膈神经运动神经元对膈肌支配的功能与形态学评估

摘要

复合肌肉动作电位记录可定量评估膈肌的膈神经运动神经元功能支配情况。全层膈肌免疫组织化学染色可用于评估单个神经肌肉接头处的形态学支配状况。本方案旨在展示这两种强大方法如何应用于多种脊髓疾病啮齿类动物模型中。

摘要

本方案重点介绍在电生理学和形态学水平上评估膈神经运动神经元（PhMN）对膈肌支配的工具。通过刺激膈神经后记录复合肌肉动作电位（CMAP），可对颈段脊髓PhMN的功能性膈肌支配进行定量评估。 体内 在麻醉的大鼠和小鼠中。由于复合肌肉动作电位（CMAP）代表了对整个半侧膈肌所有肌纤维同步活动的记录，因此进一步在膈肌神经肌肉接头（NMJ）水平上检测单个运动轴突和肌纤维的表型，对于追踪与疾病及治疗相关的形态学变化（如部分或完全失神经支配、再生性出芽及再神经支配）具有重要意义。该目标可通过膈肌全层组织免疫组织化学（IHC）染色，随后对肌肉内各个神经肌肉接头进行详细的形态学评估来实现。将CMAP记录与NMJ分析相结合，为在中枢神经系统（CNS）和周围神经系统（PNS）疾病啮齿类动物模型中定量研究膈肌神经支配提供了强有力的方法。

引言

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致残性的运动神经元疾病，与上下运动神经元的丧失以及随之而来的肌肉麻痹相关。患者在确诊后平均生存期仅为2至5年¹。膈神经运动神经元（PhMN）的丧失是ALS发病机制中的关键环节。患者最终死于PhMN对膈肌——主要的吸气肌——支配的丧失^2,3。创伤性脊髓损伤（SCI）也是一种严重的健康问题，常伴有呼吸困难。每年约有12,000例新的SCI病例发生⁴，其原因为脊髓受到创伤性损害。尽管SCI在损伤部位、类型和严重程度上存在异质性，但大多数病例涉及颈段脊髓损伤，常导致严重且持续的呼吸功能障碍。除ALS和SCI外，其他中枢神经系统（CNS）疾病也可能与膈肌呼吸功能障碍相关^5,6。

膈神经是一种支配同侧半膈肌的传出运动神经，其神经元胞体位于同侧颈髓C3-C5节段的膈运动神经元（PhMN）区域。PhMN的输出活动受脑干中一个称为头端腹侧呼吸群（rVRG）区域的下行延髓脊髓输入调控。⁷rVRG-PhMN-膈肌环路在控制吸气呼吸及其他非通气性膈肌活动中起核心作用。该环路若受到各种创伤性损伤或神经退行性疾病的影响，可导致呼吸功能显著下降，严重影响患者生活质量。正常膈肌功能依赖于rVRG对PhMN的下行投射、PhMN的存活、膈神经的完整性以及膈肌神经肌肉接头（NMJ）处的正确神经支配。因此，采用能够对该环路进行定量评估的技术至关重要 体内 在....

方案

实验操作已获托马斯杰斐逊大学机构动物照护与使用委员会批准，并依照欧洲共同体理事会指令（2010/63/EU、86/609/EEC 和 87-848/EEC）、美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》以及神经科学学会关于动物在神经科学研究中使用的政策执行。

1. 复合肌肉动作电位（CMAPs）

1. 准备实验动物：
   1. 使用吸入麻醉剂（异氟烷），以1-2%浓度给予至起效，或通过注射给药（氯胺酮、赛拉嗪、乙酰丙嗪）进行麻醉。注射麻醉剂的剂量如下：氯胺酮95.0 mg/kg，赛拉嗪10.0 mg/kg，乙酰丙嗪0.075 mg/kg。
      注意：在执行本CMAP记录方案时，我们成功使用了吸入和注射两种麻醉方法，无特定偏好。
   2. 在手术开始前、手术过程中直至术后布托啡诺起效期间，必须维持动物适当的麻醉深度。通过短暂夹捏脚趾以确认无回缩反应，从而判断麻醉是否充分。此外，使用棉签测试角膜反射。在整个手术过程中，应确保心率和呼吸频率未升高，否则提示麻醉深度已变浅。
   3. 在动物眼睛上涂抹兽用眼膏，以防止麻醉期间角膜干燥。
   4. 术者应在手术开始前用消毒剂（洗必泰擦洗液）洗手。术者应穿戴无菌手套、口罩及无菌手术衣或洁净实验服。所有器械在手术前应清洗并高压灭菌。高压灭菌时，应在器械包内放置灭菌指示条，置于器械水平位置，以验证灭菌是否完成。术者应在手术开始前确认指示条整条变为黑色。同时，器械盒....

结果

成年Sprague-Dawley大鼠接受仅椎板切除术（未损伤对照组）或在C4脊髓节段进行单侧半挫伤性脊髓损伤（SCI）^10-12。术后5周时，与仅行椎板切除术的对照组大鼠（图2B）相比，SCI大鼠同侧半膈肌记录到的复合肌肉动作电位（CMAP）峰值振幅显著降低（图2C）。在对照组无疾病的野生型大鼠中，半膈肌的所有神经肌肉接头（NMJ）均完全完整（图4A,C）。相反，SOD1^G93A大鼠（一种肌萎缩侧索硬化症ALS的啮齿类动物模型）在半膈肌神经肌肉接头处表现出显著的病理改变（图4B），包括完全失神经支配（图4G，箭头）、部分失神经支配（图4E，箭头；图4G，右侧NMJ）、多重神经支配（图4D）以及纤细的神经末梢前轴突（图4F，箭头）。

讨论

由于创伤性脊髓损伤（SCI）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）均会损害呼吸功能，因此开发针对呼吸功能、特别是膈肌神经支配的治疗方法在临床上具有重要意义^5,6。为了全面研究呼吸功能，应采用综合性的研究方法。复合肌肉动作电位（CMAP）可通过体外刺激膈神经来评估膈肌的功能性神经支配程度，但无法反映内源性脑脊髓呼吸驱动⁸。此外，此类记录无法检测神经肌肉接头（NMJ）的形态学变化，尤其是单个运动轴突及突触后乙酰胆碱受体水平的变化。通过采用所述染色方案，可对膈肌单个神经肌肉接头处的相关形态学表型进行定量评估，例如完全失神经支配、部分失神经支配，甚至再生性出芽和重新神经支配⁹。

然而，这两种方案仍未能完全涵盖呼吸系统病理学的所有方面。例如，如果降行的延髓脊髓轴突受到损伤，而膈运动神经元池或膈神经本身未受损害，则由于膈神经接受了外部刺激，即使该神经回路存在显著功能障碍，复合肌肉动作电位（CMAP）的波幅仍可能显示正常¹⁴。重要的是，CMAP 无法测量内源性脑干以上的呼吸驱动。此外，CMAP 也不能反映整体通气功能。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
多聚甲醛	Fisher	T353-500	先用去离子蒸馏水配制10%溶液；再用1×PBS配制成4%溶液，并将pH调至7.4
1×磷酸盐缓冲液，pH 7.4	Invitrogen	10010049
2%牛血清白蛋白（2% BSA）	Sigma-Aldrich	A3059-100g	将2 g BSA溶解于100 mL 1×PBS中
含0.2% Triton X-100的2% BSA/PBS（封闭缓冲液）	Sigma-Aldrich	T9284-100mL	将0.2 mL Triton X-100加入100 mL 2% BSA/PBS中溶解
0.1 M 甘氨酸	Sigma-Aldrich	G-7126	将0.185 g甘氨酸加入25 mL 2% BSA/PBS中
α-bungarotoxin	Invitrogen	T1175	使用浓度1:400
SMI-312	Sternberger Monoclonals	SMI312	使用浓度1:1,000
SV2	Developmental Studies Hybridoma Bank	SV2-Supernatant	使用浓度1:10
FITC标记的山羊抗小鼠IgG1	Roche	3117731001	使用浓度1:100
硅橡胶	Sylgard, Dow Corning	Part # 184	按照试剂盒说明书操作：可根据需要使用不同尺寸的培养皿（30 mm、60 mm、100 mm）
Vectashield荧光封片剂	Vector laboratories	H-1000	此封片剂不会固化，需用透明指甲油固定盖玻片
小型弹簧剪刀	Fine Science Tools	15002-08
解剖镊	Fine Science Tools	11295-51
CMAP记录软件	Scope 3.5.6; ADI
盘状表面电极	Natus neurology	019-409000
皮下针电极	Natus neurology	019-453100
导电凝胶	Aquasonic	122-73720
CMAP记录用刺激/记录系统	ADI Powerlab 8SP stimulator
CMAP记录用放大器	BioAMP