双光子成像技术观察小鼠脊髓中的细胞动态

摘要

一种用于小鼠脊髓成像的新型ex vivo制备方法。该方案可实现对整个脊髓内活细胞相互作用的双光子成像。

摘要

双光子（2P）显微技术被用于揭示活体完整组织深层的细胞动态及其相互作用。本文介绍一种在小鼠脊髓中进行活细胞成像的方法。该技术特别适用于分析神经前体细胞（NPC）在移植后，于发生神经炎症性脱髓鞘疾病脊髓中的动态行为。移植的NPC可迁移至轴突损伤部位，增殖并分化为少突胶质细胞，直接参与髓鞘再形成，因此在治疗慢性脱髓鞘疾病方面具有良好的治疗前景。由于移植的NPC会迁移至脊髓腹侧的损伤区域，传统的活体双光子成像难以实现，以往仅能通过组织化学染色方法获得静态相互作用的信息。尽管本方法最初旨在对脊髓腹侧移植的NPC进行成像，但它也可广泛应用于整个脊髓中移植细胞及内源性细胞的多种研究。本文中，我们展示了对表达增强型黄色荧光蛋白的轴突以及表达增强型绿色荧光蛋白的移植NPC的脊髓样本进行制备与成像的全过程。

引言

脱髓鞘疾病的小鼠模型，包括实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）和神经适应性小鼠肝炎病毒（MHV）颅内感染，是研究与疾病相关的分子通路和细胞相互作用的优秀工具。这些模型已推动并支持了美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物疗法的有效性，主要靶向抑制自身免疫和炎症反应¹。然而，一旦内源性再髓鞘化失败，目前获批的疗法无法有效修复中枢神经系统中的脱髓鞘病灶。因此，在疾病这一阶段，以修复为导向的治疗对于缓解慢性症状和改善生活质量至关重要。近年来，神经前体细胞（NPCs）作为一种潜在的再生治疗手段，逐渐成为研究热点，可用于靶向炎症和脱髓鞘区域。多项研究已证实，NPCs 能够诱导内源性再髓鞘化，并直接参与再髓鞘化过程^2-8。由于 NPCs 参与直接再髓鞘化，因此必须深入了解其在移植后与内源性细胞的动力学行为及相互作用。移植后，NPCs 会向腹侧迁移至白质损伤区域，随后相对于移植位点向头端和尾端扩散^5,9。迁移动力学因环境信号的不同而有所差异；移植到未受损脊髓中的 NPCs 迁移速度高于移植到受损脊髓中的 NPCs⁶。在迁移阶段之后，移植的 NPCs 会广泛增殖，在受损脊髓中的增殖速率高于完整脊髓中的增殖速率⁶。最终，大多数 NPCs 分化为少突胶质细胞，并启动直接再髓鞘化^4,6,9。

脱髓鞘病灶结构复杂，可能包含处于不同活化阶段的多种细胞群体。例如，活动性多发....

方案

注意：伦理声明：动物操作方案已获得加州大学欧文分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，方案编号 #2010-2943。

1. 脊髓的摘除

1. 在安乐死容器中放置用约100%液态异氟烷（USP）浸湿的纸巾，并在上方覆盖干燥的纸巾。将小鼠置于干燥纸巾上，确保小鼠不直接接触异氟烷，并盖好容器。呼吸停止后至少等待一分钟，以确认小鼠已安乐死。
2. 进行颈部脊髓横断以确保小鼠死亡。不要采用颈椎脱位法，以免损伤脊髓。
3. 用70%乙醇喷洒小鼠体表，使毛发湿润。
4. 使用锋利的精细剪刀去除小鼠背部的毛发和皮肤，暴露从大约第一颈椎椎板（C1）至第四骶椎椎板（S4）的脊柱区域。
5. 使用带有#10刀片的解剖刀，在脊柱左右两侧做切口，分离肌肉和脂肪组织，以便更易于取出脊髓。
6. 可选：可使用弯头卢尔咬骨钳刮除多余的软组织。
7. 用带齿的Graefe镊子夹住脊柱上端，在C1处将弯曲面朝上的钛制弯头Vannas剪刀插入暴露的脊柱内，注意避免触碰脊髓。
8. 将钛制弯头Vannas剪刀完全滑至右侧并进行一次小幅度剪切，剪断椎骨时应能听到并感受到轻微的“咔嚓”声。在脊髓最左侧重复此剪切操作。注意动作不宜过快或剪切幅度过大，以免剪刀损伤脊髓。
9. 当椎骨两侧被剪断后，可用镊子将单个椎板轻轻提起。重复此步骤，逐个处理每个椎板直至S4，持续夹持并后拉脊柱椎骨....

结果

尽管离体脊髓成像方案可用于观察脊髓内的任何荧光信号，但我们展示的结果重点呈现了表达eGFP的神经前体细胞（NPC）与表达eYFP的轴突之间的相互作用。图1A展示了包埋后的腹侧脊髓组织制备样本。接着，图1B展示了双光子显微镜的装置及其关键组件。图2显示了在腹侧脊髓单个z轴层扫图像中eGFP与eYFP的荧光信号。连续采集的多个z轴层扫图像可整合生成延时视频，用于分析完整组织内细胞动态的实时变化。根据本方案所述，使用520 nm单边二向色镜和560 nm单边二向色分光镜，可有效分离eGFP与eYFP信号。通过成像软件，可将各个通道分别伪彩为绿色和黄色。

讨论

为了研究神经前体细胞（NPC）在移植到脱髓鞘小鼠脊髓后其动力学行为和相互作用，需要对完整组织进行实时双光子（2P）成像。活体双光子成像通常用于在活体小鼠中检测脊髓背侧的细胞动态，并已被用于研究脱髓鞘疾病中的背侧脱髓鞘过程^17-19。然而，由于移植的NPC会迁移至腹侧白质，而该区域过深，无法通过双光子显微镜在体内原位成像，因此需要采用离体（ex vivo）制备方法。本实验室已使用该方法来确定移植到受损和未受损脊髓中的NPC的迁移能力及再髓鞘化动力学⁶。离体制备技术不仅允许对脊髓进行纵向扫描，还可从腹侧进行横向扫描^6,20，从而能够分析细胞在移植部位、邻近移植部位以及距离移植部位不同位置处的运动差异（速度与方向）及其相互作用⁶。尽管我们最初设计该制备方法是为了成像移植至脊髓腹侧的eGFP标记NPC，但通过调整脊髓的安装方向，该方法也可用于对腹侧、背侧或侧方的任何荧光标记或染色细胞进行成像。与活体成像相比，该制备方法的优势在于可实现腹侧成像，并且无需麻醉和存活手术——而使用“玻璃窗”装置的新一代活体成像技术仍需进行麻醉和.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异氟烷，USP	Piramal Critical Care, Inc	N/A
精细剪刀	Fine Science Tools	14060-09	锋利
10号手术刀片	Fine Science Tools	10010-00
手术刀柄	Fine Science Tools	10003-12
鲁尔咬骨钳	Fine Science Tools	16001-15
格拉费镊子	Fine Science Tools	11052-10
万纳斯剪刀	Fine Science Tools	15615-08
11号手术刀片	Fine Science Tools	10011-00
RPMI-1640 培养基	Gibco	12-115F
低凝胶温度琼脂糖	Sigma	A9414-25G
帕拉菲尔膜（Parafilm）	Fisher Scientific	13-374-12
Vetbond（组织粘合剂）	3M	1469SB
22 mm 方形盖玻片	Fisher Scientific	12-547
25倍浸入式物镜，1.1 数值孔径	Nikon	CFI Apo LWD 25XW
单通道可调速管路泵	Warner Instruments	64-0102
520 nm 单边二向色分光镜	Semrock	FF520-Di02-25x36	Brightline
560 nm 单边二向色分光镜	Semrock	FF560-FDi01-25x36	Brightline
光电倍增管	Hamamatsu	R928
C/L 可变速蠕动泵	Masterflex	77122-22
数字温度计	Comar Instruments	3501
Chameleon Ultra Ti:Sapphire 激光器	Coherent	N/A
Slidebook 6 软件	3i	N/A
Imaris 7.7 软件	Bitplane	N/A