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肠系膜淋巴管插管大鼠模型：在评估肠道淋巴药物转运中的应用

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DOI：

10.3791/52389

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2015年3月6日

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1Drug Delivery, Disposition, and Dynamics, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University (Parkville Campus)

本文内容

摘要

本文介绍一种在大鼠中对肠系膜淋巴管进行插管的技术，该技术可实现对经肠道给药后通过淋巴系统转运的脂质和药物进行定量分析。该技术可进一步用于评估肠系膜淋巴液中液体、免疫细胞、肽类、蛋白质以及亲脂性分子的浓度和/或转运情况。

摘要

肠淋巴系统在液体运输、脂质吸收和免疫功能中发挥关键作用。淋巴液直接从小肠通过一系列淋巴管和淋巴结流动，最终汇入肠系膜上淋巴管。因此，对肠系膜淋巴管进行插管即可收集来自肠道的肠系膜淋巴液。肠系膜淋巴液包含细胞成分（99%为淋巴细胞）、水相成分（液体、肽类和蛋白质，如细胞因子和肠道激素）以及脂蛋白成分（脂质、亲脂性分子和载脂蛋白）。因此，肠系膜淋巴管插管模型可用于测定多种物质经由淋巴系统从肠道转运的浓度和速率。这些成分在应对不同刺激时发生的变化（例如， 饮食、抗原、药物）以及疾病中（例如， 炎症性肠病、艾滋病、糖尿病等疾病状态下的淋巴转运情况也可被测定。目前研究兴趣不断扩展的一个领域是，淋巴转运在口服亲脂性药物及其前体药物吸收过程中的作用，这些药物可与肠道脂质吸收途径相关联。本文详细描述了一种经手术插管大鼠肠系膜淋巴管的模型，该模型可在肠道给药后的数小时内，用于评估脂质和药物通过淋巴系统的转运速率与程度。该方法亦可便捷地用于测定淋巴液中的其他参数。我们详细阐述了在建立这一复杂外科手术模型过程中可能遇到的困难，并提供了失败与成功实验的代表性数据，以指导如何确认实验成功以及如何解读所获得的数据。

引言

淋巴液从小肠通过一个单向过程流出，该过程起始于每个小肠绒毛内的单个乳糜管1。乳糜管对液体、大分子和细胞具有相对通透性，因此淋巴液的形成始于这些物质进入乳糜管。乳糜管内的初始淋巴液随后经由淋巴微血管网络、集合（传入）淋巴管、一系列肠系膜淋巴结，最终流向结后（传出）淋巴管。在淋巴结内，淋巴液流经一系列髓质窦，在此与淋巴结内定居的免疫细胞发生物质交换，同时也与从血液进入淋巴结的物质进行交换。所有从小肠流出的淋巴液最终汇入输出支的肠系膜上淋巴管，随后进入乳糜池。乳糜池还收集来自尾部外周组织、肠道、肝脏和腰部区域的淋巴液，并与纵隔及身体头端部分的淋巴液汇合后共同进入胸导管。胸导管将淋巴液直接排入静脉系统，位置在左侧颈内静脉与锁骨下静脉的交汇处。本文所述的实验方案可直接从肠系膜上淋巴管收集淋巴液，从而便于分析经由肠淋巴系统从小肠直接进入全身循环的各种因子。

肠淋巴系统承担的主要生理功能包括维持体液平衡、促进脂质及亲脂性分子的吸收，以及介导适当的免疫应答。1肿瘤细胞和病毒亦可通过肠淋巴管传播2-4 在多种炎症性和代谢性病理过程中，淋巴系统内会发生关键性改变5-7. 对肠系膜淋巴管进行插管以收集肠系膜内的淋巴液，可实现对肠道淋巴系统中大量液体流动的分析，同时可定量测定多种细胞和分子的浓度及其转运速率。针对不同刺激因素所引起的这些物质浓度或转运变化的分析（例如， 饮食、抗原、药物）以及疾病模型中（例如， 结肠炎、HIV、糖尿病）等疾病状态也可进行评估。尽管无法在此详尽描述所有可能分析和比较的淋巴成分，但肠系膜淋巴液简而言之由水相、脂相和细胞相组成。水相中值得关注的成分包括肽类和蛋白质，如抗原或耐受原。8细胞因子和肥大细胞介质等免疫信使9以及胰岛素促泌剂等代谢介质10肠系膜淋巴结后淋巴液的细胞成分几乎全部（超过99%）为淋巴细胞11. 多种免疫细胞（树突状细胞、肥大细胞、 等等。进入前哨肠系膜淋巴管，但滞留在淋巴结内12如果需要研究传入淋巴液中的细胞，可在插管收集肠系膜淋巴管淋巴液前数天，通过摘除肠系膜淋巴结来获取这些细胞。12通过这种方式，传入和传出的淋巴管被直接连接，传入淋巴中的淋巴细胞可直接进入肠系膜淋巴管。因此可对经过肠淋巴管的各种免疫细胞的转运过程及其表型进行研究。然而，迄今为止收集肠系膜淋巴最常见的目的可能是研究肠道对膳食脂质及亲脂性分子的加工、吸收与转运过程。10.

摄入后，膳食脂质被消化（例如，甘油三酯分解为脂肪酸和单酰甘油，磷脂分解为脂肪酸和溶血磷脂，胆固醇酯分解为脂肪酸和胆固醇）， 等等。）并通过胆汁中的两亲性物质（磷脂、胆固醇和胆盐）以及胰酶的作用，在肠腔内分散成微小的胶束和囊泡结构10,13随后被吸收进入肠上皮细胞。部分被吸收的组分在吸收细胞（肠上皮细胞）内重新酯化，形成甘油三酯、磷脂和胆固醇酯。这些重新酯化的脂质由外源性摄入的脂质组分与来自分泌胆汁、黏膜脂质库或肠道血液供应的内源性脂质组分共同组装而成。13随后，酯化后的脂质要么在肠上皮细胞内储存，要么与多种载脂蛋白及其他亲脂性分子一起组装成肠道脂蛋白（乳糜微粒、极低密度脂蛋白（VLDL））例如， 维生素10,13离开肠上皮细胞后，脂蛋白通过肠系膜淋巴系统从肠道特异性转运至体循环，这是因为肠乳糜管对脂蛋白进入的通透性高于肠内血液毛细血管。部分被吸收的脂质成分亦可通过血液毛细血管和门静脉以单个非脂蛋白结合分子的形式从肠道转运至体循环。14 然而，一般来说，门静脉转运途径仅在短链和中链脂质的吸收中起重要作用。

因此，肠系膜淋巴液的采集能够评估脂蛋白及其相关组分（脂质、亲脂性分子、载脂蛋白）从肠道的转运情况。脂蛋白可被定量和表征，其优势在于肠系膜淋巴液中的脂蛋白通常处于新生状态，尚未被脂蛋白脂肪酶等全身性酶类广泛修饰15。尽管肠系膜淋巴管插管大鼠模型在历史上最常用于分析脂质/脂蛋白从肠道的转运，但目前日益受到关注的一个研究方向是淋巴系统在亲脂性药物、前体药物及其他外源性物质转运中的作用13,16，这也是本文所述模型的重点。亲脂性药物（通常指log P > 5且在长链甘油三酯中溶解度 > 50 mg/g者，尽管存在例外情况）17,18、前体药物19及其他外源性物质13,16可通过被动扩散或主动整合进入肠道脂蛋白转运途径的方式进入肠淋巴系统19。

因此，大鼠肠系膜淋巴管插管技术具有多种应用。Bollman 等 1948年首次描述了一种用于大鼠肠系膜淋巴导管插管的技术20此后，该模型的多种改良方法已被报道。例如，可在大鼠使用不同麻醉剂麻醉后进行采集。21,22，或在受约束状态下保持清醒状态15 或自由活动23,24大鼠可通过胃、肠或肠外途径（通常为0 - 5 ml/hr）以不同速率给予不同的再水化溶液以及其他物质，如脂质和药物制剂。25在某些研究中，为评估物质经淋巴系统从小肠的转运情况，选择插管胸导管而非肠系膜淋巴管，但这种方法可能会高估小肠的转运量，具体取决于所关注的因素，因为胸导管还接收来自其他区域的淋巴液。22,26. 淋巴管插管模型也在包括小鼠在内的多个其他物种中有所描述15,27小型猪12，绵羊28,29，猪30 和狗31然而，大鼠模型是被引用最广泛且最一致的模型。详细的方案包括对清醒大鼠进行肠系膜淋巴导管插管，随后收集淋巴液25 或麻醉22 大鼠和小鼠15,27 此前已有相关方案发表，感兴趣的读者可参考这些方案。本方案是首个以可视化形式展示该技术的实验流程。

与较大的动物模型相比，淋巴管插管大鼠模型在成本、手术操作的简便性以及伦理考量方面具有优势。与小鼠模型相比，大鼠的肠系膜淋巴管插管手术也更为容易，尽管小鼠模型更适用于转基因动物的深入研究27。然而，大鼠模型仍存在一些局限性，尤其是与生理差异相关的因素，限制了其向其他临床前及临床情况的外推。例如，大鼠的胆汁流量是恒定的，且不受食物摄入的影响，而在更高级的物种中，食物或脂质会刺激胆汁分泌32。这使得在大鼠中难以获得能够代表进食前后状态的、与较高级物种及人类相似的生理环境。在药物递送研究中，当评估给予接近人类实际剂量剂型后的淋巴转运时，可能更倾向于使用较大的动物物种25。在最近的一项研究中，给予等质量且相同类型的脂质后，不同物种（小鼠、大鼠、犬）肠系膜淋巴中的脂质转运速率具有可比性，这为跨物种外推脂质转运数据提供了一定的依据27。然而，一种模型亲脂性药物卤泛群（halofantrine）的淋巴转运效率按动物体型大小排序呈现差异（即，犬 > 大鼠 > 小鼠）。因此，在将大鼠的淋巴药物转运数据外推至其他物种时，可能需要引入一个换算系数。

总体而言，淋巴管插管模型的一个局限性在于，直接从淋巴管进行被动淋巴液收集可能会改变淋巴流动和转运，因为淋巴管原本是在压力梯度下工作的，而一旦进行插管，该压力梯度即被改变33。对于不熟悉该技术的实验室而言，建立淋巴管插管模型也可能较为困难。因此，已有其他替代模型被提出。例如，可通过采集血液间接研究经肠淋巴系统转运的因子（如脂蛋白和亲脂性分子）。其中一种模型是通过比较口服给药后，在存在或不存在肠道脂蛋白生成抑制剂（例如，秋水仙碱、Pluronic L81、环己酰亚胺）的情况下血液中脂质和/或药物的浓度，从而阻断淋巴转运过程34。通过采集血液样本间接量化淋巴转运的模型优势在于，无需侵入性手术，即可在人体中对淋巴转运进行一定程度的评估35。然而，淋巴转运抑制剂并不具有特异性，且经淋巴系统转运的因子在体循环中会被稀释和修饰，从而使评估变得复杂。体外替代方法也已有描述。例如，已利用Caco-2细胞或分离的肠上皮细胞培养体系，更详细地研究进入淋巴系统的分子的肠道分泌过程36-38。最近还报道了一种更能代表人类肠道微环境的高级体外模型39。在该模型中，将淋巴内皮细胞层与Caco-2细胞共培养，从而能够更详细地分析物质从肠道向淋巴系统的转移过程。然而，体外细胞系统缺乏交换流动和转运，即未与肠腔及下方的血液和淋巴血管供应系统相互连接。另一种方法中，Kassis 等建立了一种双通道（高速明场视频和荧光）原位成像系统，可对肠系膜淋巴管中的血管收缩、淋巴流速及荧光标记脂质浓度进行定量比较33。与前述体外系统相比，该模型的优势在于能够精确追踪免疫细胞通过淋巴系统的迁移过程。然而，目前尚无法通过成像方法建立对脂质（或药物）质量转运的绝对测量。体外和计算机模拟方法也被用于专门预测亲脂性药物经肠淋巴系统转运的程度，相关研究已有发表40-42。例如，多种化合物与血浆乳糜微粒的离体亲和力被发现与其在体内的淋巴转运程度具有较好的相关性41。随后，同一研究组建立了一个计算机模拟模型，基于多种理化性质预测药物对乳糜微粒的亲和力40。Holm 等也建立了一个相对复杂的计算机模拟模型，可直接基于分子描述符预测亲脂性化合物的淋巴转运情况42。这些模型可能为预测未知药物淋巴转运程度提供一种有用的方法。然而，要验证这些模型的准确性与可重复性，仍需在不同实验室中使用多种药物进行广泛验证。

因此，肠系膜淋巴管插管仍是唯一能够在体内条件下直接检测从小肠引流的淋巴液成分以及各种物质（细胞、蛋白质、多肽、脂质、药物）经淋巴转运速率的方法。本文描述了一种肠系膜淋巴管和颈动脉插管的实验方案，可用于从麻醉大鼠收集肠系膜淋巴液和全身血液。代表性数据展示了该模型如何用于研究脂质和药物通过肠系膜淋巴系统从小肠转运的过程。随后讨论了建立该模型过程中可能遇到的困难，并提供了故障排除指南。一旦成功建立，该模型即成为研究肠道淋巴转运的有力工具。

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方案

本研究方案已获得当地动物伦理委员会批准，并按照澳大利亚和新西兰研究与教学动物护理委员会（ANZCCART）的指南进行。在开展任何动物实验操作之前，须通过当地机构/组织获得相应的许可。对于所有动物手术操作，必须确保由经过适当培训的操作人员在无菌条件下进行，并根据需要使用麻醉剂、镇痛剂和抗生素，以确保实验符合伦理要求并取得成功结果。

1. 手术前一天的准备工作

  1. 如有需要，于手术前一晚对大鼠进行禁食。确保大鼠可自由饮水。
  2. 准备将要给予大鼠的溶液。
    1. 准备一种再水化溶液，例如无菌生理盐水或林格氏液。
    2. 根据需要准备麻醉剂溶液。本实验中使用的麻醉剂为 “鸡尾酒1”（Cocktail 1），其配制方法为：将1.9 ml的100 mg/ml氯胺酮、0.5 ml的100 mg/ml赛拉嗪、0.2 ml的10 mg/ml乙酰丙嗪和2.5 ml生理盐水混合；以及“鸡尾酒2”（Cocktail 2），由1 ml的100 mg/ml氯胺酮和0.1 ml的10 mg/ml乙酰丙嗪组成。注意：可选用吸入式异氟烷或七氟烷，因其可提供更长时间的外科麻醉深度。
    3. 可选地，准备含有药物的制剂，例如脂质乳剂。应进行适当的稳定性研究，以确保制剂在储存和给药期间保持稳定。
      注意：由于淋巴药物转运研究的目的通常是评估药物转运效率与制剂及所用药物之间的关系，因此每次研究中所用制剂和药物的具体性质可能有所不同。
      1. 本研究中代表性实验（见图4和图5）所用制剂的制备方法如前文所述43。简言之，在5.6 ml由磷酸盐缓冲液（pH 6.9）中含5 mM牛磺胆酸钠组成的水相中分散之前，先将14C油酸（2–5 µCi）和卤泛群（200 µg）加入40 mg油酸中。
      2. 对于含有2-单油酸甘油酯的制剂，将7.1 mg的2-单油酸甘油酯与其他组分一同加入水相，与含卤泛群的油酸相同时加入。由于2-单油酸甘油酯相对不稳定且易异构化为1-单油酸甘油酯，因此应在给药前立即配制含该成分的制剂。
      3. 随后在室温下通过超声处理乳化2分钟以形成乳剂。
        注意：如先前所述43，应通过以下方法监测制剂的稳定性：i）在偏振光下目视检查乳剂是否发生相分离；ii）在制备后及给药后立即使用动态光散射法进行粒径分析，以评估是否存在相变或分离；iii）采用经验证的HPLC方法分析卤泛群浓度。
  3. 准备抗凝溶液：含10 mg/ml EDTA的无菌水溶液或含10 IU/ml肝素的生理盐水，用于冲洗淋巴导管；另准备含2.5–10 IU/ml肝素的生理盐水，用于冲洗颈动脉导管。
  4. 准备用于插入肠系膜淋巴管（外径0.8 mm，内径0.5 mm）、颈动脉（外径0.96 mm，内径0.58 mm 或 外径0.8 mm，内径0.5 mm）和十二指肠（外径0.96 mm，内径0.58 mm）的聚乙烯导管。
    1. 将导管剪至所需长度（通常颈动脉和十二指肠导管为25–30 cm，淋巴导管为10–15 cm），并使用无菌外科刀片在导管尖端制作斜面（见图1）。
      注意：此操作可提高导管插入的便利性，并减少插入后导管堵塞的发生率。
    2. 通过将导管的一小段回折形成环状，用打火机或加热板加热定型，然后裁剪至合适尺寸，在十二指肠内导管上制作J形固定点（见图1）。
  5. 将淋巴导管连接至含有抗凝溶液（按步骤1.3配制）的25 G针头和注射器上。用抗凝溶液充满淋巴导管，并将溶液保留在导管中过夜，以减少淋巴采集过程中导管内血栓形成的风险。
  6. 准备用于收集淋巴液和血液样本的试管。预先称量淋巴收集管，标记淋巴和血液样本管，并加入抗凝溶液。加入足量抗凝溶液，使收集的淋巴液或血液中EDTA的终浓度达到1 mg/ml（无菌水配制）或肝素终浓度达到10–20 IU/ml。

2. 手术开始前的即时准备工作

  1. 使用无菌生理盐水或抗凝剂溶液冲洗所有套管，以确保其通畅。
  2. 准备大鼠进行手术。
    注意：在进食过或注射过油剂的大鼠中，肠系膜淋巴管更为清晰可见，因为随着脂质负荷增加，肠系膜淋巴液会变得乳白色且不透明。因此，一些操作者，尤其是刚开始进行该手术的操作者，发现如果在手术开始前0.5–2小时预先给予大鼠油剂（约0.1–1 ml），例如橄榄油或大豆油，会更易于插管肠系膜淋巴管。然而，预先给予油剂会影响淋巴中脂质、亲脂性药物及其他因素的淋巴转运，因此根据实验目的的不同，预先给油可能并非理想选择。
    1. 在整个手术和样本采集期间保持大鼠处于麻醉状态。
      1. 例如，使用连接25 G针头的1 ml注射器，将1.5 ml/kg的 Cocktail I（来自步骤1.2.2）皮下注射至大鼠颈部后方的皮肤皱褶处以诱导麻醉。根据需要，每隔约一小时使用连接25 G针头的1 ml注射器经腹腔注射 0.44 ml/kg的Cocktail 2（来自步骤1.2.2）以维持麻醉。
      2. 在开始手术前，通过观察呼吸频率、胡须运动、肌张力以及对足部夹捏等刺激的反应来确认麻醉深度是否足够。根据需要追加麻醉剂。
    2. 剃除手术区域的毛发，包括用于淋巴管和十二指肠插管的腹部右侧，以及用于颈动脉插管的颈部和左侧锁骨区域。
    3. 使用聚维酮碘溶液或氯己定溶液配合70%乙醇擦拭对手术区域进行无菌清洁。每个区域重复此过程3次，最后用70%乙醇完成最终清洁。
  3. 将动物仰卧置于加热手术垫（37 °C）上方的清洁垫单上。

3. 肠系膜淋巴管插管

  1. 将动物置于其右侧朝向操作者的位置。根据需要，可在手术显微镜下或不使用手术显微镜进行手术。
  2. 使用无菌手术刀片沿中线（剑突）至右侧腹 flank 区域，距肋缘下方约 2 cm 处，做一条长约 4 cm 的直线切口，切开腹壁肌肉的最表层（见图 2B）。
  3. 使用小型手术剪，从距中线外侧 4–5 mm 处开始，沿右侧腹 flank 方向逐层切开腹壁肌肉的其余层次（见图 2B）。
  4. 将小肠向左上方牵拉，并置于左侧腹壁肌肉下方，用 2–3 块浸有生理盐水的无菌纱布覆盖并固定。
  5. 将大鼠背部置于一支水平放置的 10 ml 塑料注射器上，位置与右肾平齐，以利于观察肠系膜淋巴管。
  6. 定位肠系膜上淋巴管：该血管直径约为 0.5–1 mm，垂直于右肾，位于肠系膜动脉的前方且与之平行（肠系膜动脉为一条搏动性的深红色血管；见图 2C）。
    注意：在未禁食或预先给予油脂的大鼠中，该血管呈白色、不透明，较禁食大鼠中更为清晰易见，后者通常呈半透明状。
  7. 检查肠系膜上淋巴管和肠系膜动脉后方区域，判断是否存在第二条较小的副淋巴管。若存在，可通过切断该管并用超级胶水封闭，或在其周围结扎缝线的方式阻断淋巴液流动，以确保所有来自肠道的淋巴液均从肠系膜上淋巴管收集。
  8. 用一对直头镊子穿过右肾下缘的肾周脂肪层，并沿下腔静脉下方的结缔组织层平行于肠系膜上淋巴管方向穿行。
  9. 用镊子尖端夹住淋巴导管，将其从肾周脂肪层中穿过，使导管一端紧邻肠系膜淋巴管，另一端从动物体表右肾水平处引出。
  10. 通过钝性分离法，将肠系膜淋巴管从其上方的结缔组织和脂肪组织中游离出来。操作时注意避免穿破或损伤淋巴管。
  11. 游离淋巴管后，使用显微剪刀、精细镊子的尖端或 25 G 针头在淋巴管壁上制造一个小孔。注意不要完全切断血管。
  12. 确保淋巴导管内完全充满抗凝剂溶液（使用注射器和 25 G 针头灌注），不得留有气泡。借助小型镊子，将导管经小孔插入肠系膜淋巴管内约 2–4 mm。
  13. 观察导管数分钟。若插管成功，可见肠淋巴液从导管游离端逐渐流出。若插管失败，请重复步骤 3.8–3.12。
  14. 若插管成功，可在导管进入淋巴管的入口处滴加少量兽用粘合剂 以固定导管。注意避免使用过多粘合剂导致血管阻塞。
  15. 在等待兽用粘合剂 固化的期间，持续观察淋巴液流动数分钟，确认插管成功。一旦确认成功，小心移除腹腔内的纱布，并将小肠复位至原始解剖位置。
  16. 在导管末端连接含有抗凝剂的淋巴收集管（见步骤 1.6），用于收集自由流出的淋巴液。
  17. 随后，对十二指肠进行插管，以便输注再水化溶液和/或制剂。

4. 十二指肠插管

  1. 将十二指肠插管连接至注射器（例如， 10 ml) 加入复水溶液。
  2. 将十二指肠识别为小肠中呈亮粉红色（血管较多）的部分，轻轻向下牵拉该部分可暴露出胃。
  3. 在胃与十二指肠连接处（幽门）下方约2 cm处，使用无菌23 G针头在十二指肠上刺一个小孔。
  4. 将十二指肠插管的J形钩状末端穿过穿刺孔，用一滴氰基丙烯酸酯胶固定。
  5. 通过将套管连接至装有再水化液体并置于输液泵中的注射器，开始对大鼠进行水化。根据文献，再水化速率为 0.5 - 3 ml/hr15,25.
  6. 完成淋巴管和十二指肠插管后，用缝线闭合腹壁肌肉切口。随后沿切口边缘滴加数滴组织粘合剂（氰基丙烯酸酯），并捏合切口两侧皮肤使其闭合。

5. 颈动脉插管

颈动脉插管可在肠系膜淋巴导管插管之前或之后进行。一些操作者倾向于先进行颈动脉插管，再进行淋巴导管插管，以减少移动动物时可能造成的淋巴插管移位。

  1. 在颈动脉插管上距离斜面尖端2.5 cm处做一标记，以确定插入动脉的管段长度。将插管的另一端连接即， 将（无斜面）导管连接至装有抗凝剂溶液的注射器上的23或25 G针头，并用抗凝剂溶液充满导管，确保无气泡存在。
  2. 为便于插管，将麻醉后的大鼠仰卧放置，颈部伸展，头部朝向操作者。需注意，部分操作者更倾向于让大鼠尾部朝向操作者进行此操作。
  3. 在气管左侧的矢状面上，通过皮肤层做一条 1 - 1.5 cm 的纵向切口。
  4. 使用钝头镊子解剖皮下结缔组织，以暴露下方成对的颈部肌肉。
  5. 收缩颈部肌肉以暴露左侧颈动脉（位于皮肤表面下方约1 cm处，可见搏动）。通过钝性分离清除覆盖在动脉上的结缔组织。
  6. 使用钝头组织镊小心分离约1厘米的动脉节段，注意避免损伤邻近的迷走神经走行路径。操作时，将钝头镊尖端沿动脉两侧垂直开合，以分离动脉周围组织及迷走神经，从而游离动脉。
  7. 用精细镊子将两根丝线缝合线穿入颈动脉下方，并置于分离出的动脉段两端。结扎靠近操作者且远离大鼠心脏和锁骨的那根缝合线图3A).
  8. 通过将一对直头精细镊子置于动脉下方，阻断动脉中的血流图 3B).
  9. 使用精细虹膜剪，在动脉顶部表面（距分离区域顶端约三分之一处）做一个小切口。用肝素化生理盐水冲洗动脉表面溢出的血液，并用棉签轻轻擦拭。
  10. 使用弯头镊子将套管尖端插入动脉。插入后，移除用于阻断血流的直头细镊子，然后用两对镊子将套管向动脉内推进2.5 cm：一对镊子固定套管于动脉内，防止血液回流，另一对镊子用于插入套管。
  11. 使用小动脉夹固定动脉内的套管，移除在步骤5.8中置于动脉下方用于阻断血流的直头精细镊子。
  12. 通过向导管内注入抗凝剂溶液并回抽少量血液，确认导管通畅性图3C然后用抗凝剂溶液冲洗导管，并使用打火机火焰或导管塞封住末端。
  13. 用第5.8步中置于动脉下方的两根缝线将套管固定到位。
  14. 移除动脉夹，并在动脉和导管周围结扎第三根缝线。用缝线缝合颈部伤口。

6. 术后阶段与制剂输注

  1. 继续在麻醉状态下将大鼠置于加热垫上。
  2. 通过向十二指肠灌注再水化溶液，在插管完成后至少0.5小时内对大鼠进行再水化。观察插管后初期淋巴流速下降（约0.1–0.5 ml/hr），随后迅速上升至稳定的基线水平（0.4–2.5 ml/hr，具体取决于再水化速率）。
  3. 恢复期结束后，输注待研究的制剂（含有脂质、药物、 等等。通过插管将药物制剂注入十二指肠。可选地，使用输注泵调节制剂的流速。 注意：在本方案中，动物在整个手术和淋巴液采集期间均保持麻醉状态，并在麻醉下实施安乐死，因此无需额外使用镇痛剂。如果对本方案进行修改并  动物恢复意识后，需给予适当的镇痛处理和术后护理。 
  4. 在完成制剂输注后，继续以1.5–3 ml/hr的速度向十二指肠内输注生理盐水，以防止大鼠脱水。
  5. 继续将大鼠置于37˚C加热的手术垫上以维持体温（同步骤2.3），根据需要通过轻柔向下按压下腹部排出膀胱中的尿液，并每小时重新涂抹一次眼用软膏（同步骤2.2.3）。若动物在术后需恢复意识，建议定期改变其体位。

7. 收集淋巴液和血液样本以评估脂质和药物吸收

  1. 将淋巴液持续收集到含有抗凝剂的试管中。按所需时间间隔更换试管（例如，每小时一次）。
  2. 在设定的时间点采集血样。
    1. 通过将导管靠近封闭端约2 cm处弯曲，以阻断导管内的血流。通过剪去封闭端或移除导管塞来打开导管。
    2. 使用一个空注射器，抽出导管内的肝素化生理盐水，直至血液充满整个导管。
    3. 使用一个新的空注射器，抽取所需体积的血液，并置于含有抗凝剂的试管中。
    4. 使用第一个注射器，将采样前抽出的血液回注，以减少不必要的失血。注射前，将注射器竖直持握并轻弹，确保无气泡进入导管。
    5. 使用一个注射器，将从大鼠体内抽取的血液体积用抗凝剂溶液补充。确保导管内无残留血液可见，否则可能凝固并堵塞导管。
    6. 将导管在未封闭端约2 cm处弯曲，以阻断血流并移除注射器。使用打火机火焰或导管塞重新密封导管。
  3. 完成大鼠血液和淋巴液采集后，通过腹腔注射 euthanize 大鼠，剂量为>100 mg/kg 戊巴比妥钠。
  4. 通过测量每个时间段内收集的淋巴液质量，确定淋巴流速。
  5. 使用高效液相色谱（HPLC）、HPLC-MS 或商用试剂盒等方法，测定淋巴液和血液中药物和脂质的浓度，以评估脂质和药物的吸收效率。
  6. 根据测得的浓度与收集的淋巴液体积的乘积，计算药物和脂质在淋巴液中的质量转运量。

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结果

通过肠给药后利用肠系膜淋巴管插管模型定量测定脂质和药物经淋巴系统转运的累积程度及速率的代表性实验结果如图4和图5所示。在本实验中，将200 µg模型亲脂性药物卤泛群与含40 mg油酸（包括2–5 µCi 14C-油酸）、7.1 mg单油酸甘油酯溶于5.6 ml含5 mM牛磺胆酸钠的磷酸盐缓冲液（pH 6.9）的制剂中，持续2小时给予大鼠十二指肠。制剂给药后，以2.8 ml/hr的速度向十二指肠内输注生理盐水，对大鼠进行再水化。淋巴液连续收集10小时，每小时更换一次收集管。该制剂的配制及实验操作均依据先前报道的方案进行，该方案所用制剂包含所有相同组分，但不含单油酸甘油酯43。

如图4所示，在这些实验条件下，成功插管大鼠的平均淋巴流速为0.4 - 1.3 ml/hr。在部分大鼠中，插管后前1 - 3小时的淋巴流速略低，随后逐渐升高。这在淋巴插管后较为常见。如图4所示，一次失败实验的淋巴流速也包含在图中。在此情...

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讨论

大鼠肠系膜淋巴管插管模型可直接定量分析各种细胞和分子（如脂质和药物）从肠道向淋巴液的转运浓度与速率，以及在不同物质（饮食、抗原、药物、制剂）刺激下这些参数发生的变化。 等等。)10,27 和疾病（癌症、病毒、结肠炎、胰岛素抵抗， 等等。)5-7收集到的淋巴液成分还可用于其他实验。例如，细胞可进行培养44，经分离的脂蛋白以及含有标记物（包括药物、放射性标记物和荧光探针）的淋巴液或其组分（如脂蛋白或细胞）。随后可将这些标记物重新输注至受体动物体内，以更直接地评估其功能、代谢、清除和/或组织分布模式45-47大鼠淋巴管插管模型相较于其他模型具有多项优势 体外, 原位, 计算机模拟，以及 体内 引言中所述的模型。最重要的是，插管法是唯一能够直接获取淋巴液中全部组分体积的方法。由经验丰富的操作者实施时，该模型具有稳健性、可重复性，且实验成功率较高 >80% 的成功率可以实现。然而，该手术技术在初期较难掌握，尤其是在不熟悉该技术的实验室中。

...

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披露

作者无任何利益冲突披露。

致谢

感谢澳大利亚研究理事会（ARC）和国家健康与医学研究理事会（NHMRC）提供的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无菌生理盐水Baxter HealthcareAHB 1307任何品牌均可使用。示例如 Baxter 100 ml 生理盐水袋，每箱 50 袋
70% 乙醇水溶液任何任何品牌均可使用
氯己定葡萄糖酸盐溶液（Microshield 4）利文斯通国际JJ60243L任何品牌均可使用。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&&CAT=6&和；搜索
=JJ60243L
聚维酮碘溶液利文斯通国际BU0510任何品牌均可使用。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&和；搜索
=BU0510
Ilium Ketamil（氯胺酮 100 mg/ml）PROVET 维多利亚 KETA I 1http://www.provet.com.au/
Ilium Xylazil（赛拉嗪 100 mg/ml）PROVET 维多利亚 TRO-3828http://www.provet.com.au/
ACP 10 注射液（乙酰丙嗪 10 mg/ml）PROVET 维多利亚 VTG-DACP010020http://www.provet.com.au/
戊巴比妥钠PROVET 维多利亚 24529任何品牌均可使用，此处示例为 Lethabarb® 325 mg/ml 戊巴比妥钠，Virbac Animal Health。http://www.provet.com.au
肝素（35000 I.U. 溶于 35 mL）Sigma Pharmaceuticals337220http://sigmaco.com.au/
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物Sigma-AldrichE1644任何品牌均可使用。此处示例为 Sigma 公司的 EDTA 二钠盐。 
聚乙烯（PE）导管，外径 0.96 mm × 内径 0.58 mm微管延长装置PE8050任何品牌均可使用。示例为PE导管（0.96 × 0.58 mm，30 m）
聚乙烯（PE）导管，外径 0.8 mm × 内径 0.5 mm微管延伸装置PE9658可使用任意品牌。示例为PE导管（0.8 × 0.5 mm，30 m）
尺子任何任何品牌均可使用
标记物任何任何品牌均可使用
香烟打火机任何任何品牌均可使用
兽医用粘合剂任何任何品牌均可使用
23 号针头利文斯顿国际DN23GX0.75LV任何品牌均可使用。示例如下：Livingstone 一次性针头，无菌，23GX0.75英寸，100支/盒。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&和 CAT=
6&&search=DN23GX0.75LV
25号针头利文斯通国际DN25GX1.0LV任何品牌均可使用。示例如下：Livingstone 一次性针头，无菌，25G×1.0英寸，100支/盒。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&和；搜索=
DN25GX1.0LV
1 ml 注射器利文斯通国际T3SS01TA任何品牌均可使用。示例如下：Terumo 1 ml Slip Tuberculin 注射器，每盒100支。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&和；搜索
T3SS01TA
10 ml 注射器利文斯顿国际T3SS10SA任何品牌均可使用。此处示例为 Terumo 10 ml Slip 注射器，每盒100支。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&和；搜索
T3SS10SA
纱布块利文斯顿国际GSC075任何品牌均可使用，并裁剪至所需尺寸。示例：纱布敷料，棉质填充，7.5 cm × 7.5 cm，8 层。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&和；搜索
GSC075
棉签利文斯顿国际CTAST075DP任何品牌均可使用。示例：Livingstone 棉签塑料双头，75 mm，100 支/包。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&和；搜索
=CTAST075DP
加热垫拉特克WT1任何能够将温度维持在37°C的品牌均可使用。此处示例为Ratek加热板。
手术灯哈佛仪器72-0215 与 72-0267任何品牌均可使用。示例为 Harvard Apparatus V-Lux 1000 冷光源，配备黑色分叉式鹅颈导光管，光纤直径 4.7 mm（每臂）。http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_
-1_HAI_ProductDetail 和  http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_
-1_HAI_ProductDetail___
手术显微镜蔡司495005-0014-000任何品牌均可使用。此处示例为 Zeiss 体视显微镜 Stemi 2000-C，配备 S Double Spot 支架和 KL 300 LED。https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&&i=10143
丝线缝合利文斯通国际DTSK163019F4任何品牌均可使用。此处示例为  

3/8 圆弧反切丝线缝合线 3/0 规格 19 毫米。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&&CAT=6&和；搜索
=DTSK163019F4
手术刀片精细科学工具（FST）10020-00任何品牌均可使用。此处示例为 FST 手术刀片 #20。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
手术刀柄精细科学工具（FST）10004-13任何品牌均可使用。此处示例为 FST 手术刀柄 #4。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1 把小型手术剪刀精细科学工具（FST）14060-09任何品牌均可使用。示例如下：FST精细剪刀，9 cm，21 mm切割刃，尖头，直型。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&&CategoryId=17
2 把带锯齿弯头镊子精细科学工具（FST）11001-13任何品牌均可使用。此处示例为FST 13 cm标准型镊子，带弯曲尖端（2.8×1.4 mm）。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&&CategoryId=32
1 把虹膜剪精细科学工具（FST）15000-08任何品牌均可使用。此处示例为 FST Vannas 弹簧剪刀 - 2.5 mm 刃口，直型。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&&CategoryId=16 
1 把直齿尖镊子精细科学工具（FST）11650-10任何品牌均可使用。此处示例为 FST Graefe 10 cm 直型镊，锯齿状尖端，规格 1 × 0.99 mm。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&&CategoryId=32
1 把带光滑尖直细头的镊子精细科学工具（FST）11251-10任何品牌均可使用。此处示例为FST Dumont #5直头镊，长度11 cm，尖端尺寸0.08 × 0.04 mm。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&&CategoryId=29
1 把带光滑细弯镊尖的镊子精细科学工具（FST）11063-07任何品牌均可使用。此处示例为FST精细镊子（9 cm，光滑尖端，0.4 × 0.3 mm）。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360
2 把止血钳精细科学工具（FST）13010-12任何品牌均可使用。并非所有操作者都会使用止血钳。示例为FST 12 cm显微蚊式止血钳，带20 mm长×1.3 mm宽的直头锯齿状尖端。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&&CategoryId=33
1 个缝合针持针器精细科学工具（FST）12001-13任何品牌均可使用。此处示例为FST 13cm Hasley持针器，其头部长度为16 mm，宽度为1.9 mm。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&&CategoryId=70
1 个动脉夹精细科学工具（FST）18050-28任何品牌均可使用。此处示例为 FST Bulldog Serrefines 直型，长 28 mm，钳口尺寸 9×1.6 mm，中等夹持压力。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&&CategoryId=82
油酸Sigma AldrichO1008必要时可使用任意品牌，此处示例为99%纯度的油酸。http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en®ion=AU
14C-油酸珀金 NEC317050UC 任何品牌均可使用。此处示例为 Oleic Acid, [1-14C]-, 50µCi (1.85 MBq)。http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC
牛磺胆酸钠Sigma AldrichT4009任何品牌均可使用。此处示例为牛磺胆酸钠盐水合物 ≥95%（薄层色谱）. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en&®ion=AU
卤泛群葛兰素史克Halofantrine 由葛兰素史克（Glaxo Smith Kline）慷慨赠予
磷酸二氢钠Sigma Aldrich71507任何品牌均可使用。此处示例为分子生物学用 BioXtra 级磷酸二氢钠一水合物， >99.5%。http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en&®ion=AU
磷酸氢二钠Sigma Aldrich71643任何品牌均可使用。此处示例为分子生物学用BioUltra级磷酸氢二钠二水合物， >99%。http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en&®ion=AU

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