方法调查小RNA和核糖体占用的调控作用恶性疟原虫

疟疾，造成疟原虫属顶复门寄生虫，是人类最常见的寄生虫病，感染全球大约200万人，每年造成周围60万人死亡^1。感染人类的五个疟原虫物种的，最相关的人类疾病是P.疟原虫和P.间日疟原虫 ，由于严重疟疾并发症其广泛分布和潜力。疟原虫的生命周期既需要蚊子和人类的感染。当受感染的蚊子叮咬人类，寄生虫通过血液循环到达肝脏，在首轮的复制发生移动。后从主机肝裂殖子破裂，它们感染附近的红血细胞，发起或者无性或有性复制。复制的无性阶段，持续48小时在体育疟原虫，是本研究的焦点，因为它是最发作的同时在源咏叹调 ​​症状和容易概括体外 。

虽然一些公共卫生措施，包括改善抗疟疾疗法，已经有所减少全球疟疾负担，抗药性疟原虫的持续出现，呈现为疟疾防治工作中的问题。这可能意味着新的治疗方法的一个领域是研究遗传变异如何不同赋予抵抗疟疾。在疟疾流行的地区，各种红细胞多态性的现象相当普遍^2,3。这些突变，镰状细胞是也许是最突出，通常与对有症状疟疾感染⁴发病实质性抗性相关。由它们引起红细胞抵抗疟疾感染的基本机制是不完全的了解。寄生红细胞与血红蛋白突变，受增强吞噬功能，通过增强细胞的刚性和脱水，这与减少入侵体育相关疟原虫 ^5。 HBC的等位基因也影响蛋白质表达在红细胞表面和与细胞骨架的重塑，进一步抑制寄生虫发育^6,7。最后，P.疟原虫生长不佳内纯合镰刀（HBSS）红细胞^8,9 体外 ，提示疟疾电阻的固有红细胞因素。然而，虽然所有这些机制似乎发挥作用，但它们不能完全解释后面疟疾镰状细胞抗性的机制。

一个潜在的一套红细胞因素仍然知之甚少是成熟红细胞中的miRNA存在的大池。微RNA是小的非编码RNA，19-25个核苷酸的大小，其中由3'UTR内的碱基配对介导的翻译和/或靶mRNA的稳定性。他们有牵连的哺乳动物的免疫反应的控制，包括抑制Ò˚F病毒复制^10，并分别显示出赋予对病毒在植物中它们也已显示出调节一些红细胞过程，包括红细胞生成^11,12和铁代谢^13。以前的研究确定了红细胞的miRNA，其表达显着改变的HBSS红细胞^14,15的丰富和多样化的人口。由于成熟的红细胞缺乏积极的转录和翻译，这些红细胞miRNA的功能作用尚不清楚。由于显著物质交换的宿主细胞和P之间发生的红细胞内发育周期^（IDC）16中疟原虫，有人推测的HbS红细胞内改变的miRNA谱可以直接有助于细胞内在疟疾电阻。

这些研究最终导致管道的发展分离，鉴定和功能上的米内研究人类miRNA的作用alaria寄生虫P.疟原虫，这表明这些宿主/人miRNA的最终共价保险丝然后平移地抑制寄生虫mRNA转录物^17。这提供了通过转拼形成的第一跨物种的嵌合转录物的示例，并且暗示，这种miRNA的体mRNA融合物可以在其它物种中，包括其他寄生虫可以发生。所有锥虫的mRNA为反式剪接与拼接领袖（SL）来调节多顺反子转录物¹⁸的分离。由于P.疟原虫缺乏直系同源对的Dicer /阿戈^19,20，它是可能的红细胞的miRNA劫持在巴斯德类似SL机械恶性融入靶基因。最近在体育研究疟原虫有实际上表示的5'剪接前导序列²¹的存在。这项研究详细介绍了导致人类寄生虫的miRNA基因融合基因的发现，这些方法包括转录和translational调节技术。这些方法的总体目标是研究的小RNA在P的基因调控，表型和翻译潜在的影响疟原虫成绩单。

人类寄生虫嵌合成绩单初步查明依赖的RNA分析技术，如实时PCR，转录组测序和EST库的采集，其中包括总额和小RNA，而不是用技术只孤立的小RNA使用。分离所有的RNA一起在一个大的池，而不是分开，允许两个易位人类小RNA在寄生虫的标识以及这些小RNA序列的存在作为较大序列的一部分。然后，这需要这些融合mRNA的翻译状态的分析，以确定这些融合的功能性后果。

而在寄生虫的基因组的表征广泛的努力ð转录纷纷加入到寄生虫的生物学^22-25的了解，远不如所了解的mRNA的转录组跨越P的生命周期中的翻译调控疟原虫 ^26。寄生虫的蛋白质组的这种有限的理解已经阻碍了双方的了解寄生虫的生物学，并确定为下一代抗疟疾治疗的新目标的能力。寄生虫的细胞生物学的理解，这仍存在差距主要是由于缺乏足够的技术来研究翻译调控的P.疟原虫 。最近的一篇论文描述了使用P的核糖体足迹的恶性确定全球翻译状态^21。一个公认的转录的平移电位测定是由多核糖仿形测定相关的核糖体的数目。然而，当这种技术应用到P.疟原虫</ em>的，它是无法收回大部分多核糖体和捕获主要monosomes。近日，几组^27,28优化了P.疟原虫多核糖体的技术，通过同时裂解红细胞和寄生虫保存多核糖体和它们在宿主红细胞²⁸无性发育过程中表征这些疟原虫的核糖体占用和翻译潜能。

总的来说，这些方法证明人类miRNA与寄生虫mRNAs的所观察到的融合调制那些融合的mRNA，其使用先前报道的方法²⁷表明的寄生虫蛋白质翻译，并且是在疟疾的HBA阻力的主要决定因素和HBSS红细胞^17。这些方法将在任何系统，查找以确定和功能上探索RNA剪接事件是有用的，这些融合的RNA是否在第疟原虫或其他真核系统。

1:隔离从P.小型的RNA 疟原虫在IDC

1. 获得疟原虫无性文化^29。
   注:所需要的培养规模将有所不同根据所需的应用;然而，10毫升培养在3-5％寄生虫血症和5％的血细胞比容提供了充足的RNA进行实时PCR（RT-PCR）。该技术最初是为异步培养物进行了优化，但是当感染周期中的特定时间点需要的话，环阶段寄生虫可以通过山梨醇同步不迟超过10-12小时入侵后同步。同步应该一个周期（约48小时^）29后重复。
2. 池感染细胞一起（〜5×10 ⁹的RBCs在3-5％的寄生虫血症）和填充冷PBS到管和离心机的顶部，在800×g离心5分钟，无制动以沉淀红细胞。
3. 离心后，小心地用吸吸管除去上清液，附到真空中，由于红细胞​​粒料很容易去除。用冷的1×PBS洗涤沉淀一次。
4. 在寒冷的0.15％皂苷悬浮细胞沉淀（以1×PBS中），并置于冰上30分钟。
5. 离心机的细胞在1500星光12分钟在4°C，除去冷PBS上清（这将是暗红色），并重新悬浮颗粒。再一次重复此步骤。
   注意:为了确保存在的微RNA是反射寄生虫内微RNA，而不是红细胞污染，一些寄生虫分离条件进行了测试:1）皂苷裂解，2）皂苷裂解结合RNA酶A处理的宿主细胞的miRNA和3 ）甲基-β-环糊精处理，除去从主机红细胞的寄生虫。所有的处理，得到类似的结果。
6. 裂解使用推荐600微升裂解缓冲液分离的寄生虫沉淀。的裂解缓冲液体积这是足够的培养物高达约30 ml的在2％的血细胞比容和5％寄生虫血症。
   注:对于较大的寄生虫培养物，该体积能够增加。以确保寄生虫粒料的完全裂解通过彻底涡旋至少1分钟是重要的。此外，为便于提取，裂解的样品可以被转移到一个1.7 ml离心管。
7. 添加匀浆添加剂（醋酸酯2钠，pH 4）的60微升，或1/10体积在步骤6中使用的裂解缓冲液，。
8. 离开样品在冰上10分钟。
9. 添加600微升，或一个体积等于裂解缓冲液，在步骤6中加入酸苯酚choloroform，向每个样品并涡旋1分钟的量。
10. 通过离心样品以10,000×g离心5分钟分离水相和有机相。此自旋长于由该试剂盒建议，以确保所有的血红蛋白/疟原虫色素是在有机相中。
11. 收集上层（水溶液层），并将其传输至新管。重复步骤9和10，如果水相为白色或（更可能）褐色，这表明亲蛋白质污染。
12. 通过移液管确定得到的上清液的体积，然后添加1.25体积的100％乙醇（〜800微升），并通过反相1.7 ml离心管5次混合。
13. 穿过一个设置RNA结合滤筒各样品（若干不同，其中是市售的）通过离心在14,000rpm xg离心1分钟或通过使用真空歧管中。
14. 洗滤筒700微升所述miRNA的洗涤缓冲液1使用微量，以14000×g离心纺丝1分钟。
15. 通过在14000 XG离心每1分钟两次清洗过滤器滤芯500微升洗涤液的2/3。
16. 洗脱的RNA用100μlDEPC水，这已被预热到95°C下，在50μl的洗涤两次，以14000×g离心离心每1分钟。测量的RNA通过UV吸光度在260nm处的浓度。
    注:一种RNA凝胶（或TBE - 尿素丙烯酰胺或变性甲醛琼脂糖凝胶）可以bë用于评估所述分离的RNA的尺寸分布。
    注:这种RNA是适合于通过微阵列，RNA测序，Northern印迹和核糖核酸酶保护测定分析。

2:定量从P.小型的RNA 疟原虫在IDC

1. 确定分离在步骤1使用紫外分光光度法在260nm处个别样本的浓度。
2. 生成的实时PCR引物为所需的RNA种类。对于单独的miRNA，我们使用了预制miRNA的qPCR实验，而mRNA的或融合的miRNA表达我们设计引物进行SYBR绿色。聚变的RNA，正向引物是miRNA序列本身（的miR-451:AAACCGTTACCATTACTGAGTT），而反向是基因特异性引物〜100bp的所述miRNA的下游中的mRNA序列（PKA-R:ATCGAACATGCTGTGAACAT）。
3. 使cDNA的使用RNA样品或者发夹结构引物的miRNA（使用20-40纳克的RNA）单独或随机六聚体为mRNA和/或miRNA-mRNA融合物种（使用1微克的RNA）。混合RNA和引物5分钟，在65℃，然后冷却至室温。之后，添加逆转录酶混合物（0.5微升反转录酶，0.5μl的RNase抑制剂，1微升的dNTPs（各2.5mM），4μl的5×缓冲液，2微升0.1M DTT，1微升_H 2 O）。
   1. 运行样品上能够检测或者SYBR绿色或TaqMan探针热循环。 SYBR绿定量PCR ^30，用于特定的基因被运行作为3步PCR，95℃15秒，最低引物退火温度零下5℃，30秒，和68℃，30秒，40个循环，使用商业SYBR Green母液。 miRNA的实时PCR被运行作为二步PCR，95℃15秒和60℃1分钟，进行40个循环。
   2. 量化使用ΔΔCT方法分析和规范他们对任何饶GTP酶（PF08_0110）或18S rRNA的^31。

3:前言小RNA进入疟原虫

1. 沉淀300微升每转红血细胞（250微升红细胞，约^1.5×10 9细胞，最终将被使用）在完整的疟疾介质离心，在800×g离心5分钟，制动器1。
2. 用RPMI重悬在完全cytomix（120毫米氯化钾洗两次红细胞; 0.15毫米氯化钙_2; 10mM的_K 2 HPO _{4 /} KH _{2 PO 4，pH}为7.6; 25毫米的HEPES，pH值7.6; 2mM的EGTA，pH值7.6; 5mM的_氯化镁 ; pH值用KOH在800 xg离心在制动器1离心5分钟后调整），在50％的血细胞比容。
3. 转移细胞到0.2厘米电穿孔杯中。
4. 添加的定制合成的寡核苷酸到反应杯10微克，或适量，并悬浮培养物。
5. 调整电穿孔至310 V / 950μF，并提供一个脉冲，每个试管中。
6. 重悬在300微升红细胞的比色皿内预热完成MAL咏叹调 ​​媒体和板块它们在24孔板和在密闭容器与疟疾血液混合气体在_{37℃（3％O 2，5％}的CO 2）。
7. 4小时后，感染转染的红细胞与同步晚期滋养体至1％的近似最终的寄生虫血症。
8. 加入新鲜红细胞转每4-6天，感染的培养，并确定使用的YoYo-1染色％原虫通过流式细胞仪，如第4所示。

4:测定红细胞的microRNA效应在寄生虫感染率

1. 取100微升重悬的文化通过微量移液器和地点在1.7 ml离心管。用1ml 1×PBS中并离心在台式微量离心机离心800×g离心5分钟洗涤两次。
2. 重新悬浮颗粒在1毫升0.025％戊二醛。孵育样品20分钟，在室温。
   注:样品在这里可以贮存数周，在4℃。此后，沉淀感染ř离心在800×g离心5分钟的BC。用1ml的1×PBS洗两次。
3. 重新悬浮颗粒在1毫升0.015％，皂甙。孵育在4℃下15分钟。粒料感染RBC离心800×g离心5分钟。用1ml的1×PBS洗两次。 Repeat.4.3。重悬细胞1ml含1微升（1,000X）的DNA染色的1×PBS。
4. 确定寄生虫血症的程度上的流式细胞仪，在488nm激发和〜530纳米（FL-1）发射。
5. 第一，栅极血细胞计数基于FSC和SSC流集中在红细胞。然后，通过荧光在FL-1通道测量门控RBC度原虫的（感染RBC）。
   注:后期寄生虫是10倍比早期阶段寄生虫多种荧光，和〜100倍以上的未感染RBC。另外，收集在低速趋于降低噪音。最后，该方法相比已经^{3 H-}次黄嘌呤掺入和Giemsa染色，既如先前报道^13，和所有的技术GAVË类似的结果。

5:的miRNA基因融合产品的生物素标记和洗脱

1. 直接订购定制合成的RNA寡核苷酸与脱硫生物素（DB-）共价连接于5'端。
2. 染未感染RBC具有脱硫生物素 - 缀合（DB-）miRNA与未修饰的miRNA（阴性对照），如在步骤3中指示。
3. 感染红细胞转用P.疟原虫寄生虫至0.5％（步骤1.1）的起始寄生虫血症。
4. 提取寄生虫核糖核酸4天（96小时）后，如步骤1所述。
5. 孵育10微克的寄生虫的RNA用50μl链霉填充珠，通过微量添加，并在4℃下旋转，在微量离心管中旋转1小时。
6. 沉淀小珠，在800×g离心30秒，并用20mM的KCl和1 / 1,000 RNA酶抑制剂。
7. 洗脱的RNA从珠通过竞争了2mM生物素和用200μl的RNA捕获洗脱缓冲液（20mM氯化钾，1/1，000酶抑制剂和2mM生物素），在4 ℃过夜轮换。
8. 决定指出P的富集程度使用SYBR绿定量RT-PCR和微RNA富集（阳性对照）通过定量PCR荧光定量如步骤2所示疟原虫成绩单。

6:核糖体分离，以确定P的核糖体占用疟原虫

1. 放置5毫升15％的蔗糖溶液（400毫乙酸钾，25mM的钾的HEPES，pH值7.2，15mM的醋酸镁，200μM的放线菌酮，1mM的DTT，1mM的PMSF，40 U / ml的RNA酶抑制剂，和15％的蔗糖）成SW41超速离心管（14×89毫米）。
2. 使用5毫升注射器，加入5毫升50％的蔗糖溶液（400毫乙酸钾，25mM的钾的HEPES，pH值7.2，15mM的醋酸镁，200μM的放线菌酮，1mM的DTT，1mM的PMSF，40 U / ml的核糖核酸酶抑制剂，和50％蔗糖）使用长钢针15％的蔗糖的下面，然后取出针。
3. 2小时后，缓慢地倾斜管背部直立和管转移到冰，允许它冷却至少15分钟前，样品加载（步骤14）。
4. 收集足够的疟原虫 -感染的血液阶段的文化产生100-500微克的总RNA，或大约100毫升的3-5％原虫异步文化。添加^1/10含有10×（2毫摩尔）环己酰亚胺（CHX）培养基的该卷和在37℃下进行10分钟。
   1. 团培养离心500×g离心7分钟的离心分离机（制动器1），然后用室温1×含200μM的CHX PBS洗涤两次。重悬含200微米CHX寄生虫文化在1X PBS，并储存在冰。
   估计红细胞粒料的体积。添加裂解缓冲液（400毫乙酸钾，25mM的钾的HEPES，pH值7.2，15mM的醋酸镁，200μM的CHX，1mM的DTT，1mM的PMSF，40 U / ml的RNA酶抑制剂，1％（体积/体积）IGEPAL CA -630和0.5％（重量/体积）DOC）的红细胞沉淀到4.25 ml的终体积。孵育裂解液4 °下进行10分钟，同时旋转。
5. 溶胞产物转移到微量离心管，然后在16000×g离心和4离心样品中微量 °下进行10分钟。
6. 吹打1.25的冷的0.5M蔗糖缓冲液（400毫乙酸钾，25mM的钾的HEPES，pH值7.2，15mM的醋酸镁，200μM的放线菌酮，1mM的DTT，1mM的PMSF，40 U / ml的RNA酶毫升制备蔗糖垫抑制剂，和0.5M蔗糖）到SW55超速离心管（13×51毫米）。
7. 小心地用注射器和小（〜27）号针头的蔗糖垫层的顶层3.75 ml的裂解物上清液（来自步骤7）的。 STORE中的剩余裂解液（〜500微升）在-80°C至提取总RNA水平，如第1所示。
8. 加载样本到超速离心机转子，预冷却至4 °C，可容纳13.2毫升管。离心样品在366000×g离心和4℃146分钟。
9. 使用移液管，转移上清液成15mL的锥形管中。存储上清液在-80℃的游离（未结合的核糖体）的RNA的RNA分离。
10. 重悬核糖体沉淀在500μl核糖体再悬浮缓冲液（400毫乙酸钾，25mM的钾的HEPES，pH值7.2，15mM的醋酸镁，200μM的放线菌酮，1mM的DTT，1mM的PMSF，和40 U / ml的RNA酶抑制剂）的吹打5分钟。
11. 离心机在微量样品在16000×g离心和4   °下进行10分钟。
12. 在保持梯度步骤＃4冰上，除去封口膜，然后小心地层渐变USI顶部的核糖体悬浮液NG注射器和小（〜27）号针头。
13. 加载围成一个预冷超速离心机转子和离心加载梯度以200,000×g离心和4℃180分钟。当旋转完成后，储存于4离心梯度 °C，直到准备加载到分馏塔。
14. 加载一个空的超速离心管放入梯度精馏塔（这可以是在一个先前的运行中使用的管），然后用无RNA酶的水洗涤5分钟，在100×10的速度。
15. 期间在步骤6.16洗涤，置紫外吸收检测器的灵敏度。一个很好的出发灵敏度是0.2，但是这可能在稍后奔跑取决于阿₂₅₄信号（其变化的基础上的寄生虫数等）来进行调节。
16. 一旦检测器灵敏度被设置，设置基线信号至零，同时水流过检测器。
17. 洗涤该馏分收集后，反向流体流动，直至线是空的，然后对物奥雅纳空超速离心管。
18. 运行通过精馏塔60％的蔗糖溶液，直到它离开针头装置。
19. 插入包含​​所述第一梯度的管中，在装载室的顶部，并拧紧封，注意不要过度拧紧。然后，刺穿与针管的底部。
20. 重置流体流动速度，以12.5×10（由泵前部的流动速度控制旋钮控制），然后设定自动级分收集器以收集18秒的级分（〜330微升/分）在微量离心管中。
21. 启动向前流的60％的蔗糖溶液中。
22. 当梯度液的首次下降落入离心管中，立即开始双方馏分收集和A ₂₅₄信号的现场录音。
23. 一旦大幅下跌是在A ₂₅₄的信号观察，对应50％和60％的蔗糖溶液之间的介面，停止流体流动和A ₂₅₄两种
24. 存储梯度分数在-80   °下以后使用。
25. 反向液流在100×10的速度，直到60％的蔗糖溶液清空出超速离心管。
26. 如果有附加梯度分馏，从装载室取出空超速离心管，并从步骤6.21重启。如果所有的样品都完成后，清洗设备，在步骤6.16和6.19进行。

人类的microRNA在P的全球分析疟原虫

这里介绍的技术被用来提取寄生虫微小RNA在多种条件。有一点要注意的是，在32，这往往充当了两个本文以及原研29提出的微小RNA数据的参考点指示进行RNA提取的未感染的红细胞。这些以往的研究也表明，HBSS红细胞具有一定的miRNA中，miR-451特别是更大的水平。上面所指出的技术足以证明在哈佛商学院（HBA卡或HBSS）感染寄生虫的变化，miRNA的丰度。 RNA样品提取为上述和归一化表示对18S rRNA基因。从HBSS红细胞寄生虫的样品，例如，不显示在几种微小RNA，包括的miR-451（图1）的水平一显著增加。的miRNA来自主机erythr摄取ocyte也与以往的研究34,35一致。

HBAA红细胞用miR-451的转染增加HBAA的miR-451类似于HBSS红细胞水平 （图1）。流式细胞术，然后用来测量寄生虫感染，以评估miRNA的易位时寄生虫生长的效果。根据是，转染的miR-451中，miR-223和miR-181a的HBAA红细胞，以及一个单链DNA寡，进行了检查的微小RNA在寄生虫生长的影响。的ssDNA或miR-181a的转染过在寄生虫血症没有影响（ 图2A - D）的同时，转染用miR-451明显减少寄生虫血症，这只能由被减轻共转的反义的miR-451寡。

通过2'-O-ME反义​​微RNA转染阻断的microRNA表现出相互影响。 HBSS红细胞，与自然较高的miR-451水平，分别转反义的miR-451或2'-O-甲基寡核苷酸（ 图3）。的miR-451的抑制在这两个HBSS红细胞（ - F 图3C）增加寄生虫生长。寄生虫百分数计算从至少3个独立转染，然后平均，并作为相对于HBSS 生长 （图3F）的倍数变化。

中的miRNA基因融合RNA的生物素捕获法捕获

5'-脱硫生物素 - 的miR-451转染后（5'Db-的miR-451）和5'Db-的miR-181，如在方法部分5所示，已确定，所观察到的miRNA序列源自与人微RNA。定量RT-PCR分析表明，5'Db-的miR-451的转染导致了PKA-R融合转录富集（图4）。

多核糖体分离，以确定P的核糖体占用疟原虫

继monosome峰是对应于多聚核糖体的峰值。每个连续的峰代表代表核糖体的逐渐变大的数字的多核糖体级分（2，3，4，等等）。每个多核糖峰是比以前的峰也较小，减少的高度由2-3倍随着每次连续多核糖体数目。典型的运行将允许多核糖5-7核糖体组成的分辨率，虽然分辨率高达一个九聚体的多核糖已观察在一些运行与大量原料。高阶多核糖构成的微量的剩余部分，​​并且不能这些梯度条件下解决。

图1:MIR-451升高于HBSS红细胞 Intraparasitic的miR-451的水平，由实时PCR和所确定的归一化对18S rRNA基因，来自寄生虫从指定的隔离 。红细胞类型。值是平均值±SE。

图2:的miR-451的过表达在正常的红细胞抑制寄生虫生长（A - C）的指示的感染率， ​​在总红细胞的百分比，由M1表示，为示出红血球类型代表FACS图。 （D）来自FACS和标准化对未转染HBAA红细胞复合感染率。在面板的AC值是代表FACS图，而D是平均值±SE。

图3:的miR-451的镰状细胞红细胞抑制升高寄生虫生长（A - E）的代表性FACS图，指示感染率， ​​在总红细胞的百分比，由M1表示，为示器ythrocyte类型。 （F）来源于FACS并绘制对未转染HBAA红细胞的标准值复合感染率。在面板曝光值是代表FACS图，F是指±SE。

图4:的miR-451的转丰富的PKA-R融合基因，并表明，miRNA的融合红细胞是在原籍已被抓获链霉指示脱硫生物共轭的miRNA基因融合基因的富集。值是使用实时PCR测量并绘制为相对值相对于未转染的寄生虫。值是平均值±SE。

图5:核糖体寄生虫可通过蔗糖梯度隔离（A - B）Examp勒的痕迹，从恶性疟原虫中提取的多聚核糖体轮廓。一个核糖体轮廓恶性疟原虫提取，与40S，60S，80S和核糖体峰（A），跟踪（＃分别与指示相关核糖体的数量）显示。 （B）的18S和28S rRNA的整个核糖体部分RNA印迹。值是平均值±SE。

提交人没有需要声明的竞争性经济利益。