从小鼠皮肤不同区域制备用于流式细胞分析的单细胞悬液

摘要

皮肤是复杂免疫细胞网络的栖息地。本文介绍一种高效的小鼠皮肤消化方法，适用于动物身体不同部位的皮肤，以获得单细胞悬液，并通过流式细胞术分析皮肤中定居的各种白细胞群体。

摘要

皮肤是一种与外部环境相互作用的屏障器官。由于持续暴露于潜在的微生物侵袭，真皮和表皮在稳态和炎症状态下均定植有多种免疫细胞。因此，获取皮肤细胞用于流式细胞分析的工具对于研究皮肤内复杂的免疫细胞网络及其对微生物刺激的反应非常有用。本文介绍了一种高效消化小鼠皮肤的方法，可快速、高效地获得单细胞悬液。该方案能够在不损害表面抗原表达的前提下，最大程度地维持细胞活性。我们还描述了如何从耳部、躯干、尾部和足垫等不同解剖部位采集并消化皮肤样本。所得细胞悬液经染色后通过流式细胞术进行分析，以区分不同的白细胞群体。

引言

皮肤是人体最大的器官之一，其巨大的表面积持续暴露于外部环境中。因此，皮肤必须通过物理屏障以及主动防御潜在病原体入侵的方式，保护机体免受潜在威胁，以维持内环境稳定。与肠道和肺黏膜类似，皮肤中定居着多种免疫细胞，这些细胞持续与上皮层相互作用，以维持免疫监视功能。这一涉及皮肤中免疫细胞与非免疫细胞的复杂系统，自免疫学早期便已得到认可；1978年，学者首次提出“皮肤相关淋巴组织”（Skin-associated lymphoid tissue, SALT）¹这一术语，用以描述该系统的复杂性。

皮肤中存在大量免疫细胞，不仅有助于机体抵御潜在的侵袭，还能协调伤口愈合过程，并维持对自身抗原及皮肤微生物群的免疫耐受^2,3。

在皮肤常驻免疫细胞中，树突状细胞（DCs）在调控免疫应答和维持稳态方面发挥着关键作用⁴。真皮DC和朗格汉斯细胞能够迅速响应病原体侵袭，并在迁移至淋巴结后激活T细胞，诱导新生成的效应T细胞表达皮肤归巢受体⁵。DCs在调节皮肤稳态中也具有基本作用。在稳态条件下，从真皮迁移至淋巴结的DCs会携带皮肤隔离的抗原，主要通过诱导针对皮肤抗原的调节性T细胞（Tregs）分化，从而诱导T细胞耐受^6-8。

T细胞是皮肤中数量最多的免疫细胞群体。它们不仅在感染期间浸润皮肤，而且也是皮肤常驻淋巴细胞中稳定的组成部分^9,10。CD8⁺和CD4⁺组织驻留记忆（rm）T细胞均存在于皮肤中，在感染发生后，能够在效应T细胞从血液中被募集之前迅速作出应答。皮肤中还存在一类组织驻留的调节性T细胞（Treg），能够维持对皮肤抗原的免疫耐受以及组织稳态。这些细胞在接触其特异性抗原后可被快速而强烈地激活，因此被定义为记忆型调节性T细胞（memory Tregs）^11,12。

除了树突状细胞（DCs）和T细胞外，许多天然免疫细胞，如自然杀伤细胞（NK细胞）、γδ T细胞、2型固有淋巴样细胞（ILC2s）¹³、肥大细胞和巨噬细胞，也存在于皮肤中，并参与宿主防御。为了分析如此复杂的微环境，必须高效地从皮肤样本中获得单细胞悬液，同时保持细胞表面标志物的表达，以便进行流式细胞荧光分析或分选。

小鼠皮肤具有主要由角质形成细胞、朗格汉斯细胞和表皮树突状T细胞构成的外层表皮，以及其下方的真皮层。真皮层含有大部分免疫细胞，并由细胞外基质构成，其中胶原纤维含量最为丰富，尤其是I型胶原和IV型胶原。与人类皮肤不同，小鼠皮肤被毛发覆盖，因此含有更密集的毛囊。此外，小鼠皮肤比人类皮肤薄得多，并包含一层称为panniculus carnosus的肌肉层，有助于伤口愈合¹⁴。这些特性使得有效破坏真皮层中的胶原网络以获取免疫细胞变得更加困难。

本文提供了一种适用于消化细胞外基质的方法，该方法依赖于高纯度胶原酶1、胶原酶2与嗜热菌蛋白酶组成的混合酶液。此外，由于不同部位皮肤的分析需要采用不同的实验流程，我们将展示从足垫、尾部、耳部及躯干部高效获取皮肤样本的多种方法。随后，我们将对样本进行标记，以检测树突状细胞（MHCII⁺CD11c⁺CD45⁺）、巨噬细胞（CD11b⁺F4/80⁺CD45⁺）、CD8⁺ T细胞和CD4⁺ T细胞的存在情况。

方案

研究批准：实验方案已根据1992年1月27日第116号立法法令《实施关于用于实验或其他科学目的动物保护的第86/609/EEC指令》，获得意大利卫生部（意大利罗马）批准"Attuazione della Direttiva n. 86/609/CEE in materia di protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici."

1. 获取皮肤样本

1. 通过颈椎脱位法处死小鼠。
2. 耳朵：
   1. 剪下小鼠耳部无毛的部分。
   2. 用镊子将耳部的背侧与腹侧分离。用镊子轻轻刮除耳内侧残留的软骨组织。
3. 躯干皮肤：
   1. 使用电动剃刀和温和的脱毛乳液对动物全身皮肤进行剃毛处理。
   2. 切下所需皮肤样本（从 2 cm² 至整张动物皮肤）。
      1. 若切除整个小鼠背侧和腹侧皮肤，先在小鼠背部中央做一纵向切口，然后沿小鼠身体周围剃毛区域的边界进行剪切。
      2. 用镊子固定皮肤样本，同时用手术剪刀或手术刀的闭合圆头端轻轻分离皮肤与腹膜及背部肌肉。
   3. 准备一个含有 10 ml 冰冷 PBS 的 100 mm 细胞培养皿。
   4. 将皮肤样本浸入步骤 1.3.3 准备的含 PBS 的培养皿中，用镊子轻轻刮除皮下脂肪组织。
4. 尾巴：
   1. 剪下小鼠尾巴。
   2. 用手术剪刀或手术刀从尾根部开始，沿纵向剪至尾尖。
   3. 用镊子将尾部皮肤剥离。用镊子夹住尾根部切口边缘，同时用手固定尾部主体，轻轻向尾尖方向拉扯皮肤。
   4. 用镊子轻轻刮除皮肤样本上多余的脂肪组织。
5. 足垫：
   1. 用手术剪刀完整剪下小鼠足部，避免剪到任何带毛的皮肤。
   2. 从踝关节至脚趾起始处，沿纵向切开足部皮肤。
   3. 用手或镊子固定踝骨，同时用镊子夹住皮肤并向脚趾方向拉扯，如同脱去手套一般剥离皮肤。

2. 消化

1. 根据材料列表中的配制方法，用以下配方从储备液制备消化液：酶混合物（具体见材料列表）300 μg/ml，DNAse1 50 U/ml，用含5%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基稀释。
2. 将皮肤样本置于含有2 ml消化液的35 mm培养皿中，用剪刀剪成小块（对于躯干皮肤：每2 cm²皮肤使用2 ml消化液，最多不超过3 ml）。
3. 在37 °C孵育90分钟，孵育期间轻轻晃动培养皿1–2次。
4. 将消化后的皮肤样本倒入含有1 ml含5% FBS的RPMI1640培养基的66 mm培养皿中的70 μm细胞筛网上。
5. 用5 ml含5% FBS的RPMI1640培养基冲洗筛网。
6. 用注射器活塞将样本压过细胞筛网。
7. 用20 ml含5% FBS的RPMI1640培养基冲洗活塞、培养皿和筛网，并转移至50 ml离心管中。

3. 抗体与标记

1. 用 5 ml 的含 1% FBS（或 BSA）的 PBS 洗涤所得悬浮液两次。
2. 用所需的抗体标记所得的细胞悬液。
   1. 将样品重悬于 100 μl/样品的混合液中，该混合液含有用含 1% FBS 的 PBS 稀释至 2 μg/ml 的 aCD16/CD32（克隆号 2.4G2）。
   2. 在 4 °C 孵育 15 分钟，以阻断所需抗体通过 Fc 受体发生的非特异性结合。
   3. 加入 表 1 中列出的抗体。
      1. 将所需抗体用含 1% FBS 的 PBS 稀释至 4 μg/ml 的浓度，制备成 100 μl/样品的混合液。
      2. 向每个样品中加入 100 μl 上述步骤 3.2.3.1 中制备的混合液，使管中抗体混合液总体积为 200 μl，终浓度为 2 μg/ml。
   4. 在 4 °C 孵育 30 分钟，并避光。
3. 用 1 ml 含 1% FBS 的 PBS 洗涤，以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，再重悬于 300 μl 含 1% FBS 的 PBS 中。
4. 加入 DAPI 至终浓度为 2 μg/ml，在 4 °C 避光孵育 10 分钟。
5. 通过流式细胞术（FACS）分析所得样品。
   1. 为分离白细胞，请采用以下设门策略：
      1. 首先通过设门选择 DAPI 阴性（DAPI-）群体以排除死细胞。
      2. 在 FSC-A 与 FSC-W 图中选择单细胞群体，如 图 1 所示。
      3. 根据目标白细胞典型的大小和颗粒度进行设门。
      4. 在 FSC-A 与 CD45 图中选择 CD45+ 细胞，如 图 1 所示。
   2. 通过表面标志物的表达区分不同的白细胞群体，如下所示：
      1. 将树突状细胞（DCs）鉴定为 CD11c⁺ MHC II⁺ 细胞。后续可进一步分析 CD207 的表达，以区分朗格汉斯细胞和 CD207+ 真皮 DCs 与 CD207- 真皮 DCs。
      2. 将巨噬细胞鉴定为 CD64+ F4/80+ 细胞。
      3. 将 B 细胞鉴定为 CD19+ MHCII+ 细胞。
      4. 将 T 细胞鉴定为 CD8+ 或 CD4+ 细胞。

结果

根据所述方案对身体不同部位的皮肤进行消化处理，并用指定抗体染色。分选策略如图1所示：首先选择活细胞（DAPI阴性细胞），然后圈选单细胞（FSC-A 对 FSC-W）以及具有淋巴细胞形态的细胞（FSC-A 对 SSC-A）。如需，进一步选择造血来源的CD45⁺细胞。

DCs 用抗 CD11c、MHCII 和 CD45 抗体进行标记，巨噬细胞鉴定为 F4/80⁺ CD64⁺ CD45⁺ 细胞，B 细胞鉴定为 CD19⁺CD45⁺ MHCII⁺ 细胞，CD4⁺ T 淋巴细胞鉴定为 CD4⁺CD45⁺ 细胞，CD8⁺ T 淋巴细胞鉴定为 CD8⁺CD45^+<...

讨论

我们描述了一种从小鼠不同皮肤区域制备单细胞悬液的方法。我们采用的消化方法不仅能够获得较高的细胞得率，而且能够保持表面标志物的表达，这对于后续的流式细胞分析至关重要。

使用胶原酶I和II与嗜热菌蛋白酶的混合酶液，可确保酶活性在不同批次间差异最小，从而使该方法具有高度可重复性。其他已发表的方法依赖于不同的酶混合物，但在我们的实践中，这些方法获得的细胞产量较低，更重要的是，可重复性较差。然而，我们的方法无法区分表皮中的细胞与真皮中的细胞。由于在许多情况下区分这两个不同区室可能具有重要意义，我们建议读者参考此前采用此类方法的研究工作¹⁵。

根据我们的经验，耳部和尾部的皮肤样本比躯干皮肤更容易消化，因为躯干皮肤需要彻底刮除皮下脂肪层，才能使真皮层充分接触酶混合液。去脂步骤以及切割操作都应迅速而轻柔地进行，以保持细胞活性。去脂时间过长或过于彻底可能会损伤皮肤中常驻的免疫细胞，从而导致回收细胞的数量显著降低且细胞活性下降。

还应注意，为了保持表面标志物的完整性，消...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
添加物补充的 RPMI 1640 培养基			RPMI1640 添加 L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素，不含 β-巯基乙醇
PBS
FBS
Liberase TM（酶混合物）	Roche	5401119001	用 dH2O 重悬至 [2.5 mg/ml]；分装后于 -20 °C 保存
Dnase I	Sigma	D4263-1VL	用无血清 RPMI 1640 重悬 [1,000 U/ml]
材料
手术剪
手术镊
手术刀
35 mm 培养皿
66 mm 培养皿
100 mm 培养皿
70 µm 细胞筛	BD	352350
消化液混合物			用含 5% FBS 的 RPMI 稀释
Liberase TM			300 µg/ml
DNAse1			50 U/ml
抗体
名称	公司	克隆号	标记
aCD45.2		104	PE-Cy5.5
aCD11c		N418	PE-Cy7
CD11b		M1/70	FITC
F4/80		A 3-1	APC-Cy7
aCD4		Gk1.5	APC-Cy7
aCD8		53-6.7	PE
aCD64		X54-5/7.1	PE-Cy7
aCD207		4C7	APC