方法文章

纯化野生型和突变型CFTR蛋白的功能性重构及通道活性测定

11.9K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/52427

⸱

2015年3月9日

 ,  , 
1Programme in Molecular Structure and Function, Hospital for Sick Children, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Physiology, University of Toronto

本文内容

摘要

本文介绍了一种快速且有效的功能重建方法，可用于重建纯化的野生型和突变型CFTR蛋白，该方法能够保持这种氯离子通道的活性，而CFTR在囊性纤维化中存在功能缺陷。通过CFTR介导的重建蛋白脂质体中的碘离子外流，可研究通道活性以及小分子化合物的作用。

摘要

囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）是ATP结合盒（ABC）转运蛋白超家族中一种独特的成孔通道成员。CFTR的磷酸化依赖性和核苷酸依赖性氯离子通道活性已在全细胞系统以及切除膜片上的单通道中被广泛研究。许多导致囊性纤维化的突变已被证明会改变这种活性。尽管已有少量纯化方案发表，但尚缺乏能够保持通道活性的快速重建方法，以及适用于在纯化体系中研究群体通道活性的合适技术。本文描述了将全长CFTR蛋白快速纯化并功能性重建到具有明确脂质组成的蛋白脂质体中的方法，重建后的CFTR仍保持作为受调控卤素离子通道的活性。该重建方法结合一种基于通量变化的新型通道活性检测手段，构成了一个适用于研究野生型CFTR以及致病突变体F508del-CFTR和G551D-CFTR群体通道特性的理想系统。具体而言，该方法可用于研究磷酸化、核苷酸以及小分子（如增效剂和抑制剂）对CFTR通道活性的直接作用。这些方法也可推广用于研究其他阴离子底物的膜通道或转运蛋白。

引言

在肺、肠、胰腺和汗腺等组织的上皮细胞顶膜上，氯离子的转运主要由囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）介导。CFTR 属于 ABC（ATP 结合盒）膜蛋白家族 C 亚家族（ABCC）的一个成员，其功能受 ATP 和磷酸化的调控（综述见1）。与其他 ABCC 亚家族成员类似，CFTR 是一种大型的多次跨膜整合膜蛋白，可在其核苷酸结合结构域（NBDs）界面处形成的两个核苷酸结合位点上结合 ATP，并在单一活性位点表现出较弱的 ATP 酶活性。然而，与其他 ABCC 亚家族成员不同的是，CFTR 进化为一种独特的受调控氯离子通道，而非主动溶质转运蛋白。

CFTR 基因的突变导致囊性纤维化，这是一种影响多个器官（包括肺、胃肠道、胰腺和生殖道）的疾病，常导致年轻成人患病甚至死亡。肺部疾病通常是囊性纤维化患者早期死亡的主要原因，在大多数情况下，这是由于传导性气道表面上皮细胞中 CFTR 功能的丧失所致。CFTR 氯离子通道活性的缺失导致氯离子（Cl-）和水在表面上皮细胞跨膜转运减少，从而影响纤毛呼吸道上皮细胞顶膜表面液体层的形成。这会导致气道表面液体变得黏稠，妨碍纤毛呼吸道上皮细胞有效清除气道中的病原体。因此，大多数囊性纤维化患者会反复发生肺部感染，并因炎症反应而造成肺组织损伤。

正如预期，针对正常CFTR蛋白作用机制的研究主要集中在其通道门控活性的详细电生理学分析上。单通道研究表明，CFTR可作为蛋白激酶A（PKA）依赖性的氯离子通道发挥作用。- 具有ATP调节门控的通道2详细的电生理学研究为单个CFTR通道提供了大量信息1,3然而，人们可能会担心所研究的某一个特定单通道的特性是否能够代表整个CFTR通道群体的特征，因此在解释单通道实验结果时，应始终结合研究宏观群体的方法进行综合考虑。对纯化CFTR的群体通道活性进行直接检测，有望揭示与致病突变相关的分子缺陷，并推动能够修复突变型CFTR蛋白的化学调节剂的发现。迄今为止，已发现超过1,900种不同的CFTR突变被认为可导致囊性纤维化4主要突变F508del-CFTR在北美和欧洲约90%患者的至少一个等位基因上被发现，可导致蛋白质错误折叠并在内质网中滞留5F508del-CFTR 还具有其他后果，包括通道功能缺陷6-9细胞表面CFTR的缺失与严重疾病相关。G551D-CFTR是一种较为罕见的突变，被认为能够正确折叠，但在细胞表面作为氯离子通道功能失常。6小分子校正剂和增效剂的研发旨在分别校正F508del-CFTR等突变蛋白的折叠和/或转运至细胞表面，并增强如G551D等突变在细胞表面时的通道活性。尽管校正剂VX-809和VX-661尚未获准用于患者，但增效剂Kalydeco（ivacaftor；VX-770）已在囊性纤维化患者中以每12小时150 mg的剂量使用 >6岁及以上、至少携带一个G551D-CFTR突变的患者，以及近期扩展至携带G178R、S549N、S549R、G551S、G1244E、S1251N、S1255P或G1349D突变之一的患者。Kalydeco安全性良好，且可改善囊性纤维化疾病的临床指标10然而，在该小分子获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于患者时，其作用机制尚未被充分阐明。

此前已有数种CFTR纯化方法被报道2,11-18，其中许多方法需要耗费较长时间才能完成。在最近的一项研究中19，报道了一种独特的快速纯化与重组方法，用于在Sf9细胞表达系统中过表达的CFTR蛋白，该方法将纯化的蛋白整合至明确组成的脂质体系中，并据此建立了一种针对CFTR分子群体的CFTR卤素离子通道活性检测方法。该检测方法重现了磷酸化、核苷酸和抑制剂对CFTR功能的已知作用。该体系被用于研究增效剂VX-770/Kalydeco对野生型（Wt-）、F508del-和G551D-CFTR的作用，首次证明该药物可直接与CFTR蛋白相互作用，以ATP非依赖的方式增强其通道活性，从而展示了这些方法在从群体角度研究CFTR及其突变体与核苷酸和小分子相互作用方面的实用性与适用性，可用于回答有关该蛋白的临床相关问题。这些方法还被用于研究其他增效剂分子及其衍生物20，以及小分子校正剂对蛋白活性的影响21。

外排实验此前已在多项研究中用于探究CFTR突变体的活性以及CFTR调节化合物对其活性的影响，包括使用电极、放射性示踪剂和荧光标记物的全细胞检测22,23、利用离子选择性电极的膜囊泡检测24，以及使用放射性示踪剂检测纯化并重建的CFTR蛋白25。然而，使用离子选择性电极研究纯化并重建的CFTR蛋白的方法最近才首次被报道19。本方法的改进版本已被用于铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中两种膜蛋白的重建与功能表征，该菌是一种常见的囊性纤维化致病菌。通过将纯化的外膜蛋白AlgE重建并与碘离子外排测定相结合，支持了该转运蛋白介导阴离子藻酸盐分泌的模型26。对纯化的Wzx蛋白进行重建并开展碘离子外排测定，提出了一个模型，表明该蛋白通过H+依赖的反向转运机制将脂质连接的寡糖跨细菌内膜进行转运27。在这两种情况下，均使用碘离子作为阴离子底物的替代物，尽管其通量低于天然底物可能达到的水平。该方法可能适用于其他具有阳离子转运或传导通路以运输阴离子底物的蛋白质的类似研究。

本文描述了一种快速纯化CFTR蛋白并将其重组到特定脂质的蛋白脂质体中的方法。该快速重组程序可根据需要进行调整，适用于通过其他方法纯化的CFTR蛋白，前提是纯化过程中使用的去垢剂能够通过本文所述方法去除，或可在重组前置换为合适的去垢剂。文中详细介绍了用于检测纯化并重组后的CFTR蛋白通道活性的碘离子外排法，并展示了该方法可获得的一些典型实验结果。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. CFTR 的纯化

注意：有关本实验方案所用仪器和材料的列表，请参见材料与设备表。已有详细方案描述了在Sf9-杆状病毒表达系统中过表达人源野生型CFTR及其突变体的方法17,28。请根据该方案进行CFTR的过表达，并制备Sf9细胞沉淀。

  1. 粗膜制备
    1. 获取来自500 ml培养物的新鲜或已解冻的Sf9细胞沉淀，该细胞通过标准细胞培养方法培养，并过表达带有C端His10-标签的野生型、F508del-或G551D-CFTR蛋白，如先前所述17,28。细胞沉淀体积约为5 ml，湿重约为5 g。
    2. 在4 °C条件下，将Sf9细胞重悬于20 ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4中，其中含有蛋白酶抑制剂混合物（每50 ml加1片），确保样品外观均匀，无细胞团块残留。
    3. 使用高压细胞破碎仪（见材料与设备表），在4 °C下以每次通过至少10,000 psi（优选15,000–20,000 psi）的压力裂解细胞，持续2分钟。裂解过程中保持样品温度为4 °C。
      1. 裂解完成后，将样品收集至冰上预冷的离心管中，立即重新加载至细胞破碎仪中，重复裂解过程共3次。显微镜下检查，确保完整细胞少于10%。
        注：其他裂解方法（如玻璃珠等）在此系统中尚未经过严格验证，但使用者可能发现此类替代方法适用。
    4. 将裂解后的细胞样品在4 °C下以2,000 × g高速离心20分钟。收集上清液，弃去沉淀。将上清液分装至20个离心管中，在台式超速离心机中于4 °C、125,000 × g离心1小时。
    5. 小心移除并弃去上清液，避免扰动沉淀。将沉淀保留在原管中，于-80 °C保存不超过2个月以备后续使用，或置于冰上立即进行纯化。
  2. CFTR的溶解
    1. 取1–4份新鲜或冷冻的Sf9粗膜沉淀，每份在冰上用1 ml缓冲液1（2% fos-choline；完整配方见表1）于4 °C重悬，使用25 G针头和1 ml注射器反复吹打，直至溶液肉眼观察均匀、无可见细胞膜团块。若处理多个沉淀，请平行操作各样品，按以下单个沉淀的操作步骤进行处理，并在步骤1.3.2中合并样品。
    2. 将1片迷你蛋白酶抑制剂片溶解于1 ml缓冲液2（10 mM咪唑；见表1）中，该缓冲液不含fos-choline 14去垢剂（此时蛋白酶抑制剂浓度为推荐稀释浓度的10倍），取100 µl加入重悬的粗膜沉淀中（此时蛋白酶抑制剂为推荐工作浓度）。冰上孵育45–60分钟，每5分钟轻柔颠倒混匀5次。
    3. 将重悬的粗膜沉淀在台式超速离心机中于4 °C、125,000 × g离心25分钟。保留含有可溶性CFTR的上清液，弃去沉淀。
  3. 柱结合、磷酸化与洗脱
    1. 用1 ml不含去垢剂的缓冲液2（10 mM咪唑；见表1）在4 °C下洗涤400 µl镍-NTA（次氮基三乙酸）琼脂糖悬液或等效树脂，以去除溶剂和原有缓冲液。重复洗涤两次。
    2. 将可溶性CFTR、剩余的蛋白酶抑制剂（900 µl）和镍树脂（来自400 µl悬液）用不含额外添加去垢剂的缓冲液2（10 mM咪唑；见表1）定容至总体积10 ml。此步骤中fos-choline 14浓度被有效稀释至0.2%（w/v）。若存在多个样品管，此时应将所有含可溶性CFTR、蛋白酶抑制剂、镍-NTA树脂及0.2%（w/v）fos-choline-14的样品合并。4 °C下轻柔振荡孵育60分钟。
    3. 将CFTR-蛋白酶抑制剂-镍NTA混合液通过小型筛选柱（见表1）或等效空柱。
    4. 用缓冲液3（10 mM咪唑+DDM；见表1）在4 °C下洗涤滞留在柱中的镍NTA树脂，每初始沉淀使用4 ml缓冲液。该缓冲液不含fos-choline 14，但含有1 mM DDM（十二烷基麦芽糖苷去垢剂）。添加DDM去垢剂不会显著改变此缓冲液的pH值。
    5. 在475 µl缓冲液3（10 mM咪唑+DDM；见表1）中加入25 µl MgATP（终浓度5 mM）和2,500 U cAMP依赖性蛋白激酶A催化亚基（PKA），配制PKA-MgATP溶液并加入柱中。用封口帽或Parafilm封闭柱底端，按每初始沉淀加入500 µl PKA-MgATP溶液，进行蛋白磷酸化。
    6. 室温（20 °C）孵育20分钟，每2分钟用1 ml移液器轻柔混匀并重悬树脂，确保PKA与镍NTA树脂整个表面充分接触。
    7. 移除封口，将PKA/MgATP溶液从柱中洗脱。随后在4 °C下用2 ml缓冲液3（10 mM咪唑+DDM；见表1）洗涤柱子。
    8. 将实验所用沉淀数乘以4，得到所需缓冲液4（50 mM咪唑+DDM；见表1）的总体积（单位：ml）。在4 °C下向柱中依次加入4 ml缓冲液，待其流尽后立即加入下一份4 ml，连续洗涤至达到计算总体积。
    9. 按每初始沉淀1 ml的量，分次加入4 °C的缓冲液5（600 mM咪唑+DDM；见表1）进行洗脱，每次1 ml，中间不停顿以防柱床干燥，收集全部洗脱液至同一离心管中，其中含有纯化的CFTR蛋白。
    10. 使用离心过滤装置（100,000分子量截留）如材料与设备表中所述或其他类似装置，将蛋白样品浓缩，以去除咪唑和低分子量降解产物。总共使用10 ml缓冲液6（75 mM KI+DDM；见表1）或其他含1 mM DDM的缓冲液（如非碘化物外排实验可用缓冲液7，25 mM HEPES+DDM；见表1），在2,000 × g、4 °C下离心约20分钟至样品浓缩至200 µl。加缓冲液稀释至10 ml，重复浓缩步骤一次。
      注：根据我们的经验（未发表数据），咪唑会显著抑制CFTR的ATP酶活性，若样品将用于功能测定，应通过至少两次稀释与浓缩步骤在此阶段彻底去除咪唑。
    11. 收集浓缩后的纯化CFTR蛋白。在含DDM的缓冲液中4 °C保存，于1–2天内使用，或立即进入重组步骤。请勿冷冻纯化后的蛋白，因我们观察到其活性会下降。

2. CFTR 的重建

  1. 脂质制备
    注意：CFTR 已成功重建于蛋磷脂酰胆碱（Egg PC）、1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰胆碱（POPC）、Egg PC与POPC按2:1（w/w）比例混合（1:1 w/w）的混合物，或磷脂酰乙醇胺:磷脂酰丝氨酸:磷脂酰胆碱:麦角固醇按5:2:2:1（w/w）比例组成的混合物中。
    1. 进行碘化物外排实验时，在Pyrex或其他坚固（非硼硅酸盐）玻璃试管中，将5 mg卵磷脂PC（200 µl浓度为25 mg/ml的储备液，参见材料与设备表）置于室温下用氩气流吹干20分钟。
    2. 使用280 nm处的吸光度、ELISA检测或其他方法，估算纯化的CFTR蛋白样品的浓度。在进行野生型CFTR的碘离子外排实验时，采用1:300–1:3,000（w/w）的蛋白:脂质比例，以获得足够的信号。对于G551D-和F508del-CFTR，为检测到外排活性，应使用约1:200–1:1,200（w/w）的蛋白:脂质比例。
    3. 为每个特定系统优化蛋白：脂质比例。计算所需纯化蛋白的体积。计算为制备终体积为1 ml、含1 mM DDM的缓冲液体积。 即，1 ml –（所需蛋白溶液的体积）= 缓冲液体积。
      1. 将含有1 mM DDM的所需缓冲体系按计算体积加入干燥的脂质中（此时不要加入CFTR蛋白），并用Parafilm封口膜覆盖玻璃管。对于碘离子外排实验，将脂质重悬于缓冲液6（75 mM KI+DDM；参见 表1）。对于其他实验，用缓冲液8（25 mM HEPES+DDM，见 表1）或含1 mM DDM的其他所需内缓冲液。
      2. 在室温下涡旋2分钟，以助于脂质在DDM缓冲液中悬浮。或者，在涡旋前将样品加热至37 °C 1-2分钟。
    4. 用1 ml注射器和25 G针头在室温下反复悬浮脂质，直至试管壁上无可见脂膜。避免将空气注入溶液中，以免产生细小气泡，促进碘化物和脂质的氧化。
    5. 将覆有帕拉膜的试管中的悬浮脂质在含冰的浴式超声仪中进行20秒超声处理，随后立即转移至冰上静置1分钟。重复该步骤3次。
      注意：剧烈超声会使碘化物溶液因氧化而变黄，因此应避免过度超声。需密切观察样品的颜色变化。若发现颜色改变，应弃去该样品并重新制备。部分碘化物氧化所导致的颜色变化，表明在相同条件下脂质也可能发生氧化。在超声前用氩气置换试管中的空气，有助于防止脂质和碘化物的氧化。剧烈超声可能导致质量较差或有划痕的玻璃试管破裂，造成样品损失。
    6. 将步骤2.1.3中计算出的纯化CFTR体积加入到超声处理的脂质样品中，使最终体积为1 ml。使用25 G针头和1 ml注射器重悬10次，使蛋白质与脂质和去污剂溶液充分混合。
    7. 将脂质和蛋白质样品置于冰上30分钟，每5分钟轻轻涡旋混匀1次，共混匀5次。
  2. 去垢剂结合柱制备
    1. 获取一个一次性商用去垢剂结合旋转柱（见材料与设备表），其体积容量为 1 ml，折断底部标签以启动柱子的流速。
    2. 以2,000 × g离心柱子2分钟，去除保存缓冲液，并弃去该缓冲液。
    3. 加入5 ml缓冲液7（75 mM KI，参见 表1将洗涤缓冲液加入柱中，然后以200 × g离心4分钟以洗脱缓冲液。重复此步骤2次，共进行3次洗涤，以彻底去除储存缓冲液的残留。弃去所有穿流液。
      注意：用于洗涤色谱柱的缓冲液中一定不能含有 DDM 或任何其他去污剂。色谱柱对去污剂的结合能力有限，如果使用含有去污剂的缓冲液，色谱柱将无法有效去除蛋白-脂质-去污剂样品中的去污剂。
    4. 将全部1 ml脂质-去垢剂-蛋白样品小心地分装至层析柱树脂顶部，并在室温下使样品在柱顶孵育2分钟。
    5. 在室温下以2,000 × g离心4分钟，收集浑浊的蛋白脂质体样品至洁净的1.5或2 ml微量离心管或玻璃管中，并将样品置于冰上。
    6. 用200 µl缓冲液7（75 mM KI， 表1）或其他不含去污剂的缓冲液加至柱子顶部，然后重复离心步骤，持续2分钟。
    7. 如果蛋白脂质体样品出现浑浊，将第二次洗脱液加入其中。
    8. 将样品于 4 °C 下过夜保存，或立即用于碘化物外排检测。

3. 纯化并重组CFTR的碘化物外排测量

  1. 在蛋白脂质体膜两侧建立碘化物浓度梯度
    1. 在室温下用缓冲液9（75 mM K-Glu；谷氨酸钾，见表1）预溶胀Sephadex G50凝胶珠（约5 g干胶珠加入50 ml缓冲液），或使用所需的外部缓冲液，至少溶胀2小时，或在4 °C下过夜。
    2. 通过将树脂填充至小层析柱容量的至少¾以上，制备4根饱和于缓冲液9（75 mM K-Glu，见表1）或其他缓冲液的Sephadex G50层析柱。
    3. 以2,000 × g离心4分钟，去除树脂中的过量缓冲液。离心结束后，柱内应保留约2.25 ml的紧密水合树脂。
      注意：树脂应轻微水合，但不应浸没在液体中；后续短暂离心不应洗脱出大量缓冲液。为确保蛋白脂质体样品成功洗脱，柱内树脂既不能过湿也不能过干，操作者可能需要通过实验优化层析柱条件以掌握最佳缓冲液交换状态。
    4. 小心地将125–150 µl蛋白脂质体样品加至每根柱顶部，然后以2,000 × g离心4分钟。
    5. 合并所有蛋白脂质体洗脱液，立即用于碘化物外排实验或其他实验。
      注意：每根柱的洗脱体积应约为150 µl，样品应略显浑浊，但比原始样品更澄清。若洗脱体积过大或洗脱液透明，分别表明柱未充分干燥或过度干燥，均会导致碘化物外排实验失败。
  2. 碘化物外排检测
    1.  用去离子水充分清洗碘离子选择性微电极（材料与设备表），实验前在缓冲液10（15 µM KI，见表1）中孵育20分钟，之后再次用去离子水充分清洗电极。
    2. 在96孔板的一个孔中加入150 µl药物（通常使用20 µM浓度，使检测终浓度为10 µM）或溶剂对照，均溶于缓冲液9（75 mM K-Glu，见表1），并放入微型磁力搅拌子。
      1. 确保无气泡存在。使用移液枪头去除散在气泡。若使用含药物溶液，确保孔中DMSO终浓度低于1%（v/v）（通常为0.1–0.2% v/v）。
    3. 向含药物或缓冲液的孔中加入150 µl在缓冲液9（75 mM K-Glu，见表1）中重构的CFTR蛋白（由第3.1节制备），使孔内总体积达300 µl。
    4. 将96孔板置于磁力搅拌器上，以130 rpm速度搅拌（或以约最大速度的¼进行中等速度搅拌）。
    5. 小心将碘离子选择性电极的探头插入样品孔中，确保探头不接触孔底，也不被搅拌子碰撞。如使用独立参比电极，也应确保其与孔内溶液接触。
    6. 使用自制或商用计算机程序记录电极信号（详见材料与设备表）。采样频率设为2 Hz，并通过低通滤波器对信号进行滤波处理。
    7. 记录过程中让样品平衡5分钟，以获得稳定、平坦或接近平坦的基线。
    8. 向样品中加入3 µl MgATP（用dH2O配制的100 mM母液，用KOH调节pH至7；终浓度为1 mM），以激活蛋白。继续孵育约5分钟，直至达到新的稳定基线。使用前务必调节100 mM MgATP母液的pH至中性，以避免外部缓冲液pH变化。
    9. 向样品中加入3 µl缬氨霉素母液（2 µM；终浓度20 nM），以消除CFTR介导的碘离子选择性电导所产生的膜电位变化。记录至少5分钟内因CFTR介导的碘化物外排活性引起的斜率下降（mV值降低）。
    10. 为验证蛋白脂质体内碘化物的包封是否充分，向样品中加入3 µl 10%（v/v）Triton X-100。若出现显著且立即的碘化物释放，表明脂质体中已包封足够碘化物，因此斜率变化（见3.2.9）的限制因素并非包封效率，而是CFTR介导的活性。
    11. 在样品经药物或Triton X-100处理后，彻底用去离子水清洗电极和搅拌子，确保完全去除这些试剂残留，避免污染下一个样品。
    12. 在缓冲液9（K-Glu缓冲液，见表1）中配制一系列微摩尔至纳摩尔浓度范围的稀释KI溶液。从0开始至最高浓度，依次记录电极对各浓度的mV响应。绘制标准曲线，横坐标为碘离子浓度的对数，纵坐标为探针响应（mV）。利用该标准曲线将外排实验中探针的mV响应转换为释放的碘化物浓度。
      注意：在操作者明确探针响应变化速度前，应每周制备一次校准曲线。探针响应和灵敏度会随时间发生漂移，且随使用时间延长而逐渐下降。定期更换内部填充液，并在使用后用大量水彻底清洗探头，可能部分减缓性能下降，这可能通过减少分子在探针表面的吸附实现。
    13. 对每个蛋白脂质体样品，分别计算在加入MgATP前最后30秒、以及加入缬氨霉素后但加入Triton X-100前的浓度-时间曲线的平均斜率。用缬氨霉素诱导的斜率减去基线斜率，以确定该样品中CFTR介导的碘化物外排活性。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本文描述了纯化、重组以及检测CFTR蛋白调控通道活性的方法。图1a展示了CFTR蛋白的纯化、重组及碘离子外排实验流程。通过碘离子流测定重组和通道活性的方法在相关视频中也有更详细的展示。

CFTR 的纯化及其在蛋白脂质体中的重组

利用含有野生型或突变型CFTR cDNA的重组杆状病毒，可在Sf9细胞中高效表达功能性CFTR蛋白2。尽管该系统并非哺乳动物表达系统，但选择在Sf9细胞中使用杆状病毒系统表达CFTR，是为了确保高水平的蛋白表达。CFTR的产量可高达总细胞蛋白的1%17,28。Sf9-杆状病毒系统的优势在于，蛋白可发生核心糖基化，且该系统的质量控制机制相对宽松，使得CFTR及其突变体能够被转运至细胞表面。本研究在CFTR的羧基末端引入了十个组氨酸标签，以便利用该标签与镍-NTA的亲和性进行纯化。羧基末端的标签有助于防止截短型CFTR蛋白的共纯化，并在ATP酶活性、单通道记录以及碘离子外排实验...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

目前，从多种细胞过表达系统中纯化全长且具有功能的CFTR蛋白的方法较为有限。本文所述方法具有优势，能够快速纯化野生型CFTR（Wt-CFTR），或中等产量地高度富集F508del-和G551D-CFTR突变体蛋白，所得蛋白在多种功能检测中表现出高活性，包括ATP酶活性检测以及通道功能的直接测量，如平面双层膜系统中的单通道记录，以及CFTR群体通道功能的验证性检测，这些检测对于小分子化合物的研究具有高度相关性19-21。该纯化方法已整合到一种快速且高效的重组流程中，但若其他方法所获得的纯化蛋白所使用的去污剂同样易于去除，则也可与本重组流程相兼容。

与从切除的膜片进行复杂且费力的单通道实验相比，本文所述方法能够稳健且直接地评估CFTR通道功能，并且独特之处在于，该方法反映的是大量CFTR通道群体的功能，而非单个或少数几个分子的功能。与涉及膜片的技术不同，该方法可在相关蛋白几乎完全不存在或完全缺失的条件下直接评估小分子调节剂对通道的作用，具体取决于偶联纯化步骤的有效性。

方案中的关键步骤

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者感谢 Mohabir Ramjeesingh 博士在本研究所述纯化方法开发过程中提供的建议。本研究得到了加拿大卫生研究院（CIHR）和加拿大囊性纤维化基金会（CFC）向 C.E.B. 提供的运营资助。P.D.W.E. 的研究部分得到了 CIHR 和 CFC 提供的博士后奖学金资助。作者感谢 R. Bridges 博士（Rosalind 医学与科学大学）提供了校正剂、增效剂和抑制剂化合物，并由囊性纤维化基金会治疗部（CFFT）进行分发。作者还感谢贝勒细胞培养中心（NIH 资助号 P30 CA125123）利用杆状病毒系统表达野生型和突变型 CFTR 蛋白所做出的卓越服务。无活性的 VX-770 类似物 V-09-1188 由 Vertex Pharmaceuticals 公司惠赠。

致谢

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
fos-choline 14 去垢剂Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com)F312Affymetrix: Anatrace 产品；CAS# :77733-28-9
cOmplete 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合片剂Roche (www.roche-applied-science.com)04 693 132 001无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合片剂（每 50 ml 加 1 片，或迷你装：每 10 ml 加 1 片）（Roche Diagnostics GmbH；货号：11873 580 001）
cOmplete ULTRA 片剂，迷你装，无 EDTA，EASYpack Roche (www.roche-applied-science.com)05 892 791 001
Ni-NTA 琼脂糖Qaigen GmbH1018240
Fisherbrand 筛选柱Fisher Healthcare11-387-50
Amicon Ultra 离心滤膜，Ultracel-100KMillipore (www.millipore.com)UFC910008
cAMP 依赖性蛋白激酶 A（PKA）催化亚基New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit)Peirce 公司的 PKA 也适用
PC，鸡卵Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)840051C
POPCAvanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)850457C
PS，猪脑Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)840032CCFTR 已成功重组至卵磷脂 PC、POPC、2:1（w/w）卵磷脂 PC:POPC，或 PE:PS:PC:麦角固醇（5:2:2:1，w/w）的混合脂质中
PE，鸡卵Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)841118C
麦角固醇Sigma (www.sigmaaldrich.com)45480
Pierce 去垢剂去除离心柱Thermo Scientific877791 ml 容量柱
缬氨霉素Sigma (www.sigmaaldrich.com)V-0627
VX-770（艾伐卡托）Selleck ChemicalsS1144
碘离子选择性微电极Lazar 研究实验室 (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam)LIS-146ICM 
 
 
 
 
 
[header]
Clampex 8.1 软件Axon Instruments (www.axon.com)我们使用 ClampX 系统的组件，并配合自制滤光装置来监测和记录电极响应
替代软件：ArrowLabb 系统 Lazar 研究实验室 (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam)LIS-146LICM-XSLazar 研究实验室出售一种可与计算机连接的测量仪及配套软件，用于记录探针响应。 该软件应能实现与我们系统类似的功能
小型搅拌子Big Science Inc (www.stirbars.com)SBM-0502-CMB选择足够小的搅拌子，以便轻松放入 96 孔板的孔中
Sephadex G50，细颗粒GE Health Care (www.gelifesciences.com)17-0042-01
超声破碎仪Laboratory Supplies Co, Inc.G112SP1G其他厂商的水浴超声仪也应适用

参考文献

  1. Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).
  2. Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68 (4), 809-818 (1992).
  3. Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
  4. Genetic Analysis Consortium. , http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html (1989).
  5. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  6. Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).
  7. Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).
  8. Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).
  9. Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).
  10. Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
  11. Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).
  12. Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
  13. Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).
  14. Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).
  15. Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).
  16. Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).
  17. Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
  18. Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
  19. Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).
  20. Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).
  21. Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).
  22. Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).
  23. Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).
  24. Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).
  25. Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).
  26. Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).
  27. Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).
  28. Ramjeesingh, M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. Conn, P. M. , Academic Press. 337-357 (2010).
  29. Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).
  30. Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).
  31. Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).
  32. Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
  33. Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).
  34. Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).
  35. Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).
  36. Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

CFTR CFTR CFTR F508del CFTR G551D CFTR

相关文章