利用生物正交逆电子需求狄尔斯-阿尔德环加成反应实现预靶向PET成像

摘要

生物正交的逆电子需求Diels-Alder环加成反应已被用于开发一种高效且模块化的预靶向PET成像策略，用于癌症检测。本方案以靶向结直肠癌的抗体huA33和一种⁶⁴Cu标记的放射性配体构成的模型系统为例，详细描述了该方法的各个步骤。

摘要

由于抗体具有极高的亲和力和特异性，它们已成为将放射性同位素递送至癌细胞用于正电子发射断层成像（PET）的极具前景的载体。然而，抗体标记长物理半衰期放射性核素的需求通常会导致非靶组织受到较高的本底辐射剂量。为克服这一问题，我们采用了一种基于逆电子需求狄尔斯-阿尔德环加成反应的预靶向PET成像策略。该方法将抗体与放射性分离，从而在利用抗体优良特性的同时，规避其药代动力学上的缺点。该系统包含四个步骤：（1）注射单克隆抗体-反式-环辛烯（TCO）偶联物；（2）一段定位时间，使抗体在肿瘤中富集并从血液中清除；（3）注射放射性标记的四嗪；（4）组分在体内发生点击连接反应，随后过量的放射性配体被清除。在本研究展示的实例中，使用⁶⁴Cu-NOTA标记的四嗪放射性配体与反式-环辛烯偶联的人源化抗体（huA33），成功实现了对SW1222结肠直肠癌肿瘤的高肿瘤-本底对比度成像。此外，该预靶向方法仅产生由直接标记⁶⁴Cu或⁸⁹Zr的放射免疫偶联物所造成非靶组织辐射剂量的一小部分，即可获得高质量图像。最终，该方案的模块化特性是其最大优势之一，因为反式-环辛烯基团可连接至任何非内化抗体，而四嗪则可与多种放射性同位素偶联。

引言

在过去的三十年中，正电子发射断层扫描（PET）已成为癌症诊断和治疗管理中不可或缺的临床工具。由于抗体对肿瘤生物标志物具有极高的亲和力和特异性，长期以来被视为将正电子发射放射性同位素递送至肿瘤的有前景载体。^1,2 然而，相对缓慢的 体内 抗体的药代动力学要求使用物理半衰期为数天的放射性同位素。这种组合可能导致患者非靶器官接受较高的辐射剂量，这是一个重要的并发症，具有特别的临床意义，因为放射免疫结合物是通过静脉注射给药的，因此与局部CT扫描不同，其会在全身各个部位产生吸收剂量，而不限于被检测的组织。

为了解决这一问题，研究人员已投入大量努力开发正电子发射断层扫描（PET）成像策略，以将放射性同位素与靶向部分分离，从而在利用抗体优越特性的同时，规避其固有的药代动力学局限性。这些策略——通常称为 预靶向 或 多步靶向 — 通常包括四个步骤：（1）给予一种能够同时结合抗原和放射性配体的抗体；（2）抗体在靶组织中蓄积并从血液中清除；（3）给予小分子放射性配体；以及（4） 体内 放射性配体与抗体的连接，随后快速清除过量的放射性配体。^3-8 在某些情况下，可在步骤2与步骤3之间注射额外的清除剂，以加速尚未与肿瘤结合而仍存在于血液中的抗体的排泄。⁵

总体而言，文献中最为常见的预靶向策略主要有两种。尽管这两种策略在临床前模型中均已证明有效，但它们也存在一些关键性局限，阻碍了其在临床上的应用。第一种策略依赖于链霉亲和素偶联抗体与生物素修饰的放射性标记物之间的高亲和力；然而，链霉亲和素修饰抗体的免疫原性已被证实是其临床转化过程中令人担忧的问题^5,6,9,10。相比之下，第二种策略采用经基因工程改造的双特异性抗体，可同时结合肿瘤生物标志物抗原和小分子放射性标记半抗原^3,11-14。尽管这一策略具有一定的创新性，但其广泛应用受到系统复杂性高、成本昂贵以及缺乏模块化等限制。

最近，我们开发并发表了一种基于反式-环辛烯（TCO）与四嗪（Tz）之间逆电子需求狄尔斯-阿尔德（IEDDA）环加成反应的预靶向PET成像方法（图1）¹¹。尽管该反应本身已被知晓数十年，但近年来IEDDA化学作为点击化学生物偶联技术迎来了复兴，Ralph Weissleder、Joseph Fox和Peter Conti等课题组的杰出工作充分体现了这一点^12-15。IEDDA环加成已被应用于多种场景，包括使用多肽、抗体和纳米颗粒进行荧光成像，以及使用放射性卤素和放射性金属进行核成像^16-26。该连接反应产率高、副产物少、反应迅速（k₁ > 30,000 M^-1sec^-1）、具有选择性，且关键的是具备生物正交性²⁷。尽管多种点击化学反应——包括铜催化的叠氮-炔烃环加成、张力促进的叠氮-炔烃环加成以及施陶丁格连接——也具有生物正交性，但正是快速反应动力学与生物正交性的独特结合，使IEDDA化学特别适用于整体生物体中的预靶向应用^28,29。需要指出的是，我们实验室近期的报道并非首次将IEDDA化学应用于预靶向：首个采用IEDDA进行预靶向成像的报道来自Rossin 等的研究，该研究提出了一种SPECT成像方法，使用了¹¹¹In标记的四嗪³⁰。

如上所述，预靶向方法包含四个相对简单的步骤（图2）。在本方案中，将描述一种利用⁶⁴Cu-NOTA标记的四嗪放射性配体和TCO修饰的huA33抗体偶联物进行结直肠癌PET成像的预靶向策略。然而，该方法最终的模块化特性是其最重要的优势之一，因为反式-环辛烯基团可连接至任何非内化的抗体，而四嗪则可与多种不同的放射性报告分子相连。

方案

伦理声明：所有所述的体内动物实验均根据纪念斯隆-凯特琳癌症中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的方案及伦理准则进行。

1. Tz-Bn-NOTA 的合成

1. 在小型反应容器中，溶解7 mg NH₂-Bn-NOTA (1.25 x 10^-2 mmol) 溶于 600 µl NaHCO₃₃ 缓冲液（0.1 M，pH 8.1）。检测溶液的pH值。如有需要，用少量0.1 M NaOH或0.1 M HCl调节溶液pH至8.1₂CO₃.
2. 加入 NH₂-Bn-NOTA 溶液加入至 0.5 mg Tz-NHS（1.25 × 10^-3 mmol) 置于 1.7 ml 微量离心管中。
   注意： Tz-NHS 可以直接称取干粉使用，或从干的 DMF 或 DMSO 储存液中添加< 50 µl
3. 将所得反应溶液在室温下轻轻振荡反应30分钟。
4. 30 分钟后，使用反相 C₁₈ 高效液相色谱法去除未反应的NH₂-Bn-NOTA。NH₂-Bn-NOTA 可在 254 nm 波长下监测，而 Tz-NHS 和 Tz-Bn-NOTA 在 525 nm 波长下监测效果最佳。
   注意： 保留时间明显高度依赖于各实验室的高效液相色谱（HPLC）设备配置（泵、色谱柱、管路、 等等。）。然而，为举例说明，若采用 0:100 乙腈/水梯度₂O（均含0.1% TFA）至100:0乙腈/水₂O过25分钟，采用分析型4.6 x 250 mm C₁₈ 使用色谱柱时，Tz-Bn-NOTA、Tz-NHS 和 NH 的保留时间₂-Bn-NOTA 的保留时间分别为约 15 分钟、16.5 分钟和 10 分钟。可使用半制备型或制备型 C 柱通过单次或多次运行，将产物从其他反应组分中纯化出来。₁₈ HPLC色谱柱 ¹H-NMR、分析型HPLC和ESI-MS均为可用于验证完成的Tz-Bn-NOTA前体纯度的方法。¹¹
5. 使用液氮冷冻收集的HPLC洗脱液。
6. 用不透明的铝箔包裹冷冻收集管。
7. 将冻存的收集管放入冻干装置中过夜，以去除高效液相色谱流动相。
8. 将纯化后的产品（亮粉色固体）避光保存于 -80 °C。
   注意： 此步骤可作为程序的合理暂停点。在此条件下，完成的Tz-Bn-NOTA前体至少可稳定保存1年。

2. 人源A33-TCO免疫偶联物的制备

1. 在1.7 ml微量离心管中，用无水DMF配制1 mg/ml（2.7 mM）的TCO-NHS溶液。
2. 在1.7 ml微量离心管中，用1 ml磷酸盐缓冲生理盐水（pH 7.4，0.01 M PO₄^3-_， 0.154 M NaCl）配制2 mg/ml（13.3 µM）的huA33溶液。
3. 使用少量（< 5 µl）0.1 M Na₂CO₃溶液，将抗体溶液的pH调节至8.8–9.0。使用pH试纸或配备微电极的pH计监测pH值，并注意避免pH超过9.0。
4. 当抗体溶液达到正确pH值后，加入相当于8摩尔当量活化酯的TCO-NHS溶液。例如，向1 ml浓度为2 mg/ml的huA33抗体溶液（1.33 × 10^-8 mol huA33）中加入7.9 µl浓度为1 mg/ml的TCO-NHS溶液（1.07 × 10^-7 mol TCO-NHS）。溶液中DMF的体积分数不得超过5%。
5. 通过反复倒置微量离心管，轻柔混匀溶液。
6. 用不透光的铝箔包裹微量离心管。
7. 将溶液在室温下避光孵育1小时，并保持轻微振荡。
8. 室温孵育1小时后，使用预装的一次性尺寸排阻脱盐柱纯化所得免疫偶联物。首先，按照供应商说明冲洗尺寸排阻柱，以去除储存过程中可能存在的防腐剂。然后，将反应混合物加至尺寸排阻柱中，用1.5 ml 0.9%无菌生理盐水冲洗柱子，随后用2 ml 0.9%无菌生理盐水作为洗脱液收集产物。
   注：此步骤将获得完成的huA33-TCO，总体积为2 ml。
9. 使用紫外-可见分光光度计测定所得huA33-TCO的浓度。
10. 如需更高浓度，可使用截留分子量为50,000的离心过滤装置浓缩huA33-TCO溶液。
    注：需注意，尽管huA33以及多种其他已知抗体（e.g., 贝伐珠单抗、曲妥珠单抗、西妥昔单抗和J591）在浓缩过程中耐受性良好，但在其他情况下浓缩可能导致聚集或沉淀。研究人员在使用新型抗体进行此操作时，应依据文献报道或自身对该抗体特性的了解，判断是否适合进行浓缩。
11. 将完成的huA33-TCO免疫偶联物避光保存于4 °C。
    注：本步骤可作为实验流程的合理暂停点。在此储存条件下，完成的mAb-TCO偶联物至少可稳定保存3个月。

3. ⁶⁴Cu 对 Tz-Bn-NOTA 的放射性标记

注意：本实验方案的此步骤涉及放射性物质的操作与处理。在执行这些步骤之前——或进行任何其他涉及放射性的工作之前——研究人员应咨询所在机构的辐射安全部门。应采取一切可能措施，以尽量减少电离辐射的暴露。

1. 在1.7 ml 微量离心管中，配制0.5 mg/ml（723 µM）的Tz-Bn-NOTA溶液。
2. 在1.7 ml 微量离心管中，将10 µl Tz-Bn-NOTA 溶液（5 µg）加入400 µl 0.2 M NH₄OAc pH 5.5 缓冲液_.
3. 为确保放射性化学记录准确，应在执行以下方案步骤（3.4–3.8）前后，使用活度计测量并记录样品中放射性活度。这将有助于准确测定放射性化学产率。
4. 加入 2,000 µCi (74 MBq) 的 ⁶⁴将 Cu 加入 Tz-Bn-NOTA 溶液中。
   注意：通常，[⁶⁴Cu]CuCl₂ 以小体积提供（< 30 µl) 的 0.1 N HCl，因此仅需少量体积（< 此贮备液的放射性标记反应需要10 µl。如果需要更大体积的[⁶⁴Cu]CuCl₂ 若需要制备更多批次，放射性标记反应可耐受总体反应体积的增加。然而，应密切监测放射性标记反应溶液的pH值，确保其不低于pH 4.0。
5. 室温下轻柔振荡孵育10分钟。
6. 孵育10分钟后，使用反相C₁₈ 高效液相色谱。保留时间明显高度依赖于各实验室的高效液相色谱设备配置（泵、色谱柱、管路、 等等。）。然而，为举例说明，若采用5:95的乙腈/水梯度₂O（均含0.1% TFA）至95:5 MeCN/H₂O过15分钟时，保留时间 ⁶⁴Cu-Tz-Bn-NOTA 的保留时间应在 9.8 分钟左右，而游离的、未螯合的 ⁶⁴铜将在约2-4分钟时随溶剂前沿洗脱。
7. 使用旋转蒸发仪除去HPLC洗脱液。
8. 重新溶解 ⁶⁴Cu-Tz-Bn-NOTA 产物溶于 0.9% 无菌生理盐水。
   注意：鉴于其12.7小时的物理半衰期 ⁶⁴铜，这不是该实验步骤中可接受的中断点。请继续完成合成过程 ⁶⁴注射放射性配体前立即使用 Cu-Tz-Bn-NOTA，并在第 3.7 步后立即进行第 4.5 步。

4. 体内 预靶向PET成像

注意：与第3部分实验方案相同，本步骤涉及放射性物质的操作与处理。在执行这些步骤之前，研究人员应咨询所在机构的辐射安全部门，并采取一切可能措施以尽量减少电离辐射暴露。

1. 在一只雌性裸鼠中，皮下植入 1 × 10⁶ 个 SW1222 结肠直肠癌细胞，并使其生长为体积 100–150 mm³ 的异种移植瘤（接种后 9–12 天）。¹¹
2. 将来自方案第 2 部分的 huA33-TCO 溶液取一份稀释至 0.5 mg/ml 的浓度，溶剂为 0.9% 无菌生理盐水。
3. 向荷瘤小鼠尾静脉注射 200 µl huA33-TCO 溶液（100 µg）。
4. 让 huA33-TCO 在小鼠肿瘤中积累 24 小时。
5. 将⁶⁴Cu-Tz-Bn-NOTA 放射性配体稀释至 1.5 mCi/ml 的浓度，溶剂为 0.9% 无菌生理盐水。
6. 向荷瘤小鼠尾静脉注射 200 µl ⁶⁴Cu-Tz-Bn-NOTA 放射性配体溶液（300 µCi；11.1 MBq；1.6 nmol ⁶⁴Cu-Tz-Bn-NOTA，假设比活度为 6.7 MBq/nmol）。
7. 在预定的成像时间点（例如，注射后 2、6、12 或 24 小时），使用 2% 异氟烷：氧气混合气体对小鼠进行麻醉。
8. 将小鼠置于小动物 PET 扫描仪的扫描床上。扫描期间使用 1% 异氟烷：氧气混合气体维持麻醉。在将动物放置于扫描床前，需通过夹趾法确认麻醉状态，并在小鼠眼部涂抹兽用眼膏以防止麻醉期间角膜干燥。
9. 通过静态扫描采集小鼠的 PET 数据，采集条件为：能量窗 350–700 keV，符合时间窗 6 nsec，总计数不少于 2000 万次符合事件。图像采集完成后，不得让小鼠无人看管，且在完全恢复意识前不得将其放回与其他小鼠共用的笼中。

结果

实验的前三个步骤——Tz-Bn-NOTA 的合成、TCO 与 huA33 的偶联以及 Tz-Bn-NOTA 构建物的放射性标记（图 3 和 图 4）——具有很高的可靠性。在上述操作中，Tz-Bn-NOTA 构建物以高产率和高纯度被成功合成。huA33 抗体被修饰为每分子抗体携带 4.2 ± 0.6 个 TCO 基团，Tz-Bn-NOTA 以 ⁶⁴Cu 进行放射性标记，得到纯化后的放射性配体，其放射化学纯度 >99%，衰变校正后产率 >85%，比活度约为 6.7 MBq/nmol（图 5）。huA33-TCO 偶联物与四嗪放射性配体的反应活性可通过放射性即时薄层色谱法（iTLC）进行检测。具体操作为：将放射性标记的四嗪（100 µCi；0.55 nmol，假设比活度为 6.7 MBq/nmol）与稍过量的 huA33-TCO（50 µg；0.66 nmol）在磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）中于室温下混合反应 5 分钟。然后取约 1 µCi 的反应液点样于反相 C₁₈ 薄层色谱板上，并使其干燥。使...

讨论

这种预靶向PET成像策略的主要优势在于，它能够在仅产生直接标记抗体所导致背景辐射剂量的一小部分的情况下，实现肿瘤的高靶区-背景图像对比度。例如，在本文所述的结直肠癌成像系统中，利用急性生物分布实验的数据，对基于⁶⁴Cu的预靶向策略以及直接标记的⁶⁴Cu-NOTA-huA33和⁸⁹Zr-DFO-huA33进行了剂量学计算。这些计算结果清晰地展示了预靶向系统的剂量学优势，尤其是与临床相关性更高的⁸⁹Zr标记抗体相比。预靶向策略的有效剂量为0.0124 mSv/MBq，而⁸⁹Zr-DFO-huA33的有效剂量则高出30多倍，达到0.4162 mSv/MBq。尽管与⁶⁴Cu标记抗体（0.0359 mSv/MBq）相比，预靶向的剂量学优势相对较小，但其有利效应仍然存在。

这种IEDDA预靶向方法最重要的优势之一是其模块化特性：trans-环辛烯可连接至任何非内化的抗体，而四嗪则可偶联多种不同的载荷。事实上，我们撰写本实验方案的主要动机正是为了帮...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
四嗪-NHS酯	Sigma-Aldrich	764701	于-80 °C保存
反式环辛烯-NHS酯	Sigma-Aldrich	764523	于-80 °C保存
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	于-80 °C保存