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方法文章

直接诱导人外周血造血祖细胞生成神经干细胞

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DOI：

10.3791/52298

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2015年1月28日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

本文内容

摘要

已建立一种方法，可直接从外周血细胞中富集的造血祖细胞诱导生成人类神经干细胞。

摘要

人类疾病特异性的神经元培养物对于生成 体外 用于人类神经系统疾病的研究模型。然而，难以获取原代人类成体神经细胞培养物带来了独特的挑战。近年来，诱导性多能干细胞（iPSC）技术的发展提供了一种替代方法，可通过患者特异性的iPSC从皮肤成纤维细胞中获得神经细胞培养物，但该过程耗时耗力，需要特殊的专业技术和大量资源，且通常需要数月时间。这限制了该技术在神经系统疾病研究中的广泛应用。为克服上述部分问题，我们开发了一种直接从人类成体外周血中获取神经干细胞的方法，从而绕过iPSC的诱导过程。该方法通过富集人类成体外周血中的造血祖细胞并进行培养 体外 并使用含有转录因子 Sox2、Oct3/4、Klf4 和 c-Myc 的仙台病毒载体进行转染。转染后细胞发生形态学改变，并通过添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和血管内皮生长因子（VEGF）的人类神经前体细胞培养基进一步筛选。所获得的细胞表达神经干细胞标志物，如 nestin 和 SOX2。这些神经干细胞可在特定的分化培养基中进一步分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。利用易于获取的人外周血样本，该方法可用于获取神经干细胞，进而分化为神经细胞以用于 体外 神经系统疾病的建模可能推动与这些疾病发病机制及治疗相关研究的进展。

引言

体外神经元培养已被用作神经系统疾病研究的基本工具。在这些研究中，最常用的模型是原代动物（主要是啮齿类）神经细胞培养1,2以及来源于胶质瘤或其他肿瘤的人类神经细胞系。然而，人们已认识到啮齿类与人类细胞之间存在显著差异，许多基于啮齿类动物的研究发现无法在人类中重现。此外，随着大规模基因组信息分析技术的快速发展，以及基因编辑和全基因组测序技术的日益简便，研究趋势越来越倾向于发现易感疾病基因，并阐明其在特定疾病中的功能与作用，这使得目前有限的人类神经细胞系的应用更加受限。理论上，从患者神经系统组织直接获取的原代人类神经细胞培养是最佳选择，但这类样本难以获得，因此必须寻求替代方法。近年来，已有若干方法被探索，其中两种尤为突出。随着利用小鼠和人类体细胞生成诱导性多能干细胞（iPSC）技术的发展3,4，可进一步将这些细胞分化为神经细胞5-7。然而，iPSC的生成与鉴定过程耗时耗力，技术要求高，有时甚至难以实现。此后不久，另一种方法被开发出来，即直接将体细胞转化为神经元细胞8,9。但由于所获得的神经元不具备增殖能力，限制了其在需要大量细胞的深入研究和药物筛选中的应用。为了结合上述两种技术的优势，多个研究团队已开始探索直接从体细胞诱导生成神经干细胞/前体细胞的方法10-12，该方法避免了iPSC生成与鉴定的繁琐过程，同时仍能提供足够数量的神经干细胞用于后续的神经分化。我们此前已证明，在将Yamanaka转录因子导入造血祖细胞后，可通过神经前体细胞筛选培养基直接生成神经干细胞13。本文中，我们将详细报告该方法。

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方案

1. 从成人全血中富集造血祖细胞

注意：造血祖细胞或 CD34+ 细胞可从多种来源获得的外周血单个核细胞（PBMC）中纯化，这些来源包括脐带血、白细胞分离物和全血，常用基于密度梯度离心的方法进行分离。此处列出的方法以全血为例。

  1. 从全血中分离外周血单个核细胞（PBMC）：
    1. 通过插入件的中心孔，用移液器将 4.5 ml 淋巴细胞分离液加入 SepMate 管中。
    2. 用等体积含 2% 人血清（v/v）的无菌 DPBS 稀释血液样本。例如，将 5 ml 样本与 5 ml DPBS + 2% 人血清混合稀释。
    3. 沿管壁缓慢加入稀释后的样本，注意不要直接通过中心孔倾倒。
    4. 在室温下以 1,200 × g 离心 10 分钟。
    5. 小心移除 PBMC 层上方的上清液。
    6. 将 PBMC 层（浑浊层）收集至新管中。
    7. 向管中加入 15 ml 含 2% 人血清的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），在室温下以 150 × g 离心 10 分钟，关闭刹车。
    8. 弃去上清液，将沉淀重悬于 15 ml 含 2% 人血清的 DPBS 中，并计数细胞数量。
    9. 在室温下以 690 × g 离心 10 分钟，完全移除管中所有上清液。
    10. 将细胞重悬于 15 ml 含 1% 抗生素（v/v）和 10% 人血清（v/v）的 Iscove 改良杜氏培养基（IMDM）中，使细胞密度为 1 × 107 个细胞/ml。
    11. 在 37 °C、5% CO2 培养箱中过夜孵育，随后进行 CD34+ 细胞的分离。
  2. 使用 CD34 MultiSort 试剂盒从 PBMC 中进行 CD34+ 细胞的阳性筛选：
    注意：操作应迅速，并使用预冷溶液使细胞保持低温，以防止抗体在细胞表面发生帽化及非特异性标记，具体操作请参照试剂盒说明书。
    1. 将所有 PBMC 收集至 50 ml 管中，并计数培养基中的总细胞数。
    2. 以 300 × g 离心 10 分钟，彻底移除所有上清液。
    3. 每 300 µl 磁珠缓冲液（含 0.5% 人血清（v/v）和 2 mM EDTA 的 DPBS）中重悬最多 108 个细胞。
    4. 加入 100 µl FcR 阻断试剂和 100 µl CD34 MultiSort MicroBeads。
    5. 充分混匀，在冰箱中（2 - 8 °C）孵育 30 分钟。
    6. 每 108 个细胞加入 2 ml 磁珠缓冲液洗涤细胞，在室温下以 300 × g 离心 10 分钟，彻底移除上清液。
    7. 每 500 µl 缓冲液中重悬最多 108 个细胞。
    8. 将 MACS LS 柱置于 MACS 分离器的磁场中，用 3 ml 磁珠缓冲液冲洗柱子进行预处理。
    9. 将细胞悬液加至柱子中央。未标记的细胞将流过，可根据需要收集。
    10. 用 3 ml 磁珠缓冲液洗涤柱子三次。
    11. 将柱子从分离器上取下，放置于 15 ml 管上。
    12. 向柱子中加入 5 ml 磁珠缓冲液，并立即通过推动柱芯将磁性标记的细胞冲洗出来。
    13. 每 1 ml 细胞悬液中加入 20 µl MultiSort 释放试剂，充分混匀，在冰箱中（2 - 8 °C）孵育 10 分钟。
    14. 每 107 个细胞加入 1 - 2 ml 磁珠缓冲液，在室温下以 300 × g 离心 10 分钟，彻底移除上清液。
    15. 每 107 个细胞用 50 µl 磁珠缓冲液重悬细胞。
    16. 每 107 个细胞加入 30 µl MultiSort 终止试剂，在冰箱中孵育 15 分钟。
    17. 加入 5 ml 磁珠缓冲液，在室温下以 300 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。

2. 从 CD34+ 细胞诱导神经干细胞的衍生

  1. CD34+ 细胞培养：
    注意：新鲜配制的培养基在冰箱中储存时应在 7 天内使用。细胞在 24 小时后可能会出现明显的 CD34+ 细胞数量减少，但细胞应开始显著增殖，尤其是在第 5 天之后。如果细胞数量持续下降或无增殖现象，则提示培养基或 CD34+ 细胞质量不佳，不应用于下一步实验。
    1. 将 CD34+ 细胞重悬并接种于 CD34+ 维持培养基（StemSpan SFEM 培养基，含人血小板生成素（TPO，100 ng/ml）、fms 样酪氨酸激酶 3（Flt-3）配体（100 ng/ml）、干细胞因子（SCF，100 ng/ml）、白细胞介素-6（IL-6，20 ng/ml）和白细胞介素-7（IL-7，20 ng/ml））中，置于 24 孔板（每孔最多 3 × 105 个细胞，每孔 1 ml 培养基），在 37 °C、5% CO2 培养箱中培养。
    2. 24 小时后，收集悬浮细胞，于室温下以 110 × g 离心，去除贴壁细胞和细胞碎片。弃去上清液，将细胞重悬于 1 ml 新鲜 CD34+ 维持培养基中，接种至新的 24 孔板（每孔最多 1 × 105 个细胞），在 37 °C、5% CO2 培养箱中继续培养 5 天。
    3. 每隔一天更换一半培养基，小心吸走上清液的上半部分，而 CD34+ 细胞仍悬浮于孔底（图 1A）。
  2. 仙台病毒转染：
    1. 第 5 天，收集 CD34+ 细胞，于室温下以 170 × g 离心 10 分钟。弃去上清液。
    2. 将细胞重悬于新鲜培养基中，以每孔 1 × 105 个细胞的密度接种于 24 孔板（每孔 1 ml 培养基）。
    3. 解冻仙台病毒重编程试剂盒（Cytotune-iPS Sendai），先将管底浸入 37 °C 水浴中 10 秒，随后在室温下完全解冻。短暂离心后置于冰上。根据相应批次的分析证书（COA）中推荐的每种病毒体积配制仙台病毒混合液。建议 MOI 为 15。
    4. 将仙台病毒混合液加入各孔 CD34+ 细胞中，轻轻摇动混匀。将细胞置于 37 °C、5% CO2 培养箱中培养。
    5. 24 小时后观察转染效率。注意，细胞聚集体和球状结构的形成是转染成功的标志（图 1B）。
    6. 通过小心转移上清液的上半部分至另一新孔来更换一半培养基。若新孔中存在细胞球，需加入等量新鲜培养基。
    7. 每隔一天更换培养基，重复步骤 2.2.6。
  3. 神经干细胞诱导：
    注意：根据细胞状态，转染后约 5 至 7 天，单层贴壁细胞将达到 30–50% 汇合度（图 1C）。
    1. 移除含有悬浮细胞和细胞球的上清液，向贴壁细胞中加入 1 ml 神经前体细胞培养基（DMEM/F12 培养基，含 1× N2 添加剂、0.1%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）、1%（v/v）抗生素、20 ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和 20 ng/ml 表皮生长因子（EGF））。
    2. 可选步骤：通过轻柔吹打使细胞球解离，于 170 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 1 ml 神经前体细胞培养基中，接种至预先按说明包被 Matrigel 的新 24 孔板中作为备份。
    3. 每隔一天更换一次培养基，直至细胞达到 60–80% 汇合度，通常需 1 周左右。
    4. 弃去上清液，加入 1 ml 神经干细胞培养基（无血清培养基，NSC SFM）。使用细胞刮刀刮下细胞，随后轻柔吹打使其解离。
    5. 收集细胞，将全部细胞接种至 6 孔板中的一个孔内。再加入 1 ml 神经干细胞培养基，使每孔总体积为 2 ml。将细胞置于 37 °C、5% CO2 培养箱中培养。
    6. 每隔一天更换一次培养基。
    7. 当细胞达到 60% 汇合度时，按照步骤 2.3.4 和 2.3.6 的方法进行解离，并以 1:3 的比例传代。
  4. 神经干细胞冻存：
    1. 通过向神经干细胞培养基中加入 20% 二甲基亚砜（DMSO）配制神经干细胞冻存液。将冻存液置于冰上保存。
    2. 使用细胞刮刀刮下 6 孔板中的细胞，随后轻柔吹打使其解离。计数细胞。于室温下以 170 × g 离心 10 分钟。弃去上清液。
    3. 将细胞重悬于神经干细胞培养基中，浓度为 1 × 106/ml。向细胞悬液中加入等体积的冻存液。
    4. 将 1 ml 细胞悬液（共 5 × 105 个细胞）加入冻存管中。使用 Mr. Frosty 冻存盒，按照说明书操作进行细胞冻存。

3. 神经细胞分化

  1. 神经元细胞分化：
    1. 当神经干细胞达到80%融合度时，使用细胞刮轻轻刮下神经干细胞，并通过轻柔吹打进行解离。
    2. 计数细胞，并用神经干细胞培养基将细胞浓度调整至1 × 105/ml。
    3. 进行神经元分化时，将细胞以每孔1 × 105个的密度接种于24孔板中预先包被多聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白的盖玻片上。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。
    4. 24小时后，更换为神经分化培养基（DMEM/F12培养基，含1× N2添加剂、1× B27添加剂、300 ng/ml cAMP、0.2 mM 维生素C、10 ng/ml 脑源性神经营养因子（BDNF）和10 ng/ml 胶质细胞源性神经营养因子（GDNF））。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中继续孵育。
    5. 每周更换两次神经分化培养基，持续2周。
  2. 星形胶质细胞分化：
    1. 通过吹打法解离神经干细胞。
    2. 计数细胞，并将细胞浓度调整至5 × 104 个/ml，接种于24孔板中。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。
    3. 更换为含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基，并将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中继续孵育。
    4. 每周更换两次培养基，持续2周。若细胞在2周内达到融合状态，则按照步骤3.2.1和3.2.2重新传代细胞。
  3. 少突胶质细胞分化：
    1. 通过吹打法解离神经干细胞。
    2. 计数细胞，并将1 × 105个细胞接种于预先包被多聚-L-鸟氨酸的24孔板中，每孔加入1 ml少突胶质细胞分化培养基，该培养基由DMEM/F12基础培养基组成，包含N2添加剂、10 ng/ml血小板源性生长因子-AA（PDGF-AA）、2 ng/ml神经营养因子-3（NT-3）、2 ng/ml音猬因子（Shh）和3 nM三碘甲腺原氨酸（T3）。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。
    3. 每周更换两次培养基，持续2周。
    4. 更换为含1× N2添加剂和3 nM T3的DMEM/F12培养基，继续培养1周以促进髓鞘碱性蛋白（MBP）的生成。

4. 免疫荧光染色

  1. 用4%多聚甲醛（PFA）替换培养基，在室温下孵育10分钟。
  2. 弃去PFA，用含0.1% Triton X-100的PBS（PBS-T）洗涤3次，每次5分钟。
  3. 用含0.5% Triton X-100的PBS在室温下对细胞进行透化处理，持续10分钟。
  4. 用含4%山羊血清的PBS-T在室温下封闭细胞20分钟。
  5. 将细胞与相应的一抗在含0.1% BSA的PBS-T中稀释后孵育，室温下2小时或4°C过夜。
  6. 用PBS-T洗涤细胞3次，每次5分钟。然后将细胞与相应荧光染料标记的二抗按1:400比例稀释于含0.1% BSA的PBS-T中，在摇床上避光孵育1小时。
  7. 用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的PBS-T在室温下洗涤细胞10分钟。
  8. 再用PBS-T在室温下洗涤细胞两次，每次5分钟。
  9. 使用显微镜观察标记的细胞并拍照（图3）。

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结果

CD34细胞的质量对于神经干细胞转导的成功至关重要。高质量的CD34细胞在培养的最初几天内会增殖，表现为非贴壁、形态均一的圆形细胞，悬浮于培养容器底部上方（图1A）。成功感染后会形成细胞团簇，并随时间逐渐扩大（图1B），而在细胞培养过程中也可能出现非特异性的细胞团簇，其体积会增大但结构松散。贴壁细胞通常在转染后约三到五天出现，多呈双极形态，并进一步增殖形成单层细胞（图1C）。经过神经前体细胞培养基筛选后，大部分贴壁细胞表达nestin和SOX2，但不表达OCT4（图2）。诱导获得的神经干细胞可进一步分化为神经元和胶质细胞（图3）。

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讨论

提供了一种从外周造血祖细胞直接生成神经干细胞的详细方案。

与成纤维细胞相比，人外周血更容易获取。采用本方案，可从10 ml全血中富集出超过1 × 105个造血祖细胞，即CD34阳性细胞。尽管通常难以完全避免血小板污染，但通过较低速度的离心可有效减少污染，且该污染不会影响神经干细胞的生成。然而，CD34细胞的质量和数量将决定最终神经干细胞的产量。CD34细胞的质量可通过其对CD34培养基的反应进行粗略判断。良好的反应，即CD34细胞在培养基中快速增殖，是后续成功转化的关键。若CD34细胞未能增殖，甚至出现显著的细胞丢失，则转化将变得困难，并导致所得细胞增殖能力下降。因此，建议仅使用高质量的CD34细胞启动转化实验。尽管对于经验丰富的研究人员而言，1 × 105个CD34细胞已足够，但初学者可使用3 × 105个细胞。

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披露

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）院内基金资助。

致谢

作者无任何利益冲突需要披露。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
淋巴细胞分离介质Lonza17-829E1x
SepMateStemcell Technologies1541515 ml
人血清Invitrogen34005-100
抗生素Gibco15240-0621%
CD34 MultiSort 试剂盒Miltenyi Biotec130-056-701
EDTACellgro46-034-Cl2 mM
MACS LS 柱Miltenyi Biotec130-042-401
StemSpan SFEM 培养基Stemcell Technologies96501x
IMDMQuality Biologicals112-035-1011x
TPOPeprotech300-18100 ng/ml
Flt-3Peprotech300-19100 ng/ml
SCFPeprotech300-07100 ng/ml
IL-6Peprotech200-0620 ng/ml
IL-7Peprotech200-0720 ng/ml
IPS Sendai 重编程试剂盒Life TechnologiesA1378001
细胞刮刀Sarstedt83.183
DMSOSigmaD2650
CryoTube 冻存管Thermo368632
Mr. Frosty 冻存盒Thermo5100-0001
DMEM/F12Life Technologies12400-0241x
N2 添加剂Life Technologies17502-0481x
牛血清白蛋白SigmaA29340.1% (w/v)
bFGFPeprotech100-18B20 ng/ml
EGFPeprotechAF-100-15
B27 添加剂Life Technologies17504-0441x
NSC 无血清培养基Life TechnologiesA10509011x
聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的盖玻片BD Biosciences354087
cAMPSigmaA9501300 ng/ml
维生素 CSigmaA02780.2 mM
BDNFPeprotech450-0210 ng/ml
GDNFPeprotech450-1010 ng/ml
聚-L-鸟氨酸SigmaP49571x
PDGF-AAPeprotech100-13A10 ng/ml
NT-3Peprotech450-032 ng/ml
ShhPeprotech1314-SH/CF2 ng/ml
T3SigmaT63973 nM
多聚甲醛（PFA）SigmaP61484%
PBSQuality Biological119-069-1011x
山羊血清SigmaG90234%
吐温 X-100（TritonX-100）SigmaT9284
小鼠单克隆抗 Nestin 抗体MilliporeAB59221:1,000 稀释
抗 SOX2 抗体Applied StemcellASA0120即用型
小鼠抗-βIII-微管蛋白抗体PromegaG712A1:1,000 稀释
兔抗 GFAP 抗体SigmaG45461:100 稀释
抗 O4 抗体R&D SystemsMAB1326IgM；1 ng/ml
Alexa Fluor 594 山羊抗兔抗体Life TechnologiesA110121:400 稀释
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠抗体Life TechnologiesA110011:400 稀释
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgM 抗体Life TechnologiesA210421:250 稀释
DAPISigmaD95421 μg/ml

参考文献

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