在肝脏中对免疫细胞进行稳定的活体高分辨率成像具有挑战性。本文提供了一种高灵敏度且可靠的方法，结合重症监护监测，利用活体多光子激光扫描显微镜，对小鼠肝脏中免疫细胞的迁移及细胞间相互作用进行长时间（约6小时）的观察研究。
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方法文章
利用CXCR6.Gfp报告小鼠对健康与病变肝脏中免疫细胞进行长期活体多光子显微镜成像
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
肝脏在受到损伤后引发的炎症反应是一个高度动态的过程，涉及多种白细胞亚群的浸润，包括单核细胞、中性粒细胞、T细胞亚群、B细胞、自然杀伤（NK）细胞以及NKT细胞。由于对样本制备与固定、光学分辨率以及动物长期存活等方面要求极高，利用活体显微技术对肝脏进行免疫细胞迁移的监测尤为困难。然而，炎症过程的动态变化以及细胞间相互作用的研究，可为深入理解炎症性肝病的启动、进展与消退提供关键信息。因此，本研究建立了一种高灵敏度且可靠的方法，结合重症监护监测，通过活体双光子激光扫描显微技术（TPLSM），在较长时间（约6小时）内对小鼠肝脏中不同免疫细胞的迁移行为及细胞间相互作用进行观察研究。
该方法包括对肝脏进行温和的制备和稳定的固定，最大限度减少对器官的干扰；利用多色多光子显微镜进行长达6小时的长期活体成像，几乎不产生光漂白或光毒性效应，从而实现对特定白细胞亚群的追踪；同时由于对小鼠生命体征参数进行了全面监测，并对血液循环、体温和气体交换进行了稳定控制，确保了成像条件的稳定。
为了研究肝脏炎症条件下淋巴细胞的迁移，将CXCR6.gfp基因敲入小鼠在基线状态以及通过腹腔注射四氯化碳（CCl4）诱导急性与慢性肝损伤后，进行活体肝脏成像。
CXCR6 是一种表达于淋巴细胞上的趋化因子受体，主要表达于自然杀伤T（NKT）细胞、自然杀伤（NK）细胞以及T淋巴细胞亚群（如CD4 T细胞），也表达于黏膜相关不变T（MAIT）细胞1。通过追踪CXCR6.gfp+免疫细胞的迁移模式和定位，可深入了解其在肝损伤情况下行为的改变，从而揭示其在疾病进展中的潜在作用。
引言
对完整器官甚至整个生物体中的细胞及细胞功能进行可视化研究已有超过50年的历史，几乎涵盖了身体的所有部位2。因此，一些早期研究已开始采用活体成像技术对肝脏进行观察3,4。然而，迄今为止，在肝脏组织的长期稳定高分辨率成像方面仍存在多种局限性。
由于肝脏在解剖位置上紧邻膈肌和胃肠道5，显微活体成像最常见的问题是呼吸运动引起的位移，以及程度较轻的肠道蠕动干扰6。与其他实体器官相比，肝脏手术尤为困难。由于其致密的微血管结构，手术操作可能导致大范围出血性损伤、微循环障碍7，并激活常驻免疫细胞（如库普弗细胞）8。因此，如其他文献所报道的组织机械固定方法6,9，可能会干扰活体显微成像。
在健康的肝脏中，10%至15%的总血容量存在于肝脏血管系统内，该器官接收约25%的总体心输出量10，使得器官对血液循环的变化极为敏感（例如血压波动）。因此，由于肝血流的中断可能导致 例如剪切应力、位移、因过度组织操作或体外循环导致的损伤，将引起白细胞迁移行为的人为改变、肝脏氧合受损，从而进一步造成肝损伤，影响肝脏免疫反应以及器官保存效果和实验动物的整体生存时间。
早期的显微 研究基....
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方案
注意：实验均遵循《实验动物照护与使用指南》（NIH 出版物，第8版，2011年）以及欧盟关于用于科学目的动物保护的指令2010/63/EU（《欧洲联盟官方公报》，2010年）所规定的德国动物实验相关法律法规进行。德国北莱茵-威斯特法伦州政府动物护理与使用机构（LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Germany）已正式批准本研究。
注意：对于短期成像（例如 快照、三维图像堆栈或短时程延时显微镜），可省略的步骤以星号（*）标出，以减少准备时间并简化手术流程。如有必要，成像也可在不进行广泛监测和循环控制的情况下进行，但存活时间将显著缩短。
1. 显微镜设置与术前准备（5-10 分钟）
- 打开系统（显微镜、PowerLab、激光器、加热垫、气候箱、网络摄像头、注射泵装置、呼吸机）。
- 连接 O2 连接至异氟烷挥发罐，将异氟烷浓度设为1.5 Vol%（v/v），并连接小型动物呼吸机。
- 短期成像时，初始阶段后仅使用异氟烷维持麻醉 i.p. 麻醉诱导（参见步骤2.2）。随后使用2 Vol%（v/v）异氟烷，并将成像时间控制在2小时以内，以确保肝脏微循环的稳定。
- 将呼吸频率设置为 120–140 次呼吸周期/分钟....
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结果
为了验证我们的活体TPLSM方法，我们对CXCR6gfp/+小鼠进行了活体TPLSM成像。小鼠要么不做任何处理作为基线对照，要么接受一次腹腔注射四氯化碳（CCl4）以诱导急性肝损伤20。
在2-5小时的时间段内采集视频序列，并根据细胞的绿色荧光随时间追踪细胞运动轨迹。为了展示细胞的一般运动性，将实验过程中检测到的所有轨迹叠加绘制为一幅图像（图6A）。在基础状态下，细胞沿肝窦状隙向中央静脉进行长距离迁移；而在CCl4处理18小时后，CXCR6+/gfp 细胞的运动模式已出现部分受损。尽管仍有一些快速移动的细胞存在于肝窦状隙中，但已可观察到多个局部区域的细胞由随机迁移转变为局部扫描行为，提示趋化性反应正在将这些细胞募集至损伤区域。该效应在36小时后更加显著，表现为CXCR6+细胞几乎完全停滞，几乎不再有主动迁移现象。在基础条件下，大多数迁移细胞表现出可变的迁移速度并伴随随机的方向改变；而在CCl4处理.......
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讨论
本研究的目的是建立一种高度标准化、稳定且可重复的活体肝脏双光子激光扫描显微（TPLSM）成像方法。总体而言，活体成像技术已在真实生理条件下提供了关于不同白细胞群体在发育、稳态及疾病过程中归巢与相互作用的宝贵见解。然而，由于肝脏解剖位置较为特殊，呼吸运动和肠道蠕动会直接传递至肝脏，加之其相对于其他实体器官更为脆弱，这为实现稳定的长期活体成像带来了诸多挑战。近年来，许多小鼠实验研究揭示了损伤肝脏中免疫细胞浸润的高度动态特性28，其中定居或浸润的单核细胞/巨噬细胞30-32、中性粒细胞33以及多种淋巴细胞亚群34,35发挥了重要作用。然而，这些数据大多来源于终点分析（例如，在处死动物后进行的多色流式细胞术）。迄今为止，仅有少数研究利用多色活体成像技术描述肝脏炎症过程中细胞迁移的动力学特征。使用倒置显微镜可避免对肝脏进行固定和保湿处理，因为组织能牢固地黏附于玻璃底培养皿上24。但由于许多多光子显微镜采用直立式成像系统，因此需要更复杂的制备和固定方法，以在成像期间稳定组织。通常已有文献报道使用定制的载物台系统进行组织固定.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢亚琛大学医院中央动物实验中心提供的技术支持。本工作由德国研究基金会（DFG Ta434/2-1，DFG SFB/TRR 57）和亚琛大学医学院跨学科临床研究中⼼（IZKF Aachen）资助。此外，本工作还得到了“双光子成像”核心设施的支持，该设施隶属于亚琛工业大学医学院跨学科临床研究中心（IZKF Aachen）的核心设施平台。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 麻醉剂 | |||
| 布托啡诺 | Essex Pharma | 997.00.00 | 镇痛药，0.1 mg/kg |
| 芬太尼 | Rotex Medica | 批号: 30819 | |
| Fluovac 麻醉系统 | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| 5% 葡萄糖 | Braun | ||
| ISOFLO（异氟烷蒸汽）蒸发器 | Eickemeyer | 4802885 | |
| 异氟烷 | Forene Abbott | B 506 | |
| 等渗（0.9%）NaCl 溶液 | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| 10% 氯胺酮 | ceva | 批号: 36217/09 | |
| 2% 赛拉嗪 | medistar | 批号: 04-03-9338/23 | |
| 耗材 | |||
| 20 ml 注射器 | BD Plastipak | ||
| 250 ml 锥形瓶 | Schott Duran | 21 226 36 | |
| 25 ml 烧杯 ×2 | Schott Duran | 50-1150 | |
| 2 ml 注射器 | BD Plastipak | ||
| 4-0 Vicryl 缝线 | Ethicon | V7980 | |
| 琼脂糖 | 市售可得 | ||
| Bepanthen 眼鼻软膏 | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Change-A-Tip Deluxe 高温电灼套装 | Fine Science Tools Inc. | 18010-00 | |
| 棉质纱布拭子 | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| 盖玻片 24×50 mm | ROTH | 1871 | |
| Durapore 丝质胶带 | 3M | 1538-1 | |
| Feather 一次性手术刀 | Feather | 02.001.30.011 | |
| 细内径聚乙烯导管 0.58 mm 内径 | Smiths medical | 800/100/200 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | 5×0.5 ml |
| Leukoplast | BSN Medical Inc. | ||
| 显微镜载玻片 | ROTH | 1879 | |
| 聚醇类皮肤…无色抗菌剂 | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican 针头 18 G × 1 | B. Braun | 304622 | |
| Sterican 针头 27 3/4 G × 1 | B. Braun | 4657705 | |
| 纸巾 | 市售可得 | ||
| 手术器械 | |||
| 银汞合金抛光器 3PL | Gatz | 0110? | |
| Blair 拉钩（四齿，钝头）×2 | Storz&Klein | S-01134 | |
| Dumont No.7 镊子 | Fine Science Tools Inc. | 91197-00 | |
| Graefe 镊子，弯头 ×1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe 镊子，直头 ×2 | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Heidemann 刮匙 HD2 | Stoma | 2030.00 | |
| Mathieu 持针钳 | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| 剪刀 | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken 镊子 | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| 小型弯头手术剪 | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| 小型直头手术剪 | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| 标准型镊子 | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas 弹簧剪 | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| 设备 | |||
| ECG 触发单元 | Rapid Biomedical | 3000003686 | |
| MICROCAPSTAR 末梢二氧化碳分析仪 | AD Instruments | ||
| Minivent Typ 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| 多光子显微镜 Trimscope I | LaVision | ||
| Perfusor Compact | B. Braun | ||
| PowerLab 8/30 八通道记录仪 | AD Instruments | PL3508 | |
| 温控加热垫 | Sygonix | 26857617 | |
| 温度传感器 | 市售可得 | ||
| 显微镜用温控系统 - Cube&Box | Life Imaging Services |
参考文献
- Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
- Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluores....
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重印与许可
