一种可注射且载药的超分子水凝胶用于猪心脏的局部导管注射

摘要

基于脲基-嘧啶酮的超分子水凝胶剂可通过pH值完全调控其宏观凝胶性能及溶胶-凝胶转换行为。本文介绍了一种通过导管递送系统配制并注射此类超分子水凝胶剂的实验方案，用于直接在猪心脏的相关区域进行局部递送。

摘要

再生丢失的心肌是未来治疗的重要目标，原因在于慢性缺血性心力衰竭的发生率日益增加，而供体心脏的获取极为有限。一种恢复心脏功能的治疗方法示例是通过水凝胶实现药物和生物活性物质的局部递送。本文介绍了一种方法，使用长而柔韧的导管，以无创且靶向特定心壁区域的方式，将载药水凝胶注射至猪心脏。通过三维电机械标测并结合导管注射技术，可实现对心肌的侧壁特异性治疗。为提供与该导管兼容的水凝胶，本研究采用了一种超分子水凝胶，因其可在环境刺激下方便地在凝胶态与溶液态之间转换。在碱性pH条件下，尿嘧啶-嘧啶酮修饰的聚乙二醇表现为牛顿流体，易于注射；而在生理pH条件下，该溶液迅速转变为凝胶态。这种温和的相变条件有利于将生物活性药物及其他生物活性物质（如生长因子和外泌体）包载其中，本文中我们在体外和体内均展示了这一应用 体外 和 体内 实验。该 体外 实验可预先提供凝胶稳定性和药物释放情况的初步指示，从而在后续应用前对凝胶及释放特性进行优化调整 体内 这种组合可实现对所用生物活性化合物、物种及注射系统的凝胶进行最佳优化调节。

引言

尽管急性心肌梗死的治疗已显著提高了患者的生存率，但慢性缺血性心力衰竭仍是随着人口老龄化而日益严重的重要公共卫生问题。目前美国约有600万心力衰竭患者，预计到2030年患病率将增加约25%^1,2。心肌组织的初始丧失会导致心脏重构，最终引发慢性心力衰竭。除心脏移植外，目前尚无真正有效的治疗方法可用于这一患者群体。供体心脏日益短缺的问题凸显了开发新型有效疗法以逆转心脏重构过程的迫切需求。因此，未来治疗的一个重要目标是实现受损心肌的再生。

水凝胶因其具有生物相容性以及对外部刺激的敏感性，在再生医学领域中是一类具有吸引力的材料³。与非可注射型水凝胶相比，可注射型水凝胶在微创手术中的应用具有优势⁴。由于可在生理条件下实现状态转换⁵，这些可注射水凝胶能够通过注射器施用，并原则上允许采用基于导管的注射方式⁶。针对可注射材料已发展出多种策略，包括注射后发生化学交联，或通过温度、pH值以及剪切稀化行为实现物理交联^4,7,8。尽管已有多个体系表现出可通过注射器轻松注射的特性^9,10，但真正实现完全兼容导管的案例仍不多见⁶。

由超分子聚合物制备的水凝胶通过非共价相互作用形成，可利用环境刺激方便地在凝胶态与溶液态之间相互转换¹¹。此外，低分子量前体具有良好的可加工性^12,13。由于相变所需条件温和，可加入多种生物活性成分，例如通常难以处理的生长因子。

基于聚乙二醇（PEG）且末端修饰有脲基嘧啶酮（UPy）基团的水相超分子瞬态网络¹⁴已展现出非共价相互作用在生物医学应用中的优势，并已被用作心脏⁶和肾包膜下¹⁵的药物递送系统。这些网络由烷基间隔基将UPy基团屏蔽于水环境之外，形成疏水微区，进而通过UPy基团的二聚作用构建而成。尿素氢键促进了这些二聚体进一步堆叠形成纳米纤维。由于UPy-UPy二聚体具有可逆相互作用，可通过pH值和温度等刺激实现溶液与凝胶之间的转换。采用合成结构单元可对分子及凝胶性能进行设计，例如调节PEG链和烷基间隔基的长度^14,16。

此外，通过在注射前将超分子水凝胶剂溶液与药物或生物活性物质（如生长因子或外泌体）简单混合，即可掺入多种生物活性成分。外泌体是含有胞质衍生物的小型膜性囊泡，由多种细胞分泌，参与细胞间通讯。研究表明，源自心肌细胞前体细胞的外泌体可能在心脏保护中发挥重要作用¹⁷。

此处，我们描述了制剂的制备方案，以及 体内 心肌注射此类生物活性超分子水凝胶。 体外 实验描述了可预先指示凝胶稳定性和药物释放特性的方法，从而可在应用前调节凝胶及释放特性 体内

方案

注意：所有 体内 实验均按照 实验动物护理和使用的指南 由实验动物资源研究所规定。实验已获得荷兰乌得勒支大学医学院动物实验委员会批准。

1. 水凝胶的制备

1. 配制1 ml 10 wt%凝胶时，将100 mg UPy-水凝胶剂加入小瓶中，加入900 μl pH 11.7的PBS，在70 °C下使用磁力搅拌器搅拌1小时使其溶解。随后将黏稠溶液冷却至室温，此时溶液pH应约为9.0。该溶液可保存数天。
2. 将溶于中性PBS中的适量药物或生物分子用移液器加入上述黏稠溶液中，搅拌10分钟以实现均匀分布。若溶液过于黏稠，可用热水短暂加热。
3. 将溶液置于紫外灯下照射1小时以进行灭菌。

2. 水凝胶分析

1. 溶液的流变学评估
   1. 在装载凝胶之前，将25 mm的平板-平板几何结构安装在流变仪上，设定温度为20 °C，并在平板上加载水以防止测量过程中凝胶蒸发。
   2. 用移液器将300 μl溶液转移至保持在20 °C的流变仪25 mm平板-平板几何结构上，降低平板至0.5 mm的间隙距离。
   3. 记录剪切粘度随剪切应力从0.1至500 Pa的变化关系，每十倍频程采集10个数据点。
2. 凝胶的流变学评估
   1. 用移液器将300 μl溶液转移至平板上，并在溶液不同位置共加入4.2 μl的1 M HCl以诱导凝胶形成。
   2. 将平板降低至0.5 mm的间隙距离，使凝胶固化约30分钟。在此固化过程中，于低频率和低应变条件下（例如分别为1 rad/sec和0.5%）测量储能模量和损耗模量。
   3. 凝胶固化后（约30分钟后），记录储能模量和损耗模量随频率（0.1–100 rad/sec）的变化，随后记录其随应变（0.1–1,000%）的变化。

3. 侵蚀与释放实验

1. 将含有药物或生物分子的黏性溶液100 µl转移至聚对苯二甲酸乙二醇酯（poly(ethylene terephthalate)）悬挂式细胞培养插件中，该插件用于24孔板，孔径为8.0 µm。为防止聚合物溶液在液态时泄漏，用Parafilm覆盖插件底部（图2A）。
2. 随后立即用移液器将1.4 µl的1 M HCl加至黏性溶液表面，使pH降低至约7.0–7.2，并让凝胶在插件内固化约30分钟。
3. 从插件上移除Parafilm，将插件放入24孔板中，并在孔中加入800 µl pH 7.4的PBS。将板置于37 °C孵育，同时进行缓慢摇动或振荡。为防止溶剂蒸发，在其余空孔中加入PBS，并用Parafilm密封24孔板（图2B）。
4. 定期更换PBS，并分析所移除的PBS中释放的UPy降解产物或药物/生物分子。
   1. 通过分别在265 nm或320 nm处测定紫外吸光度来定量UPy降解产物或吡非尼酮。对于荧光蛋白mRuby2，在559 nm激发后检测587 nm处的荧光发射。
   2. 利用预先测定的标准曲线将测得的吸光度/荧光发射值转换为浓度。
      1. 配制一系列已知浓度的分析物缓冲液溶液，测定其紫外吸光度或荧光发射值，绘制标准曲线。使用线性函数对数据进行插值，以确定未知样品的浓度。对于非荧光蛋白，采用ELISA检测⁶。

4. 通过导管进行局部注射

1. 心肌梗死的诱导
   1. 禁食12小时后（饮水除外），在猪的圈舍内通过肌肉注射给予咪达唑仑0.4 mg/kg、氯胺酮10 mg/kg和阿托品0.014 mg/kg，使其镇静。
   2. 静脉注射硫喷妥钠5 mg/kg以诱导麻醉，并插入气管导管进行气管插管。在转运动物至手术室过程中，必要时以12次/分钟的频率进行球囊通气。
   3. 到达手术室后，立即开始机械正压通气，吸入氧浓度（FiO₂）为0.50，潮气量为10 ml/kg，呼吸频率为12次/分钟，并持续进行呼气末二氧化碳监测。使用兽用眼膏涂抹眼睛，防止角膜干燥。
   4. 通过持续静脉输注咪达唑仑0.5 mg/kg/hr、舒芬太尼2.5 µg/kg/hr和泮库溴铵0.1 mg/kg/hr，维持平衡麻醉。为确保麻醉效果，需持续监测心电图（ECG）、动脉血压、体温和呼气末二氧化碳。
   5. 静脉输注胺碘酮4.3 mg/kg，并使用静脉鞘管¹⁸将心内除颤导管置入右心室。
   6. 根据先前描述的方案¹⁸，通过冠状动脉内球囊阻塞法，于第二对角支远端闭塞左前降支动脉（LAD）90分钟。
2. 电机械标测
   1. 心肌梗死后四周，规划标测操作流程。在导管室中准备系统（图4），用于左心室的三维电机械标测（EMM）。该系统可在无需透视引导的情况下识别存活心肌、冬眠心肌及梗死心肌。为构建此类电机械图，需利用超低磁场能量源和带传感器的导管^19,20，在左心室心内膜表面多个位置采集一系列数据点 。
   2. 按照步骤4.1.1–4.1.4的方案对猪进行麻醉。
   3. 将体外参考贴片置于猪背部。
   4. 根据既定方案¹⁸建立血管通路（股动脉）。
   5. 获取右前斜25°（RAO）和左前斜40°（LA）双平面左心室造影图像，以评估左心室大小后，给予肝素75 U/kg。
   6. 在透视引导下，将8F标测导管（D型或F型弯头）送至降主动脉、主动脉弓，并穿过主动脉瓣进入左心室（LV）。
   7. 将导管头端指向左心室心尖部，采集第一个数据点，随后依次采集流出道、侧壁和后壁的数据点，形成三维轮廓，界定心室边界。
   8. 通过在心内膜表面拖动标测导管，并在导管头端与心内膜接触时逐次采集其位置信息^21,22，继续获取后续数据点，直至所有心内膜节段均被采样。
   9. 确定目标区域，即电活动（接近）正常但机械运动受损的区域，即所谓的冬眠心肌（图6）。
3. 心肌内注射
   1. 将标测导管更换为心肌内注射导管，该导管由一根27G针头和位于8F导管内部的中心管腔组成（图5A和B）。为精确输送特定剂量，使用容积刻度注射器抽取约2 ml水凝胶溶液，并将其装入注射泵中。
   2. 调节针头伸出角度为0°和90°弯曲，注入0.1 ml水凝胶溶液以填充针头死腔。随后将注射导管头端穿过主动脉瓣，进入目标区域。
   3. 在步骤4.2.9确定的目标区域内选择注射位点时，需满足以下条件：（1）导管与左心室壁呈垂直位置；（2）良好的环路稳定性（由EMM系统计算，<4 mm）；（3）基础电压>6.9 mV²¹。
      1. 将针头刺入心肌，（4）通过左心室出现室性早搏确认位置正确，随后使用注射泵以约0.4–0.5 ml/min的恒定速率推注0.1–0.3 ml水凝胶。尽可能广泛地在6–10个不同位置重复此操作。注射后，组织的自然pH值将中和溶液，从而形成水凝胶。
4. 处死动物
   1. 操作结束后，通过放血法人道处死动物。切开下腔静脉，使用吸引装置清除血液。将9 V电池置于心尖部，诱发心室颤动。

结果

溶液和凝胶的振荡流变学测量所得的典型结果如图1所示。为了通过长导管进行注射，理想情况是使用低黏度的牛顿流体。黏度随剪切速率的变化而测量，结果显示在pH 8.5时溶液表现出剪切稀化特性，而在pH 9.0和9.5时，溶液表现为牛顿流体，其黏度分别为恒定的0.54和0.36 Pa·sec（图1A）。样品中和后，表现出类固体行为，表现为储能模量G′大于损耗模量G″，因此tanδ = G″/G′ <1（图1B）。凝胶在30分钟内达到最终强度。振荡流变学测量显示典型的类固体响应，其中G′几乎不随角频率变化，且在所有测量频率下均满足G′ >G″（图1C）。

作为药物递送系统使用的关键在于水凝胶随时间推移发生的侵蚀。超分子相互作用本质上具有动态性，可实现凝胶的缓慢侵蚀。 体外. 侵蚀与释放实验在以下条件下进行 37 °C 使用多孔小室插件（图2A 和 B通过调节疏水和亲水嵌段的长度¹⁴，可获得一种在数周内逐渐降解的凝胶（图 3A）。该凝胶在2周内降解25%，其中第一天初始降解达10%，推测是由于水凝胶最初的溶胀所致。例如，研究了小分子药物（吡非尼酮）和模型荧光蛋白（mRuby2）的释放行为。使用荧光模型蛋白可实现简便的检测读出；然而 体外 也可使用ELISA对其他蛋白质进行释放实验的定量分析⁶小分子药物在一天内释放，而蛋白质等大分子则在一周内逐渐释放（图3B). 将 mRuby2 释放曲线拟合至 60% 释放量，采用半经验 Korsmeyer-Peppas 模型分析，表明释放机制为扩散（n = 0.44）²³. (经修正的) Korsmeyer-Peppas 模型中无偏移表明 mRuby2 不存在突释现象²⁴由于吡非尼酮在释放量低于60%时的数据点数量有限，未对该释放曲线进行拟合。

导管导航系统由通信单元控制台、工作站（图4）、三角定位垫（产生低磁场）及外部参考贴片，以及两根导管（带传感器头端的标测导管和注射导管）（图5）组成。

在后处理分析滤除不稳定点后，左心室的心内膜三维重建图像会随着每个新数据点的采集而实时更新，并以分级颜色标尺连续显示单极和双极电压电位（图6A）。局部线性缩短（LLS）功能通过计算在收缩末期和舒张末期采样点与其相邻点之间距离的平均变化，来量化局部室壁运动。每个节段的平均电压和LLS值被计算出来，并显示在极坐标图中（图6B）。异常或低单极电位（≤6 mV）以及机械活动受损（LLS ≤4%）的存在，是梗死区域的特征²²。

图 1:. 溶液与凝胶的流变学评估。 (A) 不同 pH 值下溶液的粘度随剪切速率的变化关系。在 pH 8.5 时观察到剪切稀化现象，而在 pH 9.0 和 9.5 时粘度保持恒定，表现出这些溶液的牛顿流体行为。(B) 通过绘制 tan δ 随时间的变化来监测凝胶固化过程。(C) 中和样品在固化 2 小时后的频率扫描结果。误差棒表示三次独立测量的标准偏差，反映了典型的实验误差。

图 2：降解与释放实验装置。（A）聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）培养板小室，表面覆盖帕拉菲尔膜（Parafilm），以防止制备过程中泄漏。（B）含小室的24孔板，用帕拉菲尔膜包裹以防止溶剂蒸发。

图3：侵蚀与释放。（A）水凝胶随时间的侵蚀情况。观察到凝胶在至少两周内逐渐侵蚀。（B）小分子药物和模型蛋白的释放情况。小分子在一天内即释放完毕，而模型蛋白则在一周内逐渐释放，且无明显的突释现象。实线表示Korsmeyer-Peppas模型对释放初期阶段的拟合结果。

图 4：导管导航系统。配备 NOGA XP 心脏导航系统的通信单元控制台。

图 5：（A）连接注射器的心肌内注射导管。（B）注射针头细节。

图6：单极电压与左室收缩同步性（LLS）标测图。（A）单极标测图，左前斜位（LAO）视图（上）和牛眼图（下）。红色表示心肌基底部单极电压值较低（正常），提示后外侧电活动消失；蓝色表示正常心肌，而绿色和黄色表示心肌存活性降低。（B）LLS标测图，左前斜位（LAO）视图（上）和牛眼图（下）。红色表示后外侧壁无收缩，绿色和黄色表示室壁运动减弱。白色圆点表示标测点。白色实线勾画出感兴趣区域，其特征为单极电压降低和室壁运动异常。棕色点表示注射位点。

讨论

一个关键挑战是在确保溶液与生物活性化合物相容的同时，使其能够通过长导管注射。尽管提高pH值有助于增强可注射性，但生长因子等生物活性化合物属于脆弱分子，需谨慎处理。在加入凝胶剂后，我们使用pH计密切监测溶液pH值，确保在添加任何生物活性成分前pH达到9.0。最初，需多次调整PBS的起始pH值，才能获得理想的最终pH值。此外，由于我们使用的是相对黏稠的溶液和细长导管，存在较大的压力降（约0.5 MPa，取决于注射速度）。因此，在选择注射器与导管之间的连接件时需格外谨慎。采用注射泵可实现可控注射，因为手动施加如此大的力较为困难。对于 体外 实验中，通过使用 HCl 中和溶液使溶液凝胶化，而 体内 这是由组织的天然pH值决定的。因此，必须加入适量的HCl，以防止pH值过度下降。该酸的扩散可能是水凝胶在凝胶化过程中限速的因素 体外 实验；然而， 体内 液体与中和组织具有较大的接触表面积，相比逐滴加入浓酸，更有可能实现更快且更均匀的凝胶化。此外，与先前使用的方法相比，该温和操作下的凝胶转换速度显著加快（0.5 小时 vs 2 小时）。²⁵利用人体的天然pH值来切换材料性能具有很大吸引力，因为这种转变迅速、可逆，且不会在导管内部发生 体内 全自动。这些特性使其相较于 例如 热致开关型凝胶²⁶，当导管内因温度变化存在凝胶化风险时，需要光诱导聚合的凝胶会面临挑战，原因是光穿透有限且自由基生成困难²⁷，或需要共注射聚合引发剂或加速剂的凝胶²⁸.

药物从水凝胶中的成功释放很大程度上取决于药物的大小。如图所示，小分子药物会立即释放，而模型蛋白在一周内的逐步释放则表明这类水凝胶作为生长因子递送系统具有良好的应用前景。总体而言，水凝胶作为蛋白质、外泌体和细胞等较大分子或颗粒的递送工具更具潜力^29,30。

三维电生理标测与注射技术提供了一种经过临床验证的、基于导管的心肌再生治疗递送方法，适用于水凝胶等多种治疗手段。与其它非手术递送技术相比，该技术的优势在于可进行治疗前规划，能够区分正常心肌、梗死心肌与冬眠心肌，并引导治疗靶向目标区域。该方法的局限性在于操作所需的技术水平较高，且 procedure 耗时较长、成本较高²⁰在本研究的猪心肌梗死模型中，通过电机械标测引导，将具有生物活性的超分子UPy-水凝胶注射至心肌内。其他与再生疗法的联合应用仍有待进一步测试。 体外 和 体内 在这一新兴领域取得更大成功。此外，还需优化注射性能和灭菌工艺，以成功将该方法转化为临床应用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 M HCl
1 M NaOH
聚苯乙烯 24 孔板	Falcon	353047
胺碘酮	Cordaron I.V. (Sanofini)
安东帕 Physica MCR501	安东帕有限公司		配备平行板几何结构（25 mm）
阿托品	PCH
球囊呼吸机
Cary 50 Scan 紫外-可见分光光度计	Varian
Cary Eclipse 荧光分光光度计	Varian
除颤贴片
DMSO	Biosolve	44705
气管插管	Covidien
肝素
氯胺酮	Narketan 10 Vétoquinol
标测导管 115 cm	Biosense Webster
咪达唑仑	Actavis
MilliQ	MD Milipore MilliQ 综合型水净化系统
mRuby2
0.9% 氯化钠溶液 500 cc	Braun
NOGA 引导 Myostar 注射导管	Biosense Webster
NOGA-RefStar EFO-贴片	Biosense Webster
泮库溴铵
Parafilm 封口膜	VWR	IKAA3801100
PBS	Sigma Aldrich	P4417
PET 微孔滤膜	Millipore	PIEP12R48
吡非尼酮	Sigma Aldrich	P2116	使用浓度为 100 mM 的 DMSO 储存液
硫喷妥钠	Inresa
舒芬太尼	Sufentanil-Hameln
Tegaderm 敷料
UPy-PEG10k
紫外灯
兽用软膏
Visipaque 造影剂 100 cc