此处，结合实时监测肿瘤细胞代谢， 体内 用于评估新型抗癌靶点或药物能否增强肿瘤细胞对DNA损伤类化疗药物敏感性的转移模型，包括鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）模型。
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本文内容
摘要
摘要
由于人类癌症具有高度异质性和内在突变特性，针对单一靶点的单药治疗或靶向同一条信号通路的联合治疗方案很可能失败。因此，必须重视抑制那些介导治疗内在性和/或适应性耐药的信号通路。当前一个活跃的研究领域是开发和测试DNA修复抑制剂，以增强常用化疗和放疗的作用，并防止耐药性的产生。我们采用一种新颖的实验方案，评估抑制BRCA2在增强肿瘤细胞对DNA损伤药物顺铂敏感性方面的有效性。通过实时监测肿瘤细胞代谢（酸化和呼吸）长达72小时，以分钟为单位精确刻画治疗效果。同时，我们利用鸡胚尿囊膜（CAM）外渗与侵袭模型，评估肿瘤转移频率。该方案弥补了常规方法中存在的一些不足 体外 和 体内 评估新型癌症治疗方案的方法。该方法可与细胞增殖检测、细胞死亡检测等常用方法结合使用。 体内 小鼠异种移植研究，以更精确地区分候选靶点和候选药物，并筛选出最有前景的候选者进行后续开发。
引言
获得性耐药是靶向治疗和/或细胞毒性癌症治疗中的一个重要临床问题，可能导致治疗失败、疾病复发以及患者死亡率升高1。鉴于大多数肿瘤具有高度异质性，从数学角度可以确定，当肿瘤细胞数量足够多时，其中必然存在一部分细胞对针对其生存所依赖的分子通路的单一或联合疗法具有耐药性2,3。这些耐药肿瘤细胞在治疗过程中可能被正向选择，从而导致疾病复发。因此，开发能够同时靶向不同癌细胞生存机制的新型疗法，无论是在治疗介导的选择发生之前还是之后，均具有重要的临床意义。
肿瘤基因组具有高度的基因组不稳定性和突变，这是将癌细胞与非肿瘤宿主细胞区分开的基本特征4。因此，提高DNA损伤类化疗药物疗效并防止耐药性产生的有效策略之一，是主动抑制肿瘤细胞中的DNA修复功能5。该领域目前正处于活跃的研究阶段，多种新型DNA修复靶点正在临床前研究中被广泛探索。针对这些靶点的多种小分子抑制剂或基于反义寡核苷酸的抑制剂已被开发出来，并正在进行测试6-8。研究的目标是筛选出最具前景的临床前候选药物，并在临床试验中评估其安全性和有效性。
临床试验的高昂成本以及失败风险（原因多种多样，包括临床前评估不充分）是新疗法研发进程中巨大的障碍9。采用适当且严谨的临床前模型，对新的治疗靶点和候选药物进行充分评估，可能降低临床试验的高失败率10<....
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方案
注意：以下实验方案专为贴壁细胞设计。若要将该方法应用于悬浮培养的非贴壁细胞，需进行相应修改。本方案中描述的CAM实验适用于表达荧光标记的细胞例如，GFP，RFP， 等等。实验方案第2天需要使用9日龄的鸡胚进行CAM实验。
1. 肿瘤细胞的准备及其与反义寡核苷酸（ASOs）的转染
- 吸弃含有目标细胞的T75培养瓶中的培养基，用1×PBS洗涤，加入2 ml 0.25%胰蛋白酶/EDTA。每瓶加入10 ml完全生长培养基，将悬浮细胞转移至50 ml离心管中。计数细胞，并调整体积使最终浓度为每毫升1.0×105个细胞。
- 标记两组T25培养瓶：其中一组包含8个培养瓶，编号为1-8，用于实时代谢测量实验；另一组也包含8个培养瓶，用于鸡胚尿囊膜实验。向每个培养瓶中加入2 ml细胞悬液，并置于培养箱中（37 °C，5% CO2，过夜）。
- 次日早晨（第0天，时间0），标记三个5 ml离心管，分别为：对照组（非靶向ASO或siRNA）、“目标靶点”（即靶向ASO或siRNA）以及Lipofectamine 2000（或类似的转染试剂）。用无血清培养基将储备的ASO溶液稀释至适当浓度，分别加入对应的离心管中。
- 向对应的离心管中加入所需量的转染试剂，在无血清培养基中孵育5分钟。随后将....
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结果
结果与图示经许可改编自已发表的研究22。
BRCA2 抑制可导致顺铂处理的肿瘤细胞呼吸作用下降
与接受对照ASO和顺铂单独处理的细胞相比，经BRCA2靶向ASO和顺铂处理的人A549肺癌细胞表现出更早且不可逆的呼吸作用下降；在顺铂处理24小时后，BRCA2 ASO处理细胞与对照ASO处理细胞之间的呼吸作用差异达到39%（图1A）。重要的是，呼吸作用的下降发生在细胞黏附力可检测到下降之前，表明该现象独立于细胞数量的变化。呼吸作用大约在可观察到黏附力下降前10小时即开始降低，提示呼吸作用下降可能是先于细胞死亡的早期事件（图1B）。在72小时的实验时间范围内未观察到酸化作用的差异，表明BRCA2 ASO与顺铂处理对葡萄糖代谢几乎没有影响（图1C）。
BRCA2 抑制与顺铂治疗联用可降低转移频率
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讨论
由于临床试验本身具有较高的成本和风险，因此需要开发更优且更严格的临床前测试方法，以充分评估新型抗癌治疗方案。目前常用的技术均存在一些缺陷，可能限制其区分潜在有效治疗靶点/药物与疗效较差药物的能力。我们设计了一种评估新型抗癌策略的实验方案，可解决传统方法的诸多不足。
本方案的一个特别重要特征是能够实时测量细胞反应，并逐分钟追踪代谢和黏附性的变化。这有助于确定药物效应的峰值、最佳给药剂量，以及更深入地理解联合用药中各组分之间的相互作用。同时，该方法可提供关于癌细胞细微代谢改变的信息，而这些信息是细胞计数、凋亡检测或染料转化实验所无法提供的。该检测方法的一个局限性在于无法准确判断药物处理过程中发生的细胞死亡类型。活力的变化会反映为细胞对生物传感器芯片黏附性的改变，但这并不能提供有关细胞死亡方式的信息。此外，也可采用荧光显微镜和活细胞成像技术来获取类似的代谢数据，这些技术可与本方案中描述的实验结合使用20,21。
此外，利用鸡胚尿囊膜（CAM）模型研究治疗后转移频率，是判断新靶点、药物或药物组合是否降低癌细胞外渗.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了安大略省卓越中心和安大略研究基金向 JK 提供的资助。
我们感谢Siddika Pardhan和Peter Ferguson博士在拍摄过程中提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| A549 细胞 | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal 封膜 | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| 反义寡脱氧核苷酸 | Avecia | BRCA2 靶序列：5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3'（碱基 7241-7259） | |
| Axio Zoom V16 显微镜 | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas 生物传感器芯片 | Bionas GmbH 和 Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 系统 | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| 顺铂 | Sigma Aldrich | 479306 | |
| 受精鸡卵 | 本地采购 | ||
| 胎牛血清 | Gibco - Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen - Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| 胰蛋白酶（0.25%）/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
参考文献
- Bouwman, P., Jonkers, J. The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance. Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).
- Bozic, I., et al. Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination....
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重印与许可
