方法文章

评估癌症药物增敏效果 体外 和 体内

DOI：

10.3791/52388

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2015年2月6日

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1Microbiology and Immunology, Western University, 2Biochemistry, Western University, 3Surgery, Western University, 4Oncology, Western University

本文内容

摘要

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此处，结合实时监测肿瘤细胞代谢， 体内 用于评估新型抗癌靶点或药物能否增强肿瘤细胞对DNA损伤类化疗药物敏感性的转移模型，包括鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）模型。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于人类癌症具有高度异质性和内在突变特性，针对单一靶点的单药治疗或靶向同一条信号通路的联合治疗方案很可能失败。因此，必须重视抑制那些介导治疗内在性和/或适应性耐药的信号通路。当前一个活跃的研究领域是开发和测试DNA修复抑制剂，以增强常用化疗和放疗的作用，并防止耐药性的产生。我们采用一种新颖的实验方案，评估抑制BRCA2在增强肿瘤细胞对DNA损伤药物顺铂敏感性方面的有效性。通过实时监测肿瘤细胞代谢（酸化和呼吸）长达72小时，以分钟为单位精确刻画治疗效果。同时，我们利用鸡胚尿囊膜（CAM）外渗与侵袭模型，评估肿瘤转移频率。该方案弥补了常规方法中存在的一些不足 体外 和 体内 评估新型癌症治疗方案的方法。该方法可与细胞增殖检测、细胞死亡检测等常用方法结合使用。 体内 小鼠异种移植研究，以更精确地区分候选靶点和候选药物，并筛选出最有前景的候选者进行后续开发。

引言

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获得性耐药是靶向治疗和/或细胞毒性癌症治疗中的一个重要临床问题，可能导致治疗失败、疾病复发以及患者死亡率升高1。鉴于大多数肿瘤具有高度异质性，从数学角度可以确定，当肿瘤细胞数量足够多时，其中必然存在一部分细胞对针对其生存所依赖的分子通路的单一或联合疗法具有耐药性2,3。这些耐药肿瘤细胞在治疗过程中可能被正向选择，从而导致疾病复发。因此，开发能够同时靶向不同癌细胞生存机制的新型疗法，无论是在治疗介导的选择发生之前还是之后，均具有重要的临床意义。

肿瘤基因组具有高度的基因组不稳定性和突变，这是将癌细胞与非肿瘤宿主细胞区分开的基本特征4。因此，提高DNA损伤类化疗药物疗效并防止耐药性产生的有效策略之一，是主动抑制肿瘤细胞中的DNA修复功能5。该领域目前正处于活跃的研究阶段，多种新型DNA修复靶点正在临床前研究中被广泛探索。针对这些靶点的多种小分子抑制剂或基于反义寡核苷酸的抑制剂已被开发出来，并正在进行测试6-8。研究的目标是筛选出最具前景的临床前候选药物，并在临床试验中评估其安全性和有效性。

临床试验的高昂成本以及失败风险（原因多种多样，包括临床前评估不充分）是新疗法研发进程中巨大的障碍9。采用适当且严谨的临床前模型，对新的治疗靶点和候选药物进行充分评估，可能降低临床试验的高失败率10。

一些常用于评估新型抗癌治疗方案有效性的临床前方法包括：a) 测定抑制肿瘤细胞增殖的能力 体外 （细胞增殖检测），b）治疗导致肿瘤细胞形成组织培养集落能力下降（集落形成检测），c）治疗导致肿瘤细胞代谢活性降低 体外 （氧化还原染料转化），d）治疗诱导的诱导作用 体外 肿瘤细胞死亡（凋亡性、坏死性、自噬性，与有丝分裂相关及其他类型）11，以及 e） 体内 治疗诱导的人源和鼠源异种移植瘤生长抑制或消融12-14.

所列内容的一个主要缺陷 体外 方法的局限性在于，它们均无法对候选疗法的效果进行连续的实时评估，而仅能在治疗过程中某些选定的、相隔较远的时间点提供信息。这类测量方式在准确反映肿瘤细胞反应的强度和时序方面能力有限。 在体 小鼠异种移植模型还存在成本高、实验周期长以及给药剂量和治疗时机（给药方案）可能不理想等局限性。此外，有证据表明，与人类临床疗效相比，啮齿类动物异种移植模型的预测能力有限。 体外 原代人肿瘤细胞与已建立的人肿瘤细胞系对候选治疗干预措施反应的评估15,16.

我们设计了一种新的联合用药方案，用于在临床前评估新药组合，该方案针对上述常见方法的局限性进行了改进。我们未采用增殖、克隆形成或氧化还原染料转化等检测方法，而是利用代谢检测系统，在整个处理期间实时分析细胞黏附、呼吸及酸化情况。17同时，我们研究了联合治疗的效果 体内 通过使用鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）侵袭与转移模型18,19我们采用这些方法评估了一种靶向BRCA2的反义寡核苷酸（ASO）增强常用化疗药物顺铂疗效的能力。

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方案

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注意：以下实验方案专为贴壁细胞设计。若要将该方法应用于悬浮培养的非贴壁细胞，需进行相应修改。本方案中描述的CAM实验适用于表达荧光标记的细胞例如，GFP，RFP， 等等。实验方案第2天需要使用9日龄的鸡胚进行CAM实验。

1. 肿瘤细胞的准备及其与反义寡核苷酸（ASOs）的转染

  1. 吸弃含有目标细胞的T75培养瓶中的培养基，用1×PBS洗涤，加入2 ml 0.25%胰蛋白酶/EDTA。每瓶加入10 ml完全生长培养基，将悬浮细胞转移至50 ml离心管中。计数细胞，并调整体积使最终浓度为每毫升1.0×105个细胞。
  2. 标记两组T25培养瓶：其中一组包含8个培养瓶，编号为1-8，用于实时代谢测量实验；另一组也包含8个培养瓶，用于鸡胚尿囊膜实验。向每个培养瓶中加入2 ml细胞悬液，并置于培养箱中（37 °C，5% CO2，过夜）。
  3. 次日早晨（第0天，时间0），标记三个5 ml离心管，分别为：对照组（非靶向ASO或siRNA）、“目标靶点”（即靶向ASO或siRNA）以及Lipofectamine 2000（或类似的转染试剂）。用无血清培养基将储备的ASO溶液稀释至适当浓度，分别加入对应的离心管中。
    1. 向对应的离心管中加入所需量的转染试剂，在无血清培养基中孵育5分钟。随后将转染试剂溶液加入ASO管中，继续孵育20分钟。
  4. 向每组中的培养瓶1-4分别加入250 µl对照ASO转染试剂溶液，向每组中的培养瓶5-8分别加入250 µl“目标靶点”ASO转染试剂溶液。在37 ᵒC、5% CO2条件下孵育4小时。
    1. 在孵育期间，执行第2.1节中描述的步骤。孵育结束后，向尿囊膜实验组的每个培养瓶中加入3 ml完全培养基，放回培养箱过夜（37 ᵒC，5% CO2）。按照第2.2节中的描述处理代谢实验组，按照第4节中的描述处理尿囊膜实验组。

2. 生物传感器芯片制备与细胞接种

  1. 在无菌环境中，用 400 µl 的 PBS 轻柔清洗六片生物传感器芯片。用 400 µl 的 70% 乙醇对芯片进行 20 分钟的灭菌处理，随后用 400 µl 的 PBS 洗涤三次。
    1. 将芯片放入无菌的组织培养皿中以防止污染。将三片芯片放入标记为“对照”的培养皿中，另三片放入标记为“目标物”的培养皿中。
  2. 将两个 50 ml 离心管分别标记为“对照”和“目标物”。用 PBS 清洗细胞，加入适量的 0.25% 胰蛋白酶/EDTA。待单层细胞脱落之后，收集每个培养瓶中的细胞，并将溶液转移至相应的离心管中。
    1. 对细胞进行计数，并调整体积，使最终浓度为 6.0×105 个细胞/ml。若初始浓度过低，则进行离心并重新悬浮细胞。
  3. 向每组对应的生物传感器芯片中各加入 250 µl 细胞悬液（每片芯片共接种 1.25×105 个细胞）。每次操作仅处理一组，以尽量降低芯片混淆的风险。将含有芯片的无菌培养皿放入湿化室中以防止蒸发，并将湿化室置于培养箱中过夜培养（37 ᵒC，5% CO2）。
  4. 次日早晨（第 1 天），小心吸去每片芯片中的培养基，更换为 250 µl 含 0.2% 胎牛血清（FBS）和 1× 青霉素-链霉素（P/S）的生长培养基。在 37 ᵒC、5% CO2 条件下继续孵育 4 小时。

3. 代谢测量系统的准备与溶液配制

  1. 孵育期间，准备即将进行的检测所需的药物溶液和代谢测量系统。
    注意：代谢测量系统共包含六个模块。每个模块在每次实验中容纳一个芯片。
    1. 将检测分为以下实验组：从“对照”组和“目标组”中各取一个芯片，在整个检测过程中给予溶剂处理；从每组中各取两个芯片，在检测期间的特定时间段内给予药物处理，随后在洗脱期给予溶剂处理。
    2. 对于药物致敏研究，可根据具体药物调整药物处理的时间长度、时机和浓度。
      注意：对于顺铂，以下步骤是通过A549细胞经验确定的，可能因细胞系不同而有所变化。所有阶段均以默认流速4 µl/min进行。
      6小时生长培养基 + 0.2% FBS 和 1x P/S
      24小时含6 µM顺铂的培养基 + 0.2% FBS 和 1x P/S
      24小时生长培养基 + 0.2% FBS 和 1x P/S
      18小时生长培养基 + 0.2% FBS 和 1x P/S
      4小时0.1% Triton-X
      注意：若偏离上述步骤，需根据期望的流速和实验持续时间重新计算所需培养基和药物溶液的体积。以下部分基于上述描述的步骤。
  2. 标记并装填十四根50 ml离心管，每管加入50 ml生长培养基 + 0.2% FBS 和 1x P/S。将其中六根放入一个代谢测量系统的管架中，另六根放入第二个管架中，剩余两根放入第三个管架中，该管架还包含含有顺铂的离心管。用透气膜密封前两个管架，以防止蒸发。
  3. 在培养基 + 0.2% FBS 和 1x P/S中配制适当体积的6 µM顺铂溶液。将所需体积的顺铂溶液分装至四个已标记的50 ml离心管中。
    1. 将这些离心管放入第三个代谢测量系统管架中剩余的四个插槽中。确保将离心管放置在与目标生物模块相对应的正确插槽中。用透气膜密封离心管。
  4. 准备并标记六个50 ml离心管，每管加入20 ml含0.1% Triton-X的培养基溶液。Triton-X溶液将裂解任何残留的细胞，为每个芯片提供“零值”读数。将这些离心管放入第四个代谢测量单元的管架中，并用透气膜密封，以防止过度蒸发。
  5. 将芯片装入生物模块中，并启动实验。

4. CAM实验药物处理与注射

注意：制备鸡胚用于CAM实验的步骤和操作流程在其他地方已有描述19

  1. 转染后48小时（第2天）开始处理CAM实验。将“对照”组和“目标处理”组分别分为两个培养瓶用于溶剂处理，另两个培养瓶用于顺铂处理。吸除培养瓶中的培养基，分别加入3 ml新鲜培养基或6 µM顺铂。于37 ᵒC、5% CO2条件下孵育6小时。
  2. 吸除培养基，随后洗涤并用胰蛋白酶消化细胞；将消化后的细胞收集至四个相应标记的15 ml离心管中。
    1. 用PBS洗涤细胞三次，离心后弃上清。将细胞沉淀重悬于5 ml PBS中，并进行细胞计数。
    2. 调整体积使最终细胞浓度为1.0×106 个细胞/ml。将细胞悬液转移至标记好的5 ml离心管中用于注射，并置于冰上。注射前轻轻倒置混匀，确保细胞均匀悬浮。
  3. 预留总共24枚9日龄鸡胚用于注射（每组6枚）。使用连接在柔性管上的玻璃针头，将柔性管与1 ml注射器相连进行注射操作。执行注射的人员应对处理分组保持盲法。
    1. 在体视显微镜下，将1.0×105个细胞以100 µl体积注入CAM的静脉循环系统。采用缓慢、脉冲式推注方式，确保全部细胞悬液注入。注射后用柔软擦拭纸轻轻按压注射部位，以止血并吸收溢出液体。每次注射后应正确标记对应的鸡胚容器。
  4. 注射后通过荧光显微镜观察CAM血管系统中荧光标记细胞的存在情况及其分布，确认细胞定位。记录任何肿瘤细胞数量较少或分布不佳的鸡胚。
  5. 将鸡胚置于湿度控制室中，并存放于培养箱内（37 °C，60%湿度）。等待7–9天后开始计数转移灶。

5. 转移灶计数

  1. 在7-9天的孵育期间，监测胚胎并丢弃任何死亡的胚胎。确保在孵育期间湿度箱始终保持湿润。
  2. 使用20倍放大倍率的荧光体视显微镜，以规则的网格状模式扫描胚胎CAM的整个上表面。
  3. 计数每个视野中的转移灶数量，然后汇总得出每个胚胎的最终总数。对每组中的六个胚胎进行此操作，可获得每种处理的平均转移灶数量。

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结果

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结果与图示经许可改编自已发表的研究22。

BRCA2 抑制可导致顺铂处理的肿瘤细胞呼吸作用下降

与接受对照ASO和顺铂单独处理的细胞相比，经BRCA2靶向ASO和顺铂处理的人A549肺癌细胞表现出更早且不可逆的呼吸作用下降；在顺铂处理24小时后，BRCA2 ASO处理细胞与对照ASO处理细胞之间的呼吸作用差异达到39%（图1A）。重要的是，呼吸作用的下降发生在细胞黏附力可检测到下降之前，表明该现象独立于细胞数量的变化。呼吸作用大约在可观察到黏附力下降前10小时即开始降低，提示呼吸作用下降可能是先于细胞死亡的早期事件（图1B）。在72小时的实验时间范围内未观察到酸化作用的差异，表明BRCA2 ASO与顺铂处理对葡萄糖代谢几乎没有影响（图1C）。

BRCA2 抑制与顺铂治疗联用可降低转移频率

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讨论

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由于临床试验本身具有较高的成本和风险，因此需要开发更优且更严格的临床前测试方法，以充分评估新型抗癌治疗方案。目前常用的技术均存在一些缺陷，可能限制其区分潜在有效治疗靶点/药物与疗效较差药物的能力。我们设计了一种评估新型抗癌策略的实验方案，可解决传统方法的诸多不足。

本方案的一个特别重要特征是能够实时测量细胞反应，并逐分钟追踪代谢和黏附性的变化。这有助于确定药物效应的峰值、最佳给药剂量，以及更深入地理解联合用药中各组分之间的相互作用。同时，该方法可提供关于癌细胞细微代谢改变的信息，而这些信息是细胞计数、凋亡检测或染料转化实验所无法提供的。该检测方法的一个局限性在于无法准确判断药物处理过程中发生的细胞死亡类型。活力的变化会反映为细胞对生物传感器芯片黏附性的改变，但这并不能提供有关细胞死亡方式的信息。此外，也可采用荧光显微镜和活细胞成像技术来获取类似的代谢数据，这些技术可与本方案中描述的实验结合使用20,21。

此外，利用鸡胚尿囊膜（CAM）模型研究治疗后转移频率，是判断新靶点、药物或药物组合是否降低癌细胞外渗...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本工作得到了安大略省卓越中心和安大略研究基金向 JK 提供的资助。

我们感谢Siddika Pardhan和Peter Ferguson博士在拍摄过程中提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
A549 细胞ATCCCCL-185http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx
AeraSeal 封膜Carl Roth GmbH
AMEMWisent Bioproducts210-011-QK
反义寡脱氧核苷酸AveciaBRCA2 靶序列：5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3'（碱基 7241-7259）
Axio Zoom V16 显微镜Carl Zeisshttp://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html
Bionas 生物传感器芯片Bionas GmbH 和 Micronas GmbHBIS8001D
Bionas Discovery 2500 系统 Bionas GmbHhttp://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/
顺铂Sigma Aldrich479306
受精鸡卵本地采购
胎牛血清 Gibco - Life Technologies
Lipofectamine 2000 Invitrogen - Life Technologies 12566014http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html
PBSWisent Bioproducts311-010-CL
胰蛋白酶（0.25%）/EDTAWisent Bioproducts325-043-CL

参考文献

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BRCA2

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