本文介绍了一种快速且有效的功能重建方法，可用于重建纯化的野生型和突变型CFTR蛋白，该方法能够保持这种氯离子通道的活性，而CFTR在囊性纤维化中存在功能缺陷。通过CFTR介导的重建蛋白脂质体中的碘离子外流，可研究通道活性以及小分子化合物的作用。
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本文内容
摘要
摘要
囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）是ATP结合盒（ABC）转运蛋白超家族中一种独特的成孔通道成员。CFTR的磷酸化依赖性和核苷酸依赖性氯离子通道活性已在全细胞系统以及切除膜片上的单通道中被广泛研究。许多导致囊性纤维化的突变已被证明会改变这种活性。尽管已有少量纯化方案发表，但尚缺乏能够保持通道活性的快速重建方法，以及适用于在纯化体系中研究群体通道活性的合适技术。本文描述了将全长CFTR蛋白快速纯化并功能性重建到具有明确脂质组成的蛋白脂质体中的方法，重建后的CFTR仍保持作为受调控卤素离子通道的活性。该重建方法结合一种基于通量变化的新型通道活性检测手段，构成了一个适用于研究野生型CFTR以及致病突变体F508del-CFTR和G551D-CFTR群体通道特性的理想系统。具体而言，该方法可用于研究磷酸化、核苷酸以及小分子（如增效剂和抑制剂）对CFTR通道活性的直接作用。这些方法也可推广用于研究其他阴离子底物的膜通道或转运蛋白。
引言
在肺、肠、胰腺和汗腺等组织的上皮细胞顶膜上，氯离子的转运主要由囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）介导。CFTR 属于 ABC（ATP 结合盒）膜蛋白家族 C 亚家族（ABCC）的一个成员，其功能受 ATP 和磷酸化的调控（综述见1）。与其他 ABCC 亚家族成员类似，CFTR 是一种大型的多次跨膜整合膜蛋白，可在其核苷酸结合结构域（NBDs）界面处形成的两个核苷酸结合位点上结合 ATP，并在单一活性位点表现出较弱的 ATP 酶活性。然而，与其他 ABCC 亚家族成员不同的是，CFTR 进化为一种独特的受调控氯离子通道，而非主动溶质转运蛋白。
CFTR 基因的突变导致囊性纤维化，这是一种影响多个器官（包括肺、胃肠道、胰腺和生殖道）的疾病，常导致年轻成人患病甚至死亡。肺部疾病通常是囊性纤维化患者早期死亡的主要原因，在大多数情况下，这是由于传导性气道表面上皮细胞中 CFTR 功能的丧失所致。CFTR 氯离子通道活性的缺失导致氯离子（Cl-）和水在表面上皮细胞跨膜转运减少，从而影响纤毛呼吸道上皮细胞顶膜表面液体层的形成。这会导致气道表面液体变得黏稠，妨碍纤毛呼吸道上皮细胞有效清除气道中的病原体。因此，大多数囊性纤维化患者会反复发生肺部感染，并因炎症反应而造成肺组织损伤。
正如预期，针对正常CFTR蛋白作用机制的研究主要集中在其通道门控活性的详细电生理学分析上。单通道研究表明，CFT....
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方案
1. CFTR 的纯化
注意：有关本实验方案所用仪器和材料的列表，请参见材料与设备表。已有详细方案描述了在Sf9-杆状病毒表达系统中过表达人源野生型CFTR及其突变体的方法17,28。请根据该方案进行CFTR的过表达，并制备Sf9细胞沉淀。
- 粗膜制备
- 获取来自500 ml培养物的新鲜或已解冻的Sf9细胞沉淀，该细胞通过标准细胞培养方法培养，并过表达带有C端His10-标签的野生型、F508del-或G551D-CFTR蛋白，如先前所述17,28。细胞沉淀体积约为5 ml，湿重约为5 g。
- 在4 °C条件下，将Sf9细胞重悬于20 ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4中，其中含有蛋白酶抑制剂混合物（每50 ml加1片），确保样品外观均匀，无细胞团块残留。
- 使用高压细胞破碎仪（见材料与设备表），在4 °C下以每次通过至少10,000 psi（优选15,000–20,000 psi）的压力裂解细胞，持续2分钟。裂解过程中保持样品温度为4 °C。
- 裂解完成后，将样品收集至冰上预冷的离心管中，立即重新加载至细胞破碎仪中，重复裂解过程共3次。显微镜下检查，确保完整细胞少于10%。
注：其他裂解方法（如玻璃珠等）在....
- 裂解完成后，将样品收集至冰上预冷的离心管中，立即重新加载至细胞破碎仪中，重复裂解过程共3次。显微镜下检查，确保完整细胞少于10%。
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结果
本文描述了纯化、重组以及检测CFTR蛋白调控通道活性的方法。图1a展示了CFTR蛋白的纯化、重组及碘离子外排实验流程。通过碘离子流测定重组和通道活性的方法在相关视频中也有更详细的展示。
CFTR 的纯化及其在蛋白脂质体中的重组
利用含有野生型或突变型CFTR cDNA的重组杆状病毒，可在Sf9细胞中高效表达功能性CFTR蛋白2。尽管该系统并非哺乳动物表达系统，但选择在Sf9细胞中使用杆状病毒系统表达CFTR，是为了确保高水平的蛋白表达。CFTR的产量可高达总细胞蛋白的1%17,28。Sf9-杆状病毒系统的优势在于，蛋白可发生核心糖基化，且该系统的质量控制机制相对宽松，使得CFTR及其突变体能够被转运至细胞表面。本研究在CFTR的羧基末端引入了十个组氨酸标签，以便利用该标签与镍-NTA的亲和性进行纯化。羧基末端的标签有助于防止截短型CFTR蛋白的共纯化，并在ATP酶活性、单通道记录以及碘离子外排实验.......
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讨论
目前，从多种细胞过表达系统中纯化全长且具有功能的CFTR蛋白的方法较为有限。本文所述方法具有优势，能够快速纯化野生型CFTR（Wt-CFTR），或中等产量地高度富集F508del-和G551D-CFTR突变体蛋白，所得蛋白在多种功能检测中表现出高活性，包括ATP酶活性检测以及通道功能的直接测量，如平面双层膜系统中的单通道记录，以及CFTR群体通道功能的验证性检测，这些检测对于小分子化合物的研究具有高度相关性19-21。该纯化方法已整合到一种快速且高效的重组流程中，但若其他方法所获得的纯化蛋白所使用的去污剂同样易于去除，则也可与本重组流程相兼容。
与从切除的膜片进行复杂且费力的单通道实验相比，本文所述方法能够稳健且直接地评估CFTR通道功能，并且独特之处在于，该方法反映的是大量CFTR通道群体的功能，而非单个或少数几个分子的功能。与涉及膜片的技术不同，该方法可在相关蛋白几乎完全不存在或完全缺失的条件下直接评估小分子调节剂对通道的作用，具体取决于偶联纯化步骤的有效性。
方案中的关键步骤
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披露
作者感谢 Mohabir Ramjeesingh 博士在本研究所述纯化方法开发过程中提供的建议。本研究得到了加拿大卫生研究院（CIHR）和加拿大囊性纤维化基金会（CFC）向 C.E.B. 提供的运营资助。P.D.W.E. 的研究部分得到了 CIHR 和 CFC 提供的博士后奖学金资助。作者感谢 R. Bridges 博士（Rosalind 医学与科学大学）提供了校正剂、增效剂和抑制剂化合物，并由囊性纤维化基金会治疗部（CFFT）进行分发。作者还感谢贝勒细胞培养中心（NIH 资助号 P30 CA125123）利用杆状病毒系统表达野生型和突变型 CFTR 蛋白所做出的卓越服务。无活性的 VX-770 类似物 V-09-1188 由 Vertex Pharmaceuticals 公司惠赠。
致谢
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| fos-choline 14 去垢剂 | Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) | F312 | Affymetrix: Anatrace 产品；CAS# :77733-28-9 |
| cOmplete 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合片剂 | Roche (www.roche-applied-science.com) | 04 693 132 001 | 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合片剂（每 50 ml 加 1 片，或迷你装：每 10 ml 加 1 片）（Roche Diagnostics GmbH；货号：11873 580 001） |
| cOmplete ULTRA 片剂，迷你装，无 EDTA，EASYpack | Roche (www.roche-applied-science.com) | 05 892 791 001 | |
| Ni-NTA 琼脂糖 | Qaigen GmbH | 1018240 | |
| Fisherbrand 筛选柱 | Fisher Healthcare | 11-387-50 | |
| Amicon Ultra 离心滤膜，Ultracel-100K | Millipore (www.millipore.com) | UFC910008 | |
| cAMP 依赖性蛋白激酶 A（PKA）催化亚基 | New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) | Peirce 公司的 PKA 也适用 | |
| PC，鸡卵 | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840051C | |
| POPC | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 850457C | |
| PS，猪脑 | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 840032C | CFTR 已成功重组至卵磷脂 PC、POPC、2:1（w/w）卵磷脂 PC:POPC，或 PE:PS:PC:麦角固醇（5:2:2:1，w/w）的混合脂质中 |
| PE，鸡卵 | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 841118C | |
| 麦角固醇 | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 45480 | |
| Pierce 去垢剂去除离心柱 | Thermo Scientific | 87779 | 1 ml 容量柱 |
| 缬氨霉素 | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | V-0627 | |
| VX-770（艾伐卡托） | Selleck Chemicals | S1144 | |
| 碘离子选择性微电极 | Lazar 研究实验室 (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) | LIS-146ICM | |
| [header] | |||
| Clampex 8.1 软件 | Axon Instruments (www.axon.com) | 我们使用 ClampX 系统的组件，并配合自制滤光装置来监测和记录电极响应 | |
| 替代软件：ArrowLabb 系统 | Lazar 研究实验室 (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) | LIS-146LICM-XS | Lazar 研究实验室出售一种可与计算机连接的测量仪及配套软件，用于记录探针响应。 该软件应能实现与我们系统类似的功能 |
| 小型搅拌子 | Big Science Inc (www.stirbars.com) | SBM-0502-CMB | 选择足够小的搅拌子，以便轻松放入 96 孔板的孔中 |
| Sephadex G50，细颗粒 | GE Health Care (www.gelifesciences.com) | 17-0042-01 | |
| 超声破碎仪 | Laboratory Supplies Co, Inc. | G112SP1G | 其他厂商的水浴超声仪也应适用 |
参考文献
- Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).
- Bear, C. E., et al.
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