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方法文章

利用CXCR6.Gfp报告小鼠对健康与病变肝脏中免疫细胞进行长期活体多光子显微镜成像

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DOI：

10.3791/52607

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2015年3月24日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine III, RWTH University-Hospital Aachen, 2IZKF Aachen Core Facility "Two-Photon Imaging", RWTH University-Hospital Aachen, 3Institute for Laboratory Animal Science & Experimental Surgery, RWTH Aachen University, 4Institute for Pharmacology, RWTH University-Hospital Aachen

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在肝脏中对免疫细胞进行稳定的活体高分辨率成像具有挑战性。本文提供了一种高灵敏度且可靠的方法，结合重症监护监测，利用活体多光子激光扫描显微镜，对小鼠肝脏中免疫细胞的迁移及细胞间相互作用进行长时间（约6小时）的观察研究。

摘要

肝脏在受到损伤后引发的炎症反应是一个高度动态的过程，涉及多种白细胞亚群的浸润，包括单核细胞、中性粒细胞、T细胞亚群、B细胞、自然杀伤（NK）细胞以及NKT细胞。由于对样本制备与固定、光学分辨率以及动物长期存活等方面要求极高，利用活体显微技术对肝脏进行免疫细胞迁移的监测尤为困难。然而，炎症过程的动态变化以及细胞间相互作用的研究，可为深入理解炎症性肝病的启动、进展与消退提供关键信息。因此，本研究建立了一种高灵敏度且可靠的方法，结合重症监护监测，通过活体双光子激光扫描显微技术（TPLSM），在较长时间（约6小时）内对小鼠肝脏中不同免疫细胞的迁移行为及细胞间相互作用进行观察研究。

该方法包括对肝脏进行温和的制备和稳定的固定，最大限度减少对器官的干扰；利用多色多光子显微镜进行长达6小时的长期活体成像，几乎不产生光漂白或光毒性效应，从而实现对特定白细胞亚群的追踪；同时由于对小鼠生命体征参数进行了全面监测，并对血液循环、体温和气体交换进行了稳定控制，确保了成像条件的稳定。

为了研究肝脏炎症条件下淋巴细胞的迁移，将CXCR6.gfp基因敲入小鼠在基线状态以及通过腹腔注射四氯化碳（CCl4）诱导急性与慢性肝损伤后，进行活体肝脏成像。

CXCR6 是一种表达于淋巴细胞上的趋化因子受体，主要表达于自然杀伤T（NKT）细胞、自然杀伤（NK）细胞以及T淋巴细胞亚群（如CD4 T细胞），也表达于黏膜相关不变T（MAIT）细胞1。通过追踪CXCR6.gfp+免疫细胞的迁移模式和定位，可深入了解其在肝损伤情况下行为的改变，从而揭示其在疾病进展中的潜在作用。

引言

对完整器官甚至整个生物体中的细胞及细胞功能进行可视化研究已有超过50年的历史，几乎涵盖了身体的所有部位2。因此，一些早期研究已开始采用活体成像技术对肝脏进行观察3,4。然而，迄今为止，在肝脏组织的长期稳定高分辨率成像方面仍存在多种局限性。

由于肝脏在解剖位置上紧邻膈肌和胃肠道5，显微活体成像最常见的问题是呼吸运动引起的位移，以及程度较轻的肠道蠕动干扰6。与其他实体器官相比，肝脏手术尤为困难。由于其致密的微血管结构，手术操作可能导致大范围出血性损伤、微循环障碍7，并激活常驻免疫细胞（如库普弗细胞）8。因此，如其他文献所报道的组织机械固定方法6,9，可能会干扰活体显微成像。

在健康的肝脏中，10%至15%的总血容量存在于肝脏血管系统内，该器官接收约25%的总体心输出量10，使得器官对血液循环的变化极为敏感（例如血压波动）。因此，由于肝血流的中断可能导致 例如剪切应力、位移、因过度组织操作或体外循环导致的损伤，将引起白细胞迁移行为的人为改变、肝脏氧合受损，从而进一步造成肝损伤，影响肝脏免疫反应以及器官保存效果和实验动物的整体生存时间。

早期的显微 研究基于活体落射荧光显微技术，但光漂白和穿透深度低等若干技术限制使得该技术难以用于长期的肝脏成像4,11,12。随着20世纪90年代多光子显微技术的发展，光漂白和穿透深度等主要技术难题已基本得以解决，因为这一新技术能够在接近真实生理条件下对几乎所有器官进行成像研究13-15。然而，肝脏成像仍面临的主要挑战包括：呼吸运动、肝组织自发荧光、肝窦内血流的稳定维持，以及尤其需要实现持续数小时的稳定成像16。

尽管已有若干研究探讨了不同类型白细胞在肝脏中的功能与迁移17, 例如，NKT细胞18-20，T细胞21,22肝巨噬细胞23,24 或中性粒细胞25，长期的多光子显微成像尚未成功建立，而在患有急性或慢性肝病的动物中，这一任务更具挑战性，因为肝脏已存在损伤，因而对进一步损伤更为敏感26然而，实时监测肝脏中白细胞的迁移行为和细胞功能，可为它们在肝脏稳态及疾病中的特定作用提供新的见解27.

趋化因子受体CXCR6表达于多种淋巴细胞亚群，包括自然杀伤（NK）细胞、NKT细胞以及某些T细胞群体18,28。先前在小鼠中的研究表明，CXCR6及其对应配体CXCL16可能调控NKT细胞在肝脏窦状隙中稳态状态下的巡逻行为。因此，已有研究利用CXCR6.gfp小鼠（在CXCR6基因位点敲入绿色荧光蛋白[gfp]）来探究淋巴细胞在不同器官（如脑29和肝脏18,20）中的迁移情况，结果显示在炎症状态下CXCR6.gfp阳性细胞的浸润增加。

通过本研究提供的方法，能够在稳定条件下长期追踪这些过程。基于活体多光子的实验方案实现了高度可重复的成像，对动物和器官的干扰极小；通过持续监测并严密控制呼吸和循环系统，优化了动物的长期存活率；该方法还具有高度灵活性，易于推广应用于其他实质器官，如肾脏或脾脏。

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方案

注意：实验均遵循《实验动物照护与使用指南》（NIH 出版物，第8版，2011年）以及欧盟关于用于科学目的动物保护的指令2010/63/EU（《欧洲联盟官方公报》，2010年）所规定的德国动物实验相关法律法规进行。德国北莱茵-威斯特法伦州政府动物护理与使用机构（LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Germany）已正式批准本研究。

注意：对于短期成像（例如 快照、三维图像堆栈或短时程延时显微镜），可省略的步骤以星号（*）标出，以减少准备时间并简化手术流程。如有必要，成像也可在不进行广泛监测和循环控制的情况下进行，但存活时间将显著缩短。

1. 显微镜设置与术前准备（5-10 分钟）

  1. 打开系统（显微镜、PowerLab、激光器、加热垫、气候箱、网络摄像头、注射泵装置、呼吸机）。
  2. 连接 O2 连接至异氟烷挥发罐，将异氟烷浓度设为1.5 Vol%（v/v），并连接小型动物呼吸机。
    1. 短期成像时，初始阶段后仅使用异氟烷维持麻醉 i.p. 麻醉诱导（参见步骤2.2）。随后使用2 Vol%（v/v）异氟烷，并将成像时间控制在2小时以内，以确保肝脏微循环的稳定。
  3. 将呼吸频率设置为 120–140 次呼吸周期/分钟 体积为150-200 µl。
  4. 设置小鼠琼脂糖固定装置。配制100 ml 3%（w/v）琼脂糖溶液，以约40°角倒入培养皿（底部约10 cm × 15 cm）中。
  5. 准备手术工作区域，收集所需的器械。 为防止微生物污染，实验前使用1%的Sekusept Forte S（9.9% w/v）、9.8% w/v Glutaral或甲醛溶液对器械消毒5分钟图1A).
  6. 获取其余组件：皮肤消毒剂（例如，10% 聚维酮碘溶液），肝期（stacks & 桥），琼脂糖溶液（3% (w/v) PBS 配制），含 5% (w/v) 葡萄糖溶液（G-5）的注射泵，含麻醉剂溶液 I（氯胺酮 0.1 mg/ml，赛拉嗪 0.5 mg/ml，芬太尼 5 µg/ml）的注射泵，棉签，正丁基-2-氰基丙烯酸酯，以及 1× PBS。将琼脂糖制备皿放入培养室中预热。

2. 气管切开术（10-15 分钟）

  1. 使用本单位繁育的体重为25–28 g的C57BL/6小鼠。按照FELASA指南要求，在温度与湿度受控、12小时光照/12小时黑暗循环的特定病原体-free环境中饲养小鼠。动物可自由获取标准小鼠饲料（Sniff Standard Rodent Diet）和水。
  2. 通过腹腔注射 250 µl 麻醉液 II（氯胺酮 0.1 mg/ml，赛拉嗪 1 mg/ml，布托啡诺 10 µg/ml）对小鼠进行麻醉。
    1. * 为维持活体成像期间的麻醉状态，使用注射泵装置以0.2 ml/hr的流速持续通过腹腔注射给予麻醉溶液I（氯胺酮 0.1 mg/ml，赛拉嗪 0.5 mg/ml，芬太尼 5 µg/ml） 联合使用吸入性异氟烷 0.5 Vol%（v/v）。
    2. 5 分钟后检查反射例如 用镊子夹住足垫），对气管切开部位的皮肤进行消毒，若小鼠已进入手术耐受麻醉状态，即可开始准备。
    3. 涂抹眼部保护霜（例如，泛醇 50 mg/g）以防止角膜干燥（图1B).
  3. 将小鼠仰卧位固定于操作台，四肢用胶带固定；轻柔拉伸颈部并保持该位置固定， 例如通过将橡皮筋钩在切牙上实现。
    1. 使用棉签蘸取聚维酮碘溶液对皮肤和毛发进行消毒。
  4. 在下颌正下方进行初始皮肤切口（0.5–1 cm长）图1C)
    1. 仔细解剖唾液腺之间的结缔组织（图1D).
    2. 小心撕开气管周围包裹的肌肉管图1E,F).
  5. 在气管下方放置手术缝线，用于后续固定通气管图1G).
    1. 用显微剪刀在气管软骨环之间做T形切口，打开气管图1H)
  6. 通过切口（约0.5 cm）将通气管插入气管。推进导管时，用小型解剖镊夹住导管尾端，轻柔地将导管向前送入气管图1I)
  7. 用手术缝合线固定试管（例如，5-0）缝线按照步骤2.5将气管导管在气管内打结固定；在皮肤处对导管进行第二次头侧固定，以避免导管意外移位（图1J,K).
  8. 用组织胶密封切口例如，正丁基-2-氰基丙烯酸酯）（图1L).
  9. 使用胶带将试管在头部位置固定。

3. 剖腹手术（15-20 分钟）

  1. 将小鼠置于加热垫上以防止低体温。剃除腹部毛发，小心地将皮肤上的毛发清理干净。使用聚维酮碘溶液对剃毛后的皮肤及周围毛发进行消毒。
  2. 使用手术剪在胸骨下方做一个小的皮肤切口（图2A）。沿肋骨下方将切口向两侧横向延伸，同时对所有可见的血管进行电凝止血，以防止出血。
  3. 在胸骨下方的腹白线上小心地做一小切口，打开腹膜（图2B）。使用电凝技术向两侧延伸切口，以防止出血（图2C, D）。
  4. 将小鼠放入琼脂糖固定皿中（图2E）。在小鼠身体两侧放置适当高度的垫片（通常为12–14张盖玻片厚度）（图2F）。
  5. 将呼吸触发传感器置于小鼠上背部下方，以实现显微镜与呼吸节律的同步。启动触发装置（图2G）。
  6. 将手术缝线（5-0）穿过胸骨，用于牵拉肋骨（图2I）。
  7. 使用弯头手术剪小心剪断连接肝脏与膈肌的韧带（镰状韧带），以及肝脏与胃肠道之间的连接组织。将镰状韧带沿腹主动脉方向剪至主动脉处（图2J）。

4. 样品准备（10-15 分钟）

  1. 将小鼠以45°角置于右侧，以便于接触肝脏大叶。
  2. 在肋骨下方添加支架桥，覆盖腹腔。使用标准盖玻片并用胶带包裹其边缘以覆盖锋利部分来制作支架桥（图 2K).
  3. 将肝脏大叶置于载物台上。小心地将双球探针或带垫的刮勺插入肝脏下方，并用湿润的棉签或湿纸巾轻托肝脏上部。将肝叶轻轻提起至载玻片上，并施加轻柔的牵拉力。肝叶可适度弯曲或折叠。操作过程中需格外注意，仅对肝脏进行轻柔处理（图 2L).
  4. 放置侧向支撑桩， 例如，若干小载玻片（20 mm × 20 mm），其高度与相邻肝叶大致相同，用于支撑盖玻片。
  5. 将大型盖玻片（24 mm × 50 mm）置于肝叶上，确保盖玻片尽可能保持水平方向图 2M).
    注意：盖玻片应与组织接触，但不可挤压组织。检查是否存在血流受阻的可见迹象（组织发白）。若微循环受到干扰，需增加支撑物。
  6. * 放置两根独立的腹腔内导管（图2N用于长期麻醉和G-5给药。在下腹部靠近后肢的侧方位置植入导管。
    注意：腹腔导管可通过将27 G针头与柔性硅胶管连接自制而成（图3).
  7. 用5-0外科缝线将针具固定在皮肤上的线环中，以防止意外移位。
  8. * 将装有麻醉溶液 I 的注射泵连接至导管 1，设定流速为 0.2 ml/hr；将装有 G-5 的注射泵连接至导管 2，设定流速为 0.1 ml/hr。

5. 小鼠监测

  1. * 将心电图电极放置于前肢和后肢（图4A）。
  2. * 将呼气管路连接至CO2浓度传感器。
  3. 连接与加热垫相连的外部温度传感器（图4C）。

6. 包埋与组织固定（5-10 分钟）

  1. 配制 100 ml 含 3% (w/v) 琼脂糖的 1X PBS 溶液。当温度降至 41 °C 时，使用 5 ml 注射器和 18 G 针头将肝脏包埋（图 5A）。
  2. 将剩余的琼脂糖倒在盖玻片及小鼠周围（图 5B、C），静置至琼脂糖完全凝固。
  3. 使用 Heidemann 铲除去多余的琼脂糖，制备出足够大的观察区域，以便扫描已准备好的肝叶（图 5D、E）。

7. 成像

  1. 将小鼠转移至显微镜气候室。
  2. 加入 50–100 ml 预热至 37 °C 的 1× PBS。
  3. 覆盖样品皿以防止蒸发（图 5F）。
  4. * 将吸入式异氟烷浓度降低至 0.5 Vol%（v/v）。
  5. * 启动监测软件，记录心电图、心率和呼气末 CO2。
  6. 开始成像：打开激光快门，确定感兴趣的视野，设定 Z-层扫描的上下边界，并开始延时记录。如有必要，重新调整 Z-层扫描以校正 Z-轴漂移（例如 由于血压或温度波动所致，图 (5G)）。
    注意：成像结束后，或当动物循环或麻醉状态不稳定时，通过颈椎脱臼法处死小鼠（无需从麻醉中苏醒）。

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结果

为了验证我们的活体TPLSM方法，我们对CXCR6gfp/+小鼠进行了活体TPLSM成像。小鼠要么不做任何处理作为基线对照，要么接受一次腹腔注射四氯化碳（CCl4）以诱导急性肝损伤20。

在2-5小时的时间段内采集视频序列，并根据细胞的绿色荧光随时间追踪细胞运动轨迹。为了展示细胞的一般运动性，将实验过程中检测到的所有轨迹叠加绘制为一幅图像（图6A）。在基础状态下，细胞沿肝窦状隙向中央静脉进行长距离迁移；而在CCl4处理18小时后，CXCR6+/gfp 细胞的运动模式已出现部分受损。尽管仍有一些快速移动的细胞存在于肝窦状隙中，但已可观察到多个局部区域的细胞由随机迁移转变为局部扫描行为，提示趋化性反应正在将这些细胞募集至损伤区域。该效应在36小时后更加显著，表现为CXCR6+细胞几乎完全停滞，几乎不再有主动迁移现象。在基础条件下，大多数迁移细胞表现出可变的迁移速度并伴随随机的方向改变；而在CCl4处理...

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讨论

本研究的目的是建立一种高度标准化、稳定且可重复的活体肝脏双光子激光扫描显微（TPLSM）成像方法。总体而言，活体成像技术已在真实生理条件下提供了关于不同白细胞群体在发育、稳态及疾病过程中归巢与相互作用的宝贵见解。然而，由于肝脏解剖位置较为特殊，呼吸运动和肠道蠕动会直接传递至肝脏，加之其相对于其他实体器官更为脆弱，这为实现稳定的长期活体成像带来了诸多挑战。近年来，许多小鼠实验研究揭示了损伤肝脏中免疫细胞浸润的高度动态特性28，其中定居或浸润的单核细胞/巨噬细胞30-32、中性粒细胞33以及多种淋巴细胞亚群34,35发挥了重要作用。然而，这些数据大多来源于终点分析（例如，在处死动物后进行的多色流式细胞术）。迄今为止，仅有少数研究利用多色活体成像技术描述肝脏炎症过程中细胞迁移的动力学特征。使用倒置显微镜可避免对肝脏进行固定和保湿处理，因为组织能牢固地黏附于玻璃底培养皿上24。但由于许多多光子显微镜采用直立式成像系统，因此需要更复杂的制备和固定方法，以在成像期间稳定组织。通常已有文献报道使用定制的载物台系统进行组织固定...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢亚琛大学医院中央动物实验中心提供的技术支持。本工作由德国研究基金会（DFG Ta434/2-1，DFG SFB/TRR 57）和亚琛大学医学院跨学科临床研究中⼼（IZKF Aachen）资助。此外，本工作还得到了“双光子成像”核心设施的支持，该设施隶属于亚琛工业大学医学院跨学科临床研究中心（IZKF Aachen）的核心设施平台。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
麻醉剂
布托啡诺Essex Pharma997.00.00镇痛药，0.1 mg/kg
芬太尼Rotex Medica批号: 30819
Fluovac 麻醉系统Harvard Apparatus34-1030
5% 葡萄糖Braun
ISOFLO（异氟烷蒸汽）蒸发器Eickemeyer4802885
异氟烷Forene AbbottB 506
等渗（0.9%）NaCl 溶液DeltaSelect GmbHPZN 00765145
10% 氯胺酮ceva批号: 36217/09
2% 赛拉嗪medistar批号: 04-03-9338/23
耗材
20 ml 注射器BD Plastipak
250 ml 锥形瓶Schott Duran21 226 36
25 ml 烧杯 ×2Schott Duran50-1150
2 ml 注射器BD Plastipak
4-0 Vicryl 缝线EthiconV7980
琼脂糖市售可得
Bepanthen 眼鼻软膏Bayer Vital GmbH6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe 高温电灼套装Fine Science Tools Inc.18010-00
棉质纱布拭子Fuhrmann GmbH32014
盖玻片 24×50 mmROTH1871
Durapore 丝质胶带3M1538-1
Feather 一次性手术刀Feather02.001.30.011
细内径聚乙烯导管 0.58 mm 内径Smiths medical800/100/200
HistoacrylBraun10500525×0.5 ml
LeukoplastBSN Medical Inc.
显微镜载玻片ROTH1879
聚醇类皮肤…无色抗菌剂Antiseptica GmbH72PAH200
Sterican 针头 18 G × 1B. Braun304622
Sterican 针头 27 3/4 G × 1B. Braun4657705
纸巾市售可得
手术器械
银汞合金抛光器 3PLGatz0110?
Blair 拉钩（四齿，钝头）×2Storz&KleinS-01134
Dumont No.7 镊子Fine Science Tools Inc.91197-00
Graefe 镊子，弯头 ×1Fine Science Tools Inc.11151-10
Graefe 镊子，直头 ×2Fine Science Tools Inc.11050-10
Heidemann 刮匙 HD2Stoma2030.00
Mathieu 持针钳Fine Science Tools Inc.12010-14
剪刀Fine Science Tools Inc.14074-11
Semken 镊子Fine Science Tools Inc.11008-13
小型弯头手术剪Fine Science Tools Inc.14029-10
小型直头手术剪Fine Science Tools Inc.14028-10
标准型镊子Fine Science Tools Inc.11000-12
Vannas 弹簧剪Fine Science Tools Inc.15000-08
设备
ECG 触发单元Rapid Biomedical3000003686
MICROCAPSTAR 末梢二氧化碳分析仪AD Instruments
Minivent Typ 845Harvard Apparatus73-0043
多光子显微镜 Trimscope ILaVision
Perfusor CompactB. Braun
PowerLab 8/30 八通道记录仪AD InstrumentsPL3508
温控加热垫Sygonix26857617
温度传感器市售可得
显微镜用温控系统 - Cube&BoxLife Imaging Services

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