膈神经运动神经元对膈肌支配的功能与形态学评估

摘要

复合肌肉动作电位记录可定量评估膈肌的膈神经运动神经元功能支配情况。全层膈肌免疫组织化学染色可用于评估单个神经肌肉接头处的形态学支配状况。本方案旨在展示这两种强大方法如何应用于多种脊髓疾病啮齿类动物模型中。

摘要

本方案重点介绍在电生理学和形态学水平上评估膈神经运动神经元（PhMN）对膈肌支配的工具。通过刺激膈神经后记录复合肌肉动作电位（CMAP），可对颈段脊髓PhMN的功能性膈肌支配进行定量评估。 体内 在麻醉的大鼠和小鼠中。由于复合肌肉动作电位（CMAP）代表了对整个半侧膈肌所有肌纤维同步活动的记录，因此进一步在膈肌神经肌肉接头（NMJ）水平上检测单个运动轴突和肌纤维的表型，对于追踪与疾病及治疗相关的形态学变化（如部分或完全失神经支配、再生性出芽及再神经支配）具有重要意义。该目标可通过膈肌全层组织免疫组织化学（IHC）染色，随后对肌肉内各个神经肌肉接头进行详细的形态学评估来实现。将CMAP记录与NMJ分析相结合，为在中枢神经系统（CNS）和周围神经系统（PNS）疾病啮齿类动物模型中定量研究膈肌神经支配提供了强有力的方法。

引言

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致残性的运动神经元疾病，与上下运动神经元的丧失以及随之而来的肌肉麻痹相关。患者在确诊后平均生存期仅为2至5年¹。膈神经运动神经元（PhMN）的丧失是ALS发病机制中的关键环节。患者最终死于PhMN对膈肌——主要的吸气肌——支配的丧失^2,3。创伤性脊髓损伤（SCI）也是一种严重的健康问题，常伴有呼吸困难。每年约有12,000例新的SCI病例发生⁴，其原因为脊髓受到创伤性损害。尽管SCI在损伤部位、类型和严重程度上存在异质性，但大多数病例涉及颈段脊髓损伤，常导致严重且持续的呼吸功能障碍。除ALS和SCI外，其他中枢神经系统（CNS）疾病也可能与膈肌呼吸功能障碍相关^5,6。

膈神经是一种支配同侧半膈肌的传出运动神经，其神经元胞体位于同侧颈髓C3-C5节段的膈运动神经元（PhMN）区域。PhMN的输出活动受脑干中一个称为头端腹侧呼吸群（rVRG）区域的下行延髓脊髓输入调控。⁷rVRG-PhMN-膈肌环路在控制吸气呼吸及其他非通气性膈肌活动中起核心作用。该环路若受到各种创伤性损伤或神经退行性疾病的影响，可导致呼吸功能显著下降，严重影响患者生活质量。正常膈肌功能依赖于rVRG对PhMN的下行投射、PhMN的存活、膈神经的完整性以及膈肌神经肌肉接头（NMJ）处的正确神经支配。因此，采用能够对该环路进行定量评估的技术至关重要 体内 在肌萎缩侧索硬化症、脊髓损伤及其他中枢神经系统疾病的啮齿类动物模型中。

本方案旨在描述在电生理学和形态学水平上评估膈肌运动神经元（PhMN）支配情况的实验工具。通过刺激特定运动神经的所有传出运动神经元轴突，记录并分析靶向肌纤维产生的去极化反应，即可获得复合肌肉动作电位（CMAPs）。该技术可在麻醉的大鼠和小鼠中进行in vivo应用，用于量化PhMN对半侧膈肌的功能性支配⁸。由于CMAPs反映的是整个半侧膈肌全部（或至少是多数）肌纤维同步记录的总和反应，因此还需在膈肌神经肌肉接头（NMJ）处对单个运动轴突和肌纤维的表型进行观察，以追踪与疾病及治疗相关的形态学变化，例如部分或完全失神经支配、再生性出芽以及再神经支配等现象。这一目标可通过膈肌全层免疫组织化学（IHC）染色实现，随后对肌肉内各个NMJ进行详细的形态学评估⁹。结合CMAPs与NMJ分析，可为研究中枢神经系统（CNS）和周围神经系统（PNS）疾病啮齿动物模型中膈肌神经支配提供一种强有力的定量分析方法。

方案

实验操作已获托马斯杰斐逊大学机构动物照护与使用委员会批准，并依照欧洲共同体理事会指令（2010/63/EU、86/609/EEC 和 87-848/EEC）、美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》以及神经科学学会关于动物在神经科学研究中使用的政策执行。

1. 复合肌肉动作电位（CMAPs）

1. 准备实验动物：
   1. 使用吸入麻醉剂（异氟烷），以1-2%浓度给予至起效，或通过注射给药（氯胺酮、赛拉嗪、乙酰丙嗪）进行麻醉。注射麻醉剂的剂量如下：氯胺酮95.0 mg/kg，赛拉嗪10.0 mg/kg，乙酰丙嗪0.075 mg/kg。
      注意：在执行本CMAP记录方案时，我们成功使用了吸入和注射两种麻醉方法，无特定偏好。
   2. 在手术开始前、手术过程中直至术后布托啡诺起效期间，必须维持动物适当的麻醉深度。通过短暂夹捏脚趾以确认无回缩反应，从而判断麻醉是否充分。此外，使用棉签测试角膜反射。在整个手术过程中，应确保心率和呼吸频率未升高，否则提示麻醉深度已变浅。
   3. 在动物眼睛上涂抹兽用眼膏，以防止麻醉期间角膜干燥。
   4. 术者应在手术开始前用消毒剂（洗必泰擦洗液）洗手。术者应穿戴无菌手套、口罩及无菌手术衣或洁净实验服。所有器械在手术前应清洗并高压灭菌。高压灭菌时，应在器械包内放置灭菌指示条，置于器械水平位置，以验证灭菌是否完成。术者应在手术开始前确认指示条整条变为黑色。同时，器械盒外部也应贴上灭菌指示胶带。若同一天需对多只动物进行手术，每次手术之间应对器械进行清洁，并使用玻璃珠灭菌器进行灭菌。如有必要，可通过将器械手柄端放入玻璃珠灭菌器中适当时间，用无菌止血钳取出，在无菌区域冷却后，再将器械功能端放入玻璃珠灭菌器中适当时间，从而实现器械两端的灭菌。
   5. 动物麻醉后，将其置于手术板上，背侧朝下，腹部朝上，以便使用胶带将动物前肢固定于手术板上。
   6. 从颅底开始向尾侧剃除腹部腹面毛发，并根据记录哪一侧半膈肌，确保中线两侧腹部区域均被剃净。在剃毛后的皮肤表面涂抹聚维酮碘。
2. CMAP记录准备：
   1. 完成动物准备后，将接地电极皮下插入尾部（图1）。
   2. 将参考电极皮下插入对侧下腹部区域。
   3. 在自粘式条状或盘状记录电极的表面涂上导电凝胶（条状电极尺寸：0.5 × 3 cm），然后将表面电极横向置于单侧肋缘沿线。
   4. 将刺激电极经皮插入气管外侧、锁骨上方，间距0.5 cm。将电极插入皮肤约1.0 cm深。用手固定电极，确保其位置在后续刺激过程中不发生移动。
      注意：刺激电极插入部位应与皮肤呈90°角。
3. 复合肌肉动作电位（CMAP）记录：
   1. 使用刺激器/放大器获取电生理记录，随后进行计算机辅助数据分析。
   2. 单次拉刺激的刺激参数应为0.5毫秒、1.0 Hz的超最大脉冲。刺激幅度应在6.0至8.0 V之间（图2A）。
      注意：在同一实验中，所有动物应使用相同幅度的刺激强度。目标是使用最小刺激幅度以最大化反应幅度。需注意，刺激瞬间出现的初始信号为刺激伪迹。此外，应确保获得的CMAP反应在刺激伪迹后具有稳定/平坦的基线，随后出现快速的CMAP反应。为获得此类反应，可能需要重新调整刺激和/或记录电极的位置。
   3. 每次刺激间隔30秒，连续重复10次刺激以获得平均反应（图2B-C）。测量从基线到峰值的幅度（图2A）。在动物呼吸周期中膈神经/膈肌未激活的阶段进行膈神经刺激。可在同一只动物上重复该操作以记录对侧半膈肌。
   4. 最后一次CMAP记录结束后，如需进行神经肌肉接头（NMJ）染色，则进行灌注。可在同一只动物上每周约一次（或按选定时间间隔）重复进行CMAP记录。
   5. 在存活状态下完成CMAP记录后，将动物置于循环温水加热垫上恢复，并在恢复期间持续监测直至清醒且胸卧位稳定。动物未完全恢复前不得将其放回与其他动物同笼饲养。
   6. 动物恢复至胸卧位后，前48小时内每12小时监测一次（之后每日一次）。若动物出现脱水迹象（皮肤松弛、精神萎靡），应给予液体治疗（乳酸林格液；皮下注射；每次1-2 ml，注射部位轮换；每日2次），直至术后体重和液体丢失趋于稳定。若动物无法触及金属栏杆式饲料盒，在急性术后阶段可根据需要在小碟中提供软化食物以促进进食。
   7. 手术结束前以0.05 mg/kg剂量皮下注射布托啡诺，之后在术后前24小时内每12小时注射一次（此后根据疼痛/应激表现决定是否继续使用），注射部位应轮换。若后续观察到疼痛或痛苦迹象，应再次给予布托啡诺治疗。疼痛/痛苦的迹象包括活动减少、发声、拒食或拒饮（脱水）、显著体重下降、保护性姿势、过度啃咬或抓挠切口部位。判断疼痛和痛苦的其他标准还包括对外界刺激无反应、短暂或无诱发声发、呼吸费力或异常、持续性红褐色鼻眼分泌物、明显竖毛现象。同时应监测动物卫生状况不良的迹象，提示其健康状态不佳。若动物在接受上述镇痛方案治疗72小时后仍持续表现出痛苦（依据上述疼痛/应激标准），应实施安乐死。

2. 膈肌神经肌肉接头（NMJ）分析

1. 动物解剖：
   1. 给予动物过量的注射麻醉剂（剂量为上述剂量的三倍：氯胺酮 285.0 mg/kg，赛拉嗪 30.0 mg/kg，乙酰丙嗪 0.225 mg/kg；腹腔注射）。在给予过量麻醉剂后，所有动物应采用第二种安乐死方法（开胸术）以确保死亡。应通过观察心脏和呼吸停止以及动物瞳孔固定且散大来确认死亡。
   2. 使用手术刀或解剖剪沿腹中线从剑突向尾侧切开，进行剖腹手术。使用手术刀和镊子小心地将皮肤和结缔组织与下方的肌肉分离。
   3. 在提起剑突的同时，使用解剖剪将整个膈肌完整移除，确保膈肌仍附着于周围骨骼。这一点非常重要，因为这可以防止膈肌肌肉受损，有助于成功完整地解剖整个膈肌，并有利于后续染色前的肌肉清理。
      注意：此时如有需要，可对动物进行灌流。
2. 膈肌的清理与染色：
   1. 在玻璃培养皿（直径 100 mm）中，将完整解剖出的膈肌固定在硅橡胶上，腹侧朝上，置于含 4% 多聚甲醛（溶于 1% 磷酸盐缓冲液 PBS 中）的溶液中，使用体视显微镜在室温下固定 20 分钟。拉伸膈肌使其绷紧，并使用昆虫针将周围组织固定，避免直接刺入膈肌肌肉本身（图 3）。
   2. 仅对肌肉腹侧表面，使用 #5 镊子和小剪刀小心清除结缔组织。
      注意：本染色方案中所有后续步骤均需在室温下缓慢摇动进行，并避光处理，除非另有说明。确保膈肌肌肉始终完全浸没在液体中，防止干燥。
   3. 染色前准备所有必要试剂：1× PBS、2% 牛血清白蛋白（BSA）/PBS、0.1 M 甘氨酸（溶于 2% BSA/PBS 中）、4% 多聚甲醛（PFA，溶于 1× PBS 中）以及 0.2% TBP（0.2% Triton X-100 溶于 2% BSA/PBS 中）。务必提前将甲醇预冷至 -20 °C。
   4. 用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
   5. 在 0.1 M 甘氨酸（溶于 2% BSA/PBS 中）中孵育 30 分钟。
   6. 在 RBTX（罗丹明标记的 α-银环蛇毒素）溶液中孵育 15 分钟。RBTX 溶液配制如下：罗丹明标记的 α-银环蛇毒素以 1:400 比例稀释于 1× PBS 中。
      注意：本方案中使用罗丹明，但也可选用其他任意荧光染料进行染色。
   7. 用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
   8. 在 -20 °C 冰箱中，用甲醇（MeOH）孵育 5 分钟。
      注意：将肌肉放入冰箱前不要加入甲醇，孵育结束后立即移除甲醇溶液。
   9. 用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
   10. 在 0.2% TBP 中封闭 1 小时（0.2% Triton 溶于 2% BSA/PBS 中）。
   11. 在 4 °C 下，于 0.2% TBP 溶液中加入一抗溶液，边摇动边孵育过夜。抗体稀释比例如下：SV2（1:10），SMI-312（1:1,000）。
   12. 用 0.2% TBP 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
   13. 加入二抗溶液，使用 FGM1（FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG1，以 1:100 比例稀释于 0.2% TBP 中），边摇动边孵育 1 小时。
       注意：从本步骤起，后续所有染色操作均需避光。
   14. 用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
   15. 在封片前，再次清理肌肉腹侧（见上文）表面的周围结缔组织。
       注意：建议在染色完成后立即进行清理和封片。但如有必要，样品可浸泡在 1× PBS 中，用 Parafilm 封口防止蒸发，并在 4 °C 下保存最多 1 周，期间需每日更换 PBS。
   16. 将样品置于载玻片上，用非固化型 Vectashield 封片。用透明指甲油密封盖玻片边缘，防止干燥。长期保存时，将载玻片平放在纸板玻片盒中，置于 -20 °C 冰箱中。
3. 分析与共聚焦成像：
   1. 使用正置落射荧光显微镜，在 20× 和 40× 放大倍数下对染色并封片的半膈肌进行形态学定量分析。
      注意：由于膈肌以整体封片方式染色和分析，肌肉较厚。因此，若使用非共聚焦荧光显微镜拍摄静态图像，大部分荧光信号将完全失焦。因此，最佳方式是在显微镜上实时进行神经肌肉接头（NMJ）分析，以便持续在肌肉组织中上下调焦，准确识别每个 NMJ 的形态。通过该方法，可清晰追踪单个运动轴突在组织中的空间走向及其与突触后受体簇的空间关系。
   2. 通过测量肌肉腹侧至背侧的长度，根据特定脊髓节段的拓扑支配模式，将肌肉分为三个独立区域进行分析（图 4H）。
   3. 从肌肉腹侧区域开始向背侧移动，分析所有位于表面肌纤维上的正视 NMJ。不要分析表面以下第 3–4 层更深的肌纤维，因为抗体穿透性较差，可能导致结果难以解读（RBTX 因毒素分子较小，穿透深度远高于用于标记神经元的大分子抗体）。
   4. 若神经元的终前端轴突直径较粗，且神经末梢所有区域均与下方肌肉的乙酰胆碱受体（AChRs）完全重叠，则将该 NMJ 判定为完整连接。
   5. 若下方肌肉 AChRs 的任何区域未被对应的神经末梢占据，则将该 NMJ 判定为部分去神经支配。
   6. 若肌肉 AChRs 完全无对应的神经末梢，则将该 NMJ 判定为完全去神经支配（同时需在同一视野中观察到其他带有标记神经元的 NMJ，以排除该区域抗体渗透不良所致的假象）。
   7. 若单个 NMJ 由多于一条终前端轴突支配，则将该 NMJ 判定为多重支配（表明该接头处存在一定程度的去神经支配及可能的再支配尝试）。
   8. 若 NMJ 的神经末梢与下方 AChRs 完全重叠，但终前端轴突较细，则将该 NMJ 判定为稀疏支配（这也提示存在一定程度的去神经支配及再支配尝试）。
   9. 对每只动物的上述三种 NMJ 类型，在三个已定义区域中分别进行分析。将每只动物的数据与同实验组其他动物的结果取平均值。每个实验组应至少分析 3 只（理想为 5–6 只或更多）动物，大鼠半膈肌中约 200–300 个接头，小鼠半膈肌中约 150–200 个接头。
   10. 使用共聚焦显微镜获取用于发表的高分辨率共聚焦图像。
   11. 以 0.3 μm 步长采集 20–40 μm 深度的 Z 轴层扫图像，并在每个接头上下额外采集光学切片，以确保包含完整的突触轮廓。
   12. 使用图像采集软件将 Z 轴序列图像重建为最大强度投影图。

结果

成年Sprague-Dawley大鼠接受仅椎板切除术（未损伤对照组）或在C4脊髓节段进行单侧半挫伤性脊髓损伤（SCI）^10-12。术后5周时，与仅行椎板切除术的对照组（图2B）相比，SCI大鼠同侧半膈肌记录到的峰值CMAP振幅显著降低（图2C）。在对照组无疾病的野生型大鼠中，半膈肌的所有神经肌肉接头（NMJ）均完全完整（图4A,C）。相反，SOD1^G93A大鼠（一种肌萎缩侧索硬化症ALS的啮齿类动物模型）在半膈肌NMJ处表现出显著的病理改变（图4B），包括完全失神经支配（图4G，箭头）、部分失神经支配（图4E，箭头；图4G，右侧NMJ）、多重神经支配（图4D）以及纤细的神经末梢前轴突（图4F，箭头）。

讨论

由于创伤性脊髓损伤（SCI）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）均会损害呼吸功能，因此开发针对呼吸功能、特别是膈肌神经支配的治疗方法在临床上具有重要意义^5,6。为了全面研究呼吸功能，应采用综合性的研究方法。复合肌肉动作电位（CMAP）可通过体外刺激膈神经来评估膈肌的功能性神经支配程度，但无法反映内源性脑脊髓呼吸驱动⁸。此外，此类记录无法检测神经肌肉接头（NMJ）的形态学变化，尤其是单个运动轴突及突触后乙酰胆碱受体水平的变化。通过采用所述染色方案，可对膈肌单个神经肌肉接头处的相关形态学表型进行定量评估，例如完全失神经支配、部分失神经支配，甚至再生性出芽和重新神经支配⁹。

然而，这两种方案仍未能完全涵盖呼吸系统病理学的所有方面。例如，如果降行的延髓脊髓轴突受到损伤，而膈运动神经元池或膈神经本身未受损害，则由于膈神经接受了外部刺激，即使该神经回路存在显著功能障碍，复合肌肉动作电位（CMAP）的波幅仍可能显示正常¹⁴。重要的是，CMAP 无法测量内源性脑干以上的呼吸驱动。此外，CMAP 也不能反映整体通气功能。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
多聚甲醛	Fisher	T353-500	先用去离子蒸馏水配制10%溶液；再用1×PBS配制成4%溶液，并将pH调至7.4
1×磷酸盐缓冲液，pH 7.4	Invitrogen	10010049
2%牛血清白蛋白（2% BSA）	Sigma-Aldrich	A3059-100g	将2 g BSA溶解于100 mL 1×PBS中
含0.2% Triton X-100的2% BSA/PBS（封闭缓冲液）	Sigma-Aldrich	T9284-100mL	将0.2 mL Triton X-100加入100 mL 2% BSA/PBS中溶解
0.1 M 甘氨酸	Sigma-Aldrich	G-7126	将0.185 g甘氨酸加入25 mL 2% BSA/PBS中
α-bungarotoxin	Invitrogen	T1175	使用浓度1:400
SMI-312	Sternberger Monoclonals	SMI312	使用浓度1:1,000
SV2	Developmental Studies Hybridoma Bank	SV2-Supernatant	使用浓度1:10
FITC标记的山羊抗小鼠IgG1	Roche	3117731001	使用浓度1:100
硅橡胶	Sylgard, Dow Corning	Part # 184	按照试剂盒说明书操作：可根据需要使用不同尺寸的培养皿（30 mm、60 mm、100 mm）
Vectashield荧光封片剂	Vector laboratories	H-1000	此封片剂不会固化，需用透明指甲油固定盖玻片
小型弹簧剪刀	Fine Science Tools	15002-08
解剖镊	Fine Science Tools	11295-51
CMAP记录软件	Scope 3.5.6; ADI
盘状表面电极	Natus neurology	019-409000
皮下针电极	Natus neurology	019-453100
导电凝胶	Aquasonic	122-73720
CMAP记录用刺激/记录系统	ADI Powerlab 8SP stimulator
CMAP记录用放大器	BioAMP