研究髓质胸腺上皮细胞 体外 在很大程度上并不成功，因为现有的二维培养系统无法模拟 体内 该3D培养系统——一种改良的皮肤类器官培养模型——在模拟胸腺上皮细胞（mTEC）的增殖、分化以及异位基因表达的维持方面表现出更优效果。
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方法文章
支持髓质胸腺上皮细胞增殖、分化及异位基因表达的三维类器官共培养模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
胸腺内T细胞发育需要由多种基质细胞构成的复杂三维网状结构， 即， 非T细胞。胸腺细胞在迁移过程中以高度协调的时间和空间顺序穿越这一支架，并依次通过必需的检查点， 即， T细胞谱系定向，随后在T细胞输出至外周前进行T细胞受体库的生成与选择。构成该支架的两种主要常驻细胞类型是皮质胸腺上皮细胞（cTECs）和髓质胸腺上皮细胞（mTECs）。mTECs的一个关键特征是所谓大量组织限制性抗原的异位表达。这些组织限制性抗原分别由mTECs或胸腺树突状细胞直接或间接呈递给未成熟胸腺细胞，从而诱导自身耐受。
合适的 体外 目前尚缺乏能够模拟皮质型胸腺上皮细胞（cTECs）和髓质型胸腺上皮细胞（mTECs）发育通路及其功能的模型。这种实验模型的缺失，例如阻碍了对异位性基因表达的研究，而该过程在细胞和分子水平上仍知之甚少。我们改进了一种三维类器官共培养模型用于培养 离体 分离的mTECs。该模型最初设计用于以生成皮肤等效物的方式培养角质形成细胞 体外3D 模型保留了胸腺上皮细胞（mTEC）生物学的关键功能特征：（i）CD80 的增殖与终末分化lo，Aire阴性至CD80你好，表达 Aire 的胸腺上皮细胞，（ii）对 RANKL 的反应性，以及（iii）在 CD80 阳性细胞中持续表达 FoxN1、Aire 和组织限制性基因你好 mTECs
引言
发育中的胸腺细胞约占胸腺细胞总数的98%，其余2%由多种细胞组成， collectively 构成胸腺基质（即 上皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、成纤维细胞、内皮细胞）。外层皮质上皮细胞（cTECs）负责从骨髓招募前体T细胞，诱导多能前T细胞的T细胞谱系分化，并对具有自身MHC限制性的未成熟胸腺细胞进行阳性选择。内层髓质上皮细胞（mTECs）则通过诱导阴性选择或促使其分化为调节性T细胞谱系，来实现对高亲和力TCR识别自身肽/MHC复合物的胸腺细胞的耐受诱导。在中枢耐受诱导过程中，mTECs的独特之处在于其能够表达广泛谱系的组织限制性自身抗原（TRAs），从而模拟外周组织的自身抗原表达。这一现象被称为异位基因表达（promiscuous gene expression, pGE）1,2。
目前大多数关于这种迷人细胞类型的研究都依赖于ex vivo分离的细胞，因为各种短期二维培养系统均会在前2天内不可避免地导致pGE以及MHC II类分子、FoxN1和Aire等关键调控分子的丢失3-6。然而，此前尚不清楚完整的胸腺三维网状结构中哪些特定组分和特征在二维模型中缺失。胸腺再聚集器官培养（RTOC）迄今为止是唯一一种能够在完整胸腺微环境中同时研究T细胞发育和基质细胞生物学的三维体系7。然而，RTOC存在一定的局限性，即其本身已包含复杂的混合细胞群体，需要输入胎鼠....
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方案
本研究已获得卡尔斯鲁厄政府地区委员会伦理委员会的批准。所有动物均饲养于德国癌症研究中心（DKFZ）的无特定病原体环境中。所有培养实验均使用出生后1至7天的小鼠幼崽。
1. 从胸腺中分离 mTEC
注意：以下消化步骤按照先前所述方法1在无菌条件下进行，但有一些修改，如下所述。
- 处死小鼠幼崽并取出胸腺。将胸腺置于含有 RPMI 1640 培养基（含 5% FCS）的培养皿中，并置于冰上。
- 将胸腺切成细小碎片，放入圆底试管中，加入约 5–30 mL RPMI 培养基，在室温下用磁力搅拌器轻轻搅拌 10 分钟。
- 随后，倾去上清液（主要含胸腺细胞），将剩余组织依次进行消化：首先使用 IV 型胶原酶（终浓度为 0.2 mg/mL 和 57 U/mL）在 37 °C 水浴中磁力搅拌消化 15 分钟，接着使用胶原酶/分散酶（终浓度为 0.2 mg/mL 和 1.2 U/mL）在 37 °C 水浴中磁力搅拌消化 25 分钟，直至胸腺组织完全消化。每两至三个胸腺使用 1 mL 酶液。
- 每隔 7–10 分钟用巴斯德吸管轻轻振荡组织一次。收集胶原酶/分散酶消化液，并通过 70 µm 滤网过滤。
- 通过磁性细胞分选（MACS）富集 mTEC。按照先前描述的方法11并如图 1
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结果
我们采用了一种最初为...而开发的三维类器官共培养模型（3D OTC） 体外 角质形成细胞的长期培养9. 经MACS富集的mTECs（参见MACS富集方案） 图1) 接种到由纤维蛋白凝胶和包埋的成纤维细胞组成的支架上。成纤维细胞提供支持mTECs所需的必需细胞外基质（ECM） 体外MTECs 在 OTCs 中以 RANKL 处理，在淹没培养条件下培养 4–14 天，与角质形成细胞不同，后者采用气液界面培养以模拟其生理环境 体内 环境（参见OTC设置示意图） 图2).
此处分析的两种 mTEC 亚群（即， CD80lo 和 CD80你好 mTECs）在整个长达14天的培养期间均存活。mTECs通过角蛋白14表达进行鉴定，并可与波形蛋白阳性的成纤维细胞明确区分。图 3A, 3B）。有.......
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讨论
与RTOCs相比，3D OTCs在胸腺上皮细胞（TEC）分化以及前体生发上皮（pGE）的维持/诱导方面显著优于其他培养系统（表1），包括：(i) 仅使用成纤维细胞但无支架的“简化3D培养”；(ii) 采用成纤维细胞/饲养细胞与TECs共培养的2D体系10；(iii) TEC克隆可在3T3-J2细胞上形成，但pGE会丢失；(iv) Matrigel或(v) 细胞外基质（ECM）组分（未发表数据）。在3D OTCs中，pGE可维持长达7天，其中第4天为最佳时间点，此后pGE开始下降。其他TEC的形态学特征可维持达14天。值得注意的是，OTCs支持mTEC终末分化的阶段，表现为偶尔形成的类似哈塞尔小体（Hassall-like）的结构10。
用于器官型胸腺培养（OTC）的胸腺组织取自新生幼鼠，因为与成年小鼠胸腺相比，其在体外培养中具有更高的存活倾向。目前尚未在OTC中测试来源于胚胎期胸腺的胸腺上皮细胞（TEC）。此外，在长时间消化后（未使用胰蛋白酶，以避免裂解某些表位），使用磁珠分选（MACS）获得的细胞比使用.......
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披露
作者声明不存在任何财务或商业利益冲突。
致谢
本工作得到了德国癌症研究中心（DKFZ）、欧盟“Tolerage”联盟、德国研究基金会（SFB 938）以及巴登-符腾堡州基金会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 妊娠 C57BL/6 小鼠 | Charles River WIGA | ||
| LS 柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MS 柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| CD45 微珠（小鼠） | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| 抗 PE 微珠 | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| 链霉亲和素微珠 | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| EpCAM（G8.8-Alexa 647 和 -生物素） | 参考文献 12 | ||
| CD80-PE 抗体 | BD Pharmingen | 553769 | |
| CD45-PerCP 抗体 | BD Pharmingen | 557235 | |
| Ly51-FITC 抗体 | BD Pharmingen | 553160 | |
| CDR1-太平洋蓝 | 参考文献 15 | ||
| 角蛋白 14 抗体 | Covance | PRB-155P | |
| 波形蛋白抗体 | Progen | GP58 | |
| Cy3 标记的 AffiniPure 山羊抗兔 IgG（H+L） | Jackson ImmunoResearch | 111-165-003 | |
| Alexa 488 标记的 AffiniPure F(ab')2 片段山羊抗豚鼠 IgG（H+L） | Jackson ImmunoResearch | 106-546-003 | |
| 山羊抗兔 IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488 标记 | Molecular Probes (Invitrogen GmbH) | A-11008 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 成像试剂盒 | Invitrogen | C10339 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 流式细胞术检测试剂盒 | Invitrogen | C10425 | |
| 12 孔滤膜插件（thincerts） | Greiner bio-one | 657631 | |
| 12 孔板 | Greiner | 665180-01 | |
| Jettex 2005/45 | ORSA, Giorla Minore, Italy | ||
| 纤维蛋白原 TISSUECOL-试剂盒 免疫级 | Baxter | ||
| 凝血酶 TISSUECOL-试剂盒 免疫级 | Baxter | ||
| PBS | Serva | 47302.03 | |
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| DMEM/F12 | Lonza | BE12-719F | |
| HEPES | Gibco | 15630-049 | |
| FBS Gold | GE Healthcare | A11-151 | |
| 抑肽酶（Trasylol） | Bayer | 4032037 | |
| 霍乱毒素 | Biomol | G117 | |
| 氢化可的松 | Seromed (Biochrom) | K3520 | |
| L-抗坏血酸 | Sigma | A4034 | |
| TGF-ß1 | Invitrogen | PHG9214 | |
| RANKL | R&D systems | 462-TR-010 | |
| 嗜热菌蛋白酶 | Sigma Aldrich | T-7902 | |
| OCT 包埋剂 | TissueTek | 4583 | |
| Trizol（又称变性液——酸性硫氰酸胍-酚-氯仿提取法） | Invitrogen | 10296028 | |
| FastPrep FP120 | Thermo Scientific | ||
| IV 型胶原酶 | CellSystems | LS004189 | 终浓度为 0.2 mg/ml 和 57U/ml |
| 中性蛋白酶（Dispase） | CellSystems | LS002104 | 终浓度为 0.2 mg/ml 和 1.2U/ml |
| DNase I | Roche | 11 284 932 001 | 终浓度为 25 µg/ml |
参考文献
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology....
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