrogen	34005-100
抗生素	Gibco	15240-062	1%
CD34 MultiSort 试剂盒	Miltenyi Biotec	130-056-701
EDTA	Cellgro	46-034-Cl	2 mM
MACS LS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
StemSpan SFEM 培养基	Stemcell Technologies	9650	1x
IMDM	Quality Biologicals	112-035-101	1x
TPO	Peprotech	300-18	100 ng/ml
Flt-3	Peprotech	300-19	100 ng/ml
SCF	Peprotech	300-07	100 ng/ml
IL-6	Peprotech	200-06	20 ng/ml
IL-7	Peprotech	200-07	20 ng/ml
IPS Sendai 重编程试剂盒	Life Technologies	A1378001
细胞刮刀	Sarstedt	83.183
DMSO	Sigma	D2650
CryoTube 冻存管	Thermo	368632
Mr. Frosty 冻存盒	Thermo	5100-0001
DMEM/F12	Life Technologies	12400-024	1x
N2 添加剂	Life Technologies	17502-048	1x
牛血清白蛋白	Sigma	A2934	0.1% (w/v)
bFGF	Peprotech	100-18B	20 ng/ml
EGF	Peprotech	AF-100-15
B27 添加剂	Life Technologies	17504-044	1x
NSC 无血清培养基	Life Technologies	A1050901	1x
聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的盖玻片	BD Biosciences	354087
cAMP	Sigma	A9501	300 ng/ml
维生素 C	Sigma	A0278	0.2 mM
BDNF	Peprotech	450-02	10 ng/ml
GDNF	Peprotech	450-10	10 ng/ml
聚-L-鸟氨酸	Sigma	P4957	1x
PDGF-AA	Peprotech	100-13A	10 ng/ml
NT-3	Peprotech	450-03	2 ng/ml
Shh	Peprotech	1314-SH/CF	2 ng/ml
T3	Sigma	T6397	3 nM
多聚甲醛（PFA）	Sigma	P6148	4%
PBS	Quality Biological	119-069-101	1x
山羊血清	Sigma	G9023	4%
吐温 X-100（TritonX-100）	Sigma	T9284
小鼠单克隆抗 Nestin 抗体	Millipore	AB5922	1:1,000 稀释
抗 SOX2 抗体	Applied Stemcell	ASA0120	即用型
小鼠抗-βIII-微管蛋白抗体	Promega	G712A	1:1,000 稀释
兔抗 GFAP 抗体	Sigma	G4546	1:100 稀释
抗 O4 抗体	R&D Systems	MAB1326	IgM；1 ng/ml
Alexa Fluor 594 山羊抗兔抗体	Life Technologies	A11012	1:400 稀释
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠抗体	Life Technologies	A11001	1:400 稀释
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgM 抗体	Life Technologies	A21042	1:250 稀释
DAPI	Sigma	D9542	1 μg/ml

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941(2011).
Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neurob....

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