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一种特异性测定颗粒酶B蛋白水解活性的比色法：Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl的水解反应

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DOI：

10.3791/52419

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2014年11月28日

 ,  , 
1Cancer Immunology Program, Peter MacCallum Cancer Centre

本文内容

摘要

我们介绍一种简单、定量的比色法，可特异性地测定人、小鼠或大鼠颗粒酶B（Granzyme B, GzmB）的蛋白水解活性。该方案可轻松适用于其他颗粒酶丝氨酸蛋白酶，通过使用具有相应识别序列的其他合成肽底物进行水解，以测定其蛋白酶活性。

摘要

丝氨酸蛋白酶颗粒酶B（Granzyme B，GzmB）在细胞毒性T淋巴细胞（CTL）或自然杀伤（NK）细胞释放后，可介导靶细胞发生凋亡。GzmB是人类和小鼠中研究最为广泛的颗粒酶，因此研究人员需要特异且可靠的工具来研究其在病理生理过程中的功能与作用。这尤其需要那些不识别在结构或功能上相关的蛋白酶（如caspases或其他颗粒酶）的检测方法。本文采用一种比色法检测，利用GzmB优先切割天冬氨酸残基之后肽键的特性，使用肽硫酯底物Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl。GzmB是唯一能够切割该底物的哺乳动物丝氨酸蛋白酶。该底物可被人、小鼠和大鼠的GzmB以相似的效率切割，而其他市售的肽类底物均不具备这一跨物种通用的特性，即使某些产品宣称适用于此目的。本实验方案以活化的NK细胞或CTL的未分级裂解物为例进行演示，同样适用于多种原核和真核表达系统产生的重组蛋白酶，前提是设置正确的对照。该检测方法是一种高度特异的技术，可用于确定哺乳动物淋巴细胞中细胞毒性分子及其通过多种方法表达的重组对应物所具有的促凋亡活性。

引言

颗粒酶是一类存在于自然杀伤（NK）细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）分泌性溶酶体中的丝氨酸蛋白酶1。人类中有五种不同的颗粒酶（A、B、H、K和M），小鼠中有十种（A-G、K、M和N）2,3。颗粒酶A和颗粒酶B（GzmA、GzmB）含量最为丰富，在人类和啮齿类动物中已被广泛研究。

GzmB 的经典功能是与穿孔素这一成孔蛋白协同作用，诱导靶细胞发生凋亡，穿孔素使颗粒酶能够进入靶细胞的胞质中4。尽管GzmB的表达明确存在于细胞毒性淋巴细胞中，但近年来的研究已开始关注其他多种表达GzmB的细胞类型，包括但不限于角质形成细胞5、嗜碱性粒细胞6、肥大细胞7、浆细胞样树突状细胞8以及B细胞9,10。在此背景下，GzmB的非凋亡功能逐渐被揭示，涵盖参与炎症反应、组织重塑及其他免疫调节特性11-14。

鉴于颗粒酶B（GzmB）的生物学功能比先前所认为的更为广泛，研究人员需要可靠且特异性的检测工具。GzmB的一个优势在于其特异性地切割天冬氨酸残基羧基端的肽键，这一特性在真核生物丝氨酸蛋白酶中是独一无二的15。小鼠、人和大鼠的GzmB在结构上非常相似，但小鼠GzmB的底物特异性在细节上与人和大鼠存在轻微差异16，这意味着某些在末端（P1位）含有天冬氨酸的通用底物可被这三种物种的GzmB高效切割，而其他在P1位上游具有更复杂序列的底物则可能产生差异显著的结果。在过去以及近期的文献中，这一事实已导致对某些实验结果生物学意义的大量混淆和误读，尽管已有严谨控制的动力学研究试图纠正这一状况17。

本文中，我们试图通过两种市售底物——Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl 和 N-乙酰基-Ile-Glu-Pro-Asp-p-硝基苯胺——来说明上述要点。这两种试剂在裂解后确实会生成不同的反应性基团（游离巯基与荧光性游离对硝基苯胺），但这对蛋白水解裂解过程没有任何影响。本方案是对一个非常古老的方案 18的现代改进，有助于研究人员恰当地使用不同的颗粒酶B（GzmB）底物，同时也为检测其他颗粒酶（如GzmA和GzmH）的活性提供了方法学框架。

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方案

注意：脾脏来自6至10周龄的小鼠，所有动物实验均按照彼得·麦卡勒姆癌症中心的动物伦理指南（E486）进行。

1. 样品制备。

  1. 活化小鼠 NK 细胞的制备。
    1. 通过市售试剂盒采用阴性筛选法，从 C57BL/6 或 B6.GrzmB-/-（GzmB 基因敲除）小鼠脾脏的单细胞悬液中分离原代幼稚 NK 细胞。
    2. 按照制造商提供的操作说明进行。简言之，使用针对特定表面标志物的生物素偶联抗体，对 T 细胞、B 细胞、树突状细胞、粒细胞、巨噬细胞和红细胞等“非 NK”细胞进行磁性标记，再利用抗生物素磁珠进行磁分离，以去除“非 NK”细胞。
    3. 将分离得到的 NK 细胞在含有 IL-2（1,000 U/ml）的培养基中培养 5–7 天，细胞密度为 700,000 个细胞/ml，置于 37 °C 的 24 孔板中进行培养。
    4. 或者，可使用活化的 T 细胞19、来自 OT1 T 细胞受体转基因小鼠的原代抗原限制性 CTL20、混合淋巴细胞培养中生成的 CTL21，或活化 NK 细胞的上清液，以测定分泌型 GzmB 的活性19。
  2. 人 NK 细胞系的维持及原代 NK 细胞的分离。
    1. 将人 NK 白血病细胞（YT 细胞）维持在 Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基中，培养基中添加 10% 胎牛血清。或者，从健康供体的外周血中纯化原代 NK 细胞，并在含 IL-2（100 U/ml）的培养基中刺激培养 2–3 天，方法如前所述22。
  3. 细胞裂解液的制备。
    1. 用 PBS（pH 7.4）将细胞洗涤三次，然后重悬于 Nonidet P-40 裂解缓冲液（0.1% NP-40、250 mM NaCl、25 mM Hepes、2.5 mM EDTA）中。理想情况下，用 100 µl 缓冲液裂解至少 5 × 106 个 NK 细胞，或 1 × 107 个 T 细胞。不要添加蛋白酶抑制剂，因为许多蛋白酶抑制剂是丝氨酸蛋白酶的不可逆抑制剂，特别是类胰蛋白酶如 GzmA。将样品置于冰上孵育 20 分钟，然后在微量离心机中以 15,000 × g 离心 10 分钟，沉淀细胞核。弃去核沉淀，将上清液转移至新的离心管中。
  4. 测定裂解液的蛋白浓度。
    1. 选用合适的市售蛋白定量方法，如 Bradford 法或二喹啉甲酸（BCA）法，测定蛋白浓度。确保蛋白浓度至少达到约 2 mg/ml。将裂解液储存于 -20 °C，待用时取出（颗粒酶活性在 -20 °C 可稳定数月）。

2. 颗粒酶B活性检测

  1. 试剂的准备
    1. 将底物（Boc-AAD-S-Bzl 或 Ac-IEPD-pNA）用 DMSO 配制成 10 mM 的储存液（约 5 mg/ml），分装后于 -20 °C 保存。每次使用前新鲜稀释，且每日实验后废弃，因为 Boc-AAD-S-Bzl 在 DMSO 中储存时会部分水解。
    2. 将显色试剂（5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，DTNB）用 DMSO 配制成 250 mM 的储存液（0.09 g/ml），于 -20 °C 保存。每次实验前新鲜稀释。该试剂仅用于含 SBzl 指示基团的底物，不适用于 pNA 类底物。
    3. 每 2–3 周新鲜配制一次缓冲液（0.1 M HEPES，0.05 M MgCl2，pH 7.3）。
  2. 将 DTNB 和合成底物恢复至室温。将底物按 1:16 稀释（例如，100 µl 加入 1.6 ml 缓冲液中），DTNB 按 1:250 稀释（例如，10 µl 加入 2.5 ml 缓冲液中），充分混匀。
  3. 用缓冲液将每个样品的蛋白裂解液至少稀释至 100 µg，终体积为 160 µl。使用多通道移液器将 50 µl 加入“U”型底聚氯乙烯 96 孔板中，每组设三个复孔（约 33.3 µg/孔）。设置“仅缓冲液”对照组（同样设三个复孔）。
  4. 向样品及缓冲液对照组中加入 100 µl 稀释后的 DTNB（使用 Ac-IEPD-pNA 时省略此步骤。
    注意：GzmB 对 Ac-IEPD-pNA 的切割可直接释放荧光性 pNA（图 4B）。
  5. 使用多通道移液器快速向每组复孔中加入 50 µl 稀释后的底物，顺序为先加缓冲液孔，再加阴性对照，最后加预期为阳性的样品。
  6. 将 96 孔板放入酶标仪中。通过微孔板读板仪在 OD 405 nm 处检测 Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl/Ac-IEPD-pNA 的水解情况，以测定 Asp-ase 活性。采用动力学检测程序，共读数 25 次，每次间隔 15 秒（总计约 6 分钟）。
  7. 若酶标仪软件无法生成 Vmax 值，可利用各时间点测得的吸光度值手动计算底物切割速率。

3. 数据分析

注意：生成的数据以最大速度表示，定义为光密度随时间的变化率（mOD/min）。

  1. 分析数据时，确定底物裂解的最大速率，该速率由吸光度变化率计算得出。可使用酶标仪软件自动完成此计算，该软件通常具备此功能选项。
  2. 或者，在查看酶标仪进行动力学检测时生成的吸光度变化动力学曲线后，手动选择形成最陡直线的数据点。对于大多数检测，最大反应速率在检测开始后的前 2 分钟内达到。
  3. 用该直线上的最高 OD 值减去初始 OD 值，再除以对应的时间间隔。将原始数据导入 Microsoft Excel 或 GraphPad 进行统计分析和图形展示。

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结果

Boc-AAD-S-Bzl 底物对颗粒酶B具有特异性

丝氨酸蛋白酶 GzmB 是细胞毒性淋巴细胞（CTL 和 NK 细胞）的主要组成成分，主要负责在靶细胞（如病毒感染细胞或转化细胞）中诱导快速的凋亡性死亡。这主要归因于其对特定蛋白中某些天冬氨酸残基后的切割具有底物偏好性，这一特性与半胱天冬酶（caspases）相似；后者同样切割天冬氨酸残基后的肽键，但属于另一类蛋白酶——半胱氨酸蛋白酶家族15。由于蛋白水解机制的不同，合成底物 AAD-SBzl 不能被任何 caspase 所切割。GzmB 的表达在细胞毒性淋巴细胞活化后被诱导，其酶活性可在这些细胞制备的细胞裂解液中进行检测（图1）。利用颗粒酶基因敲除小鼠模型，我们已证实合成肽底物 Boc-Ala-Ala-Asp（AAD）-硫代苄酯（S-Bzl）可被 GzmB 特异性水解。在 B6 原代 NK 细胞的裂解液中可检测到该合成底物的显著水解活性，而在 B6.GrzmB-/- NK 细胞中则无此活性。作为对照，通过检测 N-α-...

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讨论

历史上，颗粒酶被认为是细胞毒性淋巴细胞（CTL和NK细胞）的关键效应分子，能够诱导靶细胞迅速发生凋亡性死亡。这主要归因于颗粒酶B（GzmB）的作用，它可在天冬氨酸（D）残基位点切割底物分子，从而通过切割前体半胱天冬酶（pro-caspases）以及多个下游靶分子来激活caspase级联反应。然而，目前人们已认识到，GzmB的表达并不局限于淋巴样细胞毒性细胞，其功能可能远远超出对靶细胞的识别和诱导细胞死亡的范畴。

本文描述了一种实验方案，可通过一种简单的比色法检测从小鼠和人源 CTL/NK 细胞裂解物中提取的活化型 GzmB。本研究结果证实了该检测方法的简便性和特异性，因此该方案可推广应用于检测其他来源细胞样本中的 GzmB。然而，必须确保细胞裂解物的蛋白浓度至少达到 2 mg/ml，并在实验设计中包含适当的阳性和阴性对照。Boc-AAD-SBzl 试剂对 GzmB 的特异性可通过 GzmB 基因敲除动物来源裂解物中缺乏底物切割活性得以证实，因其活性完全丧失（图 1）。在今后的研究中，建议使用此类阴性对照（见方案第 1.1 节），以...

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披露

作者无任何披露信息。

致谢

本工作获得了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）向 MH 提供的 HA 6136/1-1 项目资助。JAT 获得了澳大利亚国家卫生与医学研究委员会（National Health and Medical Research Council of Australia）的项目和计划资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Boc-Ala-Ala-Asp-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASMSB05颗粒酶B底物（小鼠和人）
Ac-IEPD-pNA SM Biochemicals LLC, CASMPNA009颗粒酶B底物（仅人源）
N-α-CBZ-L-lysine-S-BzlSigma-AldrichC3647颗粒酶A底物
Suc-Phe-Leu-Phe-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASB025颗粒酶H底物
5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸) Sigma-AldrichD8130DTNB，Ellman’s试剂
NK细胞分离试剂盒II（小鼠）Miltenyi Biotec GmbH130-096-892阴性选择试剂盒
NK细胞分离试剂盒（人源）Miltenyi Biotec GmbH130-092-657阴性选择试剂盒
酶标仪Biorad iMarkBiorad酶标仪管理软件 版本MPM6.3
Serocluster U型底聚氯乙烯96孔板Corning, MA, USA2797

参考文献

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B NK DTNB B

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