本实验方案的目的是在小鼠原位胰腺肿瘤异种移植模型中应用动态对比增强磁共振成像（DCE-MRI）。DCE-MRI是一种用于分析目标组织中微血管结构的非侵入性方法，可用于评估肿瘤在接受新型治疗后血管系统的反应。
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摘要
摘要
由于腹部区域严重的呼吸运动伪影，动态对比增强磁共振成像（DCE-MRI）在原位胰腺肿瘤异种移植模型中的应用受到限制。与皮下移植模型相比，原位肿瘤模型具有优势，因为其能够更好地反映影响血液供应、新生血管形成以及肿瘤细胞侵袭的原发性肿瘤微环境。我们近期建立了一种在小鼠模型中原位胰腺肿瘤异种移植的DCE-MRI检测方案，通过使用正交弯曲的塑料板固定肿瘤，防止成像过程中胸部运动传递至肿瘤区域。该塑料板施加的压力局限于腹部区域，未引起动物呼吸困难。本文详细展示了利用小型动物建立原位胰腺肿瘤模型以及对肿瘤异种移植体进行DCE-MRI检测的具体操作步骤。同时介绍了DCE-MRI中药代动力学参数的定量分析方法。本文所述方法将有助于研究人员将DCE-MRI技术应用于原位胃肠道肿瘤小鼠模型的研究。
引言
本方法的总体目标是将动态对比增强磁共振成像（DCE-MRI）应用于小鼠原位胰腺肿瘤异种移植模型。DCE-MRI 是一种无创性方法，通过在注射对比剂后的一段时间内监测磁共振信号的变化，评估目标组织中的微血管结构。DCE-MRI 已被用于恶性肿瘤的诊断以及评估肿瘤对各种治疗的反应1-4。定量 DCE-MRI 具有较高的可重复性5。为了定量分析目标组织中磁共振对比剂的药代动力学参数，必须对不同时间点采集的所有 DCE-MR 图像以及对比剂注射前获得的 T1 图进行图像配准6。然而，由于腹部区域存在呼吸和肠蠕动运动，定量 DCE-MRI 在胃肠道肿瘤中的应用受到一定限制。
原位胰腺肿瘤模型已被用于评估胰腺肿瘤在接受生物治疗和化疗后的反应7,8。由于原位肿瘤模型能够反映原始肿瘤部位的微环境，因而相较于传统的皮下移植模型更具优势，可更准确地预测人类肿瘤对治疗的反应。然而，小鼠胰腺位于腹腔左上象限，因此对小鼠原位胰腺肿瘤异种移植模型进行定量动态对比增强磁共振成像（DCE-MRI）尚未得到广泛应用。
我们已建立了一种小鼠腹部肿瘤的DCE-MRI检测方案，通过使用正交弯曲的塑料板固定肿瘤，以防止胸部运动传递至腹部区域9。该塑料板施加的压力局限于腹部区域，且未引起呼吸困难。尽管已有研究验证了在自由呼吸模式下对腹部器官进行DCE-MRI的自动图像共配准技术，但该技术仅在目标区域移动缓慢且规律时才有效10。由于动物在成像过程中的呼吸频率存在波动，因此在原位胰腺肿瘤小鼠模型中，有必要对腹部进行物理固定，以获得可靠的药代动力学参数。我们已成功利用正交弯曲塑料板，在DCE-MRI中定量分析了原位胰腺肿瘤异种移植模型中MR对比剂的药代动力学参数11-13。本文将详细介绍原位胰腺肿瘤建模、小鼠异种移植肿瘤的DCE-MRI检测以及药代动力学参数定量分析的具体操作步骤。
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方案
所有实验程序均经伯明翰阿拉巴马大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 原位胰腺肿瘤小鼠模型构建
- 在添加10%胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养标准人胰腺癌细胞系。所有培养物均在37 °C、含5% CO2的湿化气氛中维持。
- 使用8至10周龄的雌性重度联合免疫缺陷小鼠。将动物笼置于室温（21 ± 2 °C）、60%湿度条件下，保持12小时光照与12小时黑暗的循环。
- 在整个手术过程中，通过吸入含2%异氟烷与氧气（2 L/min）的混合气体对所有动物进行麻醉。通过脚趾夹捏反射确认麻醉深度。将动物置于加热垫（37 °C）上以维持体温。在麻醉期间，于眼睛表面涂抹兽用眼膏以防止干燥。
- 剃除每只小鼠腹部左上象限的毛发，并在该区域皮下注射镇痛药物（卡洛芬，5 mg/kg体重）。对暴露的皮肤涂抹聚维酮碘溶液。准备已灭菌的外科手术器械。
- 使用直头虹膜剪在皮肤和腹膜上做1 cm切口。用外科镊子轻轻将胰腺从腹腔中取出。
- 将0.5 ml胰岛素注射器的28 G针头插入胰腺尾部，缓慢注入含有250万个人胰腺癌细胞的30 µl DMEM溶液。通过观察胰头部位是否形成小泡来确认注射成功。
- 用外科镊子将胰腺轻柔地放回腹腔内。使用两针间断的5-0 Prolene缝线单层缝合腹膜和皮肤，随后停止麻醉。在动物完全恢复前，不得将其放回与其他动物同笼饲养。术后7~10天拆除缝线。
- 术后24小时再次给予一次镇痛药物（卡洛芬，5 mg/kg体重，皮下注射）。
- 用两指触诊手术区域以检查肿瘤大小。肿瘤通常比周围组织和器官更致密且表面不平整。通常需要约1至2周才能触及肿瘤。
- 每日监测动物是否有疾病迹象。当动物出现病态（如缺乏正常理毛行为和回避行为）时，我们在麻醉状态下采用颈椎脱位法实施安乐死。
2. 磁共振成像
- 通常在细胞接种后2~4周，当肿瘤直径达到约5 - 7 mm时进行MRI检查。使用专用于小动物成像的MR扫描仪，或配备小动物专用线圈的临床MR扫描仪。
注意：我们使用了一台9.4T的小动物MR扫描仪，结合1H体共振器/发射器和表面接收线圈（直径30 mm）（Bruker BioSpin Corp., Billerica, MA）。表面线圈可提供更高的信噪比（SNR）14。 - 准备基于钆的MRI对比剂，以每只动物约0.1 - 0.2 mmol/kg的剂量溶于约0.1 - 0.2 ml PBS（磷酸盐缓冲盐水）中进行注射。
注意：我们使用了钆特醇，以0.2 mmol/kg的剂量溶于0.15 ml PBS中，在15秒内（0.1 ml/sec）完成注射。 - 准备一段微聚乙烯管（长度：7.62 mm，内径：0.28 mm，外径：0.64 mm）。将一支30 G针头（长度12.7 mm）插入管的一端，另一端插入一支30 G钝头针（长度9.5 mm）。将装有MR对比剂的1 ml注射器连接至钝头针，缓慢推动注射器，使对比剂完全充满整段管道。
- 在整个准备和成像过程中，使用含1 - 2%异氟烷与氧气（2 L/min）的通气方式麻醉动物。通过脚趾夹捏反射确认麻醉深度。麻醉期间在动物眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。在插入针头前使用加热灯扩张尾静脉。用Kelly止血钳夹住30 G针头中部，将其插入尾静脉。用胶带将尾部和管道固定在一块塑料片或硬纸板（宽10 mm × 长100 mm）上，以保持尾部伸直。
- 将动物仰卧位放置于配备循环温水（或热空气）的动物床中，以在成像期间调节体温。将床温设定为37 °C。插入直肠温度探头以监测成像过程中的体温。
- 将一块正交弯曲的塑料板置于腹部区域。确保肿瘤位于该板上端后方，然后轻微下拉该板（约2 mm），以确保肿瘤被板固定。将塑料板牢固地用胶带固定在动物床上。
- 将呼吸垫传感器（SA Instrument, Inc., Stony Brook, NY）贴于胸部区域，以监测成像期间的动物呼吸。将表面线圈置于肿瘤区域上方，并牢固地用胶带固定在动物床上。将动物床推入MR扫描仪，使肿瘤区域位于体线圈（内径72 mm）的中心位置。
- 对发射器和接收器分别进行调谐与匹配，随后进行匀场（shimming）。
- 首先进行解剖结构MR序列扫描以定位肿瘤。采用T2加权（T2W）快速自旋回波序列获取轴向图像，采集参数如下：重复时间（TR）/回波时间（TE）= 3,000/34 msec，矩阵128 × 128，视野30 × 30 mm，平均次数 = 1，回波链长度 = 4，采用交错模式采集20层连续的1 mm厚切片，覆盖整个肿瘤区域（总扫描时间：1.6分钟）。
注意：由于原位胰腺肿瘤比皮下肿瘤更难定位，分辨率较低的传统定位图像可能效果不佳。 - 采用不同翻转角度采集T1加权（T1W）图像以重建T1图。为此，使用梯度回波多翻转角度方法，参数如下：重复时间（TR）/回波时间（TE）= 115/3 msec，矩阵128 × 128，视野30 × 30 mm，平均次数 = 4，采用交错模式采集约5 - 7层连续的1 mm厚切片覆盖肿瘤区域，并使用7个翻转角度：10°、20°、30°、40°、50°、60°和70°（每个翻转角度扫描时间：1分钟）。
注意：但多翻转角度法仅在B1场均匀性较高时才高效。若B1场不均，可改用多TR方法获取T1图15。 - 在注射钆基MR对比剂前后分别采集T1W图像。使用与T1图相同的采集参数和几何设置，但翻转角度固定为30°。采用线性编码方式，确保在获取k空间中心时达到稳态，尤其在使用短TR和低翻转角度时。在对比剂注射前采集5组基线图像，注射后采集40组图像（总扫描时间：45分钟）。使用注射泵以恒定速率（0.01 ml/sec）注射对比剂。
- 持续监测动物呼吸，并调节异氟烷浓度以维持呼吸频率在每分钟50 - 100次。在整个成像过程中持续监测动物体温。
- 完成DCE-MRI后，拔出针头及其他探头，将动物置于铺有纸巾的空笼中。轻柔按摩下腹部区域。将笼子一半置于加热灯下，使动物在恢复过程中可自由进出温度梯度区域。在动物恢复至能够自主维持胸卧位意识状态前，不得无人看护。
3. 图像处理与分析
- 在T2加权（T2W）图像中分割肿瘤区域。在T2W图像中，肿瘤区域的信号强度高于周围组织，因此可手动勾画肿瘤边界。
注意：可采用半自动分割技术，如全局阈值法或主动轮廓法16,17，但当使用表面线圈时，尤其需要校正不均匀的背景强度。 - 生成T1和质子密度图谱。在采用梯度回波序列获取的T1加权（T1W）图像中，假设回波时间（TE）远小于T2*值，则像素值由下式决定：
其中S0 为质子密度，T1为T1弛豫时间常数，TR为重复时间，θ为翻转角。方程（1）可重写为：
当将S(θ)/sinθ 替换为 Y，并将 S(θ)/tanθ 替换为 X时。方程（2）为线性方程，其斜率和截距可分别用于求解T1和S0值。 - 计算DCE-MR图像中的MR对比剂浓度。当注射基于钆的MR对比剂后，T1弛豫时间常数随时间变化。因此，方程（1）可重写为：
T1(t)与MR对比剂浓度C(t)的关系如下：
其中r1为MR对比剂的纵向弛豫率。因此，结合方程（3）和（4），MR对比剂浓度由下式确定：
- 定量分析MR对比剂的药代动力学参数。Cp(t)表示在开始注射对比剂后时间t时血液血浆中的MR对比剂浓度。Cp(t)称为动脉输入函数（AIF）。若AIF已知，则MR对比剂的药代动力学参数可通过下式计算：
其中Ct(t)为目标组织中的MR对比剂浓度，vp为血浆体积分数，ve为细胞外血管外体积分数，Ktrans 为容积转移常数。通量速率常数kep等于Ktrans除以ve。若无法获得AIF，则可采用参考区域模型替代18,19。参考区域模型基于血流限制性Kety模型20，利用参考区域内的对比剂浓度来消除对AIF的需求，如下所示：
其中Ct,ROI(t)、Ktrans,ROI和ve,ROI分别为感兴趣区域（ROI）内的对比剂浓度、容积转移常数和细胞外血管外体积分数，而Ct,RR(t)、Ktrans,RR和ve,RR为参考区域内的对应参数。通常选择椎旁肌作为参考区域，并假设小鼠椎旁肌的ve,RR为恒定值0.0821。本研究采用参考区域模型。
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结果
人胰腺肿瘤细胞可在小鼠胰腺内成功生长，形成实体瘤。图1展示了（A）注射肿瘤细胞悬液的正常胰腺，以及（B）携带原位胰腺肿瘤异种移植瘤（MIA PaCa-2）的代表性小鼠的照片。肿瘤位于腹部左上象限，紧邻脾脏。细胞植入后，肿瘤通常需要2至4周生长至直径5至7 mm。
原位胰腺肿瘤异种移植模型的运动被显著抑制，尽管磁共振图像中仍存在一定程度的运动伪影。在T2加权磁共振图像中，当胰腺肿瘤细胞被原位植入时，肿瘤区域上方空气中的磁共振信号标准差约为使用皮下肿瘤模型时的2.5倍。图2A展示了对原位胰腺肿瘤异种移植模型进行动态对比增强磁共振成像（DCE-MRI）的实验装置示意图。橙色圆圈代表肿瘤，由一块正交弯曲的塑料板上端固定住。图2B展示了该塑料板的结构示意图及其尺寸。板的宽度（30 mm）设计为与小鼠动物床的宽度一致；板的长度设计为足够长，以便牢固地粘贴胶带；板尖端的深度（4 mm）则针对20 g小鼠进行设计。图2C显示了一只携带原位胰腺肿瘤异种移植模型（MI...
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讨论
我们介绍了使用免疫缺陷小鼠建立原位胰腺肿瘤模型、对小鼠腹部肿瘤进行动态对比增强磁共振成像（DCE-MRI）以及其动力学参数定量分析的详细方法。在建立原位胰腺肿瘤模型时，将针头插入胰腺尾部需格外小心。若操作成功，细胞将被输送至胰腺头部并形成一个小泡。应用正交弯曲的塑料板时，必须确认肿瘤位于该板上端下方。由于胰腺肿瘤靠近膈肌，塑料板可能无法牢固固定肿瘤，特别是当肿瘤直径小于5 mm时。成像结束后，应轻柔按摩腹部区域，直至动物恢复意识。为避免腹痛，建议每只动物的总成像及准备时间不超过90分钟。
塑料板的尺寸可能需要根据肿瘤或动物的大小重新调整。如果肿瘤直径小于5 mm，则正交弯曲且深度为4 mm的挡板可能无法牢固固定肿瘤，从而导致磁共振图像中出现运动伪影。此外，如果动物体重超过20 g，4 mm的深度可能不足以固定肿瘤。然而，对腹部施加过大的压力可能会损伤腹腔神经系统，导致动物下半身瘫痪。
使用标准的人源胰腺癌细胞系在小鼠体内建立原位胰腺肿瘤模型，已被用于研究胰腺肿瘤对治疗的反应。然而，肿瘤成瘤率（植入后动物出现可触及肿...
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
作者感谢 Jeffrey Sellers 在构建原位胰腺癌小鼠模型方面提供的帮助。本研究得到了阿拉巴马大学伯明翰分校放射学系研究启动奖以及美国国立卫生研究院基金 2P30CA013148 和 P50CA101955 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| 胎牛血清 | Harlan Laboratories | BT-9501 | |
| 聚维酮碘 | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| 5-0 Prolene 缝线 | Ethicon | 8720H | |
| 9.4T 磁共振成像仪 | Bruker Biospin Corporation | BioSpec 94/20 USR | |
| 钆特醇 | Bracco Diagnostics Inc | NDC 0270-1111-03 | |
| 微型聚乙烯管 | Strategic Applications, Inc | #PE-10-25 | |
| 30 G 钝头针 | Strategic Applications, Inc | 89134-194 | |
| 监测与门控系统 | SA Instruments, Inc | Model 1030 | 该系统可兼容磁共振成像，用于同时测量小动物的呼吸频率和体温。 |
| 注射泵 | New Era Pump Systems, Inc. | NE-1600 |
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