人类微小RNA从宿主红细胞转运至Plasmodium falciparum寄生虫。本文描述了将合成的微小RNA转染到宿主红细胞以及从P. falciparum中分离全部RNA所使用的技术。此外，本文还将详细介绍一种用于分离P. falciparum多聚核糖体的方法，以确定寄生虫转录本的核糖体占据情况及其翻译潜能。
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方法文章
研究小型RNA与Plasmodium falciparum核糖体占据率调控作用的方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
导致镰状细胞等位基因（HbS）的遗传变异使红细胞能够抵抗疟原虫P. falciparum的感染。这种抗性的分子基础已知具有多因素性，但目前尚未完全阐明。最近的研究发现，红细胞微小RNA（miRNA）在被转运至疟原虫后，可影响寄生虫的基因调控和生长。后续研究进一步表明，这些miRNA通过与特定亚群的寄生虫mRNA发生5'端RNA融合，形成嵌合RNA转录本，从而抑制mRNA的翻译。本文将详细介绍用于研究红细胞miRNA在P. falciparum基因调控和翻译潜能中功能作用及其潜在机制的技术，包括将修饰后的合成miRNA转染至宿主红细胞的方法。 最后，采用多聚体梯度离心法评估这些转录本的翻译程度。综合这些技术，我们得以证明红细胞miRNA表达水平的失调有助于镰状红细胞内在的抗疟疾能力。
引言
疟疾，由顶复门疟原虫属寄生虫引起 疟原虫是全球最常见的寄生虫病，每年约感染2亿人，导致约60万例死亡1. 五个中的 疟原虫 感染人类的物种中，与人类疾病关系最密切的是 P. falciparum 和 P. vivax，由于其分布广泛且可能导致严重的疟疾并发症。疟原虫的生活周期需要感染蚊子和人类两种宿主。当受感染的蚊子叮咬人类时，寄生虫通过血液进入肝脏，在肝细胞内进行初次复制。裂殖子从宿主肝细胞破裂释放后，会感染附近的红细胞，进而启动无性或有性复制。无性复制阶段在人体内每48小时完成一个周期 P. falciparum是本研究的重点，因为它是大多数疟疾症状的来源，且易于重现 体外.
尽管包括改进抗疟药物治疗在内的多项公共卫生举措在一定程度上减轻了全球疟疾负担，但耐药寄生虫的持续出现仍给疟疾防控工作带来了挑战。研究不同遗传变异如何赋予疟疾抗性，可能为开发新的治疗策略提供线索。在疟疾流行地区，多种红细胞多态性相当常见2,3。这些突变——其中镰状细胞特征可能最为显著——通常与显著降低症状性疟疾感染风险密切相关4。目前对这些突变导致红细胞抵抗疟原虫感染的具体机制尚不完全清楚。携带血红蛋白突变的寄生虫感染红细胞会因细胞刚性增加和脱水而更易被吞噬细胞吞噬，这一过程与P. falciparum侵入能力下....
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方案
1：红内期发育周期中从P. falciparum分离小分子RNA
- 获取处于无性培养阶段的疟原虫29。
注意：所需培养物的体积取决于具体应用目的；然而，10 ml、寄生率3-5%、红细胞压积5%的培养物足以提供用于实时PCR（RT-PCR）的RNA。该技术最初针对异步培养物进行优化，但若需特定感染周期时间点的样本，可在入侵后10-12小时内通过山梨醇同步化方法对环状体阶段的疟原虫进行同步化处理。同步化操作应在一个周期后（约48小时）重复一次29 。 - 将感染细胞合并（约5 × 109个红细胞，寄生率3-5%），用冷PBS加至管顶，于800 × g离心5分钟（不启用刹车）以沉淀红细胞。
- 离心后，使用连接真空泵的移液器小心去除上清液，因为红细胞沉淀容易松动。再用冷的1×PBS洗涤沉淀一次。
- 将细胞沉淀重悬于冷的0.15%皂苷溶液（溶于1×PBS）中，置于冰上30分钟。
- 在4 °C下以1,500 × g离心12分钟，弃去上清液（呈深红色），将沉淀重悬于冷PBS中。重复此步骤一次。
注意：为确保所检测的microRNA真实反映疟原虫内部的microRNA水平，而非红细胞污染所致，测试了多种疟原虫分离条件：1）皂苷裂解；2）皂苷裂解联合RNaseA处理宿主细胞miRNA；3）甲基-β-环糊精处理以将疟原虫从宿主红细胞中释放。上述处理....
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结果
人类microRNA全局分析 P. falciparum
本文所采用的技术用于在多种条件下从寄生虫中提取microRNA。需要注意的是，未感染红细胞（RBC）的RNA提取按照文献32所述方法进行，该方法常作为本文及原始研究29中microRNA数据的参考基准。先前的研究还表明，HbSS红细胞中含有更高水平的某些miRNA，尤其是miR-451。上述技术足以揭示感染HbS（HbAS或HbSS）红细胞的寄生虫中miRNA丰度的变化。RNA样本按上述方法提取，并以18S rRNA为内参进行标准化。例如，来自HbSS红细胞的寄生虫样本显示出多种microRNA水平的显著升高，包括miR-451（图1）。寄生虫从宿主红细胞摄取miRNA的现象也与先前的研究结果一致34,35。
将miR-451转染至HbAA红细胞中，使其miR-451水平升高至与HbSS红细胞相似的程度（图1）。随后采用.......
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讨论
HbS 是疟疾流行地区最常见的血红蛋白变异体之一，主要是因为它能提供针对恶性疟原虫引起的重症疟疾的保护作用 P. falciparum. 用于表征人类微小RNA在基因调控中作用所需的技术 P. falciparum 在本手稿中详细描述了相关方法。通过提取包含所有小RNA的总RNA，并采用相对简便的寄生虫裂解程序，这些融合RNA得以通过多种独立技术被鉴定出来。
这些步骤相对简单，但如果操作不当，容易出现问题和污染。在寄生虫提取过程中，关键是要进行皂苷裂解以去除污染的宿主红细胞。这一点在RNA分离过程中的皂苷裂解步骤尤为重要。宿主红细胞中的miRNA含量比寄生虫的miRNA高出数个数量级，部分原因是大多数红细胞未被感染，因此尽可能去除红细胞污染至关重要。同时，维持疟原虫培养物处于健康且合适的发展阶段（如果实验需要感染周期中的特定时间点）也非常重要，以获得准确的miRNA谱型。同样，在苯酚-氯仿提取过程中，必须确保水相清晰透明；若水相浑浊，则需重复苯酚-氯仿提取步骤，以避免残留污染。
此外，在脱硫.......
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披露
作者声明无竞争性财务利益。
致谢
本研究由多丽丝·杜克慈善基金会、伯勒斯·威康基金、美国国立卫生研究院（NIH）R21DK080994 项目、杜克大学校长试点项目基金、罗氏贫血研究基金会以及比尔和梅琳达·盖茨基金会资助。G.L. 获杜克大学 UPGG 项目和美国国立卫生研究院（NIH）（资助号 #5R01AI090141-03）支持，K.A.W. 获美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂——所有试剂必须为无RNA酶。 | |||
| 焦碳酸二乙酯 | Sigma | D5758 | DEPC |
| 经DEPC处理的水（见试剂配制） | |||
| Yoyo-1 DNA荧光染料 | Thermo Fisher | ||
| Gene Pulser II电穿孔仪 | Bio-Rad | ||
| 0.2 cm电穿孔比色皿 | |||
| 4 M乙酸钾 | Mallinckrodt | 6700 | |
| 2 M HEPES钾盐 | Sigma | H0527 | pH 7.2 |
| 1 M乙酸镁 | Sigma | M-2545 | |
| 1 M二硫苏糖醇 | Research Products International | D11000 | DTT |
| 100 mM苯甲基磺酰氟 | Sigma | P7626 | PMSF，溶于异丙醇 |
| 10% (v/v) Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| 10% (w/v) 脱氧胆酸钠 | Sigma | D-6750 | DOC |
| 环己酰亚胺 | Sigma | C-7698 | CHX |
| 蔗糖 | Mallinckrodt | 8360-04 | |
| RNAseOUT（Invitrogen，货号 100000840） | Invitrogen | 100000840 | |
| RPMI-1640 培养基（含 L-谷氨酰胺） | Cellgro | 10-040-CV | |
| 10% AlbuMAX I | Invitrogen | 11020-039 | 溶于无菌水，w/v |
| 庆大霉素 | Gibco | 15750-060 | |
| HT补充剂（100倍）（Invitrogen，货号 11067030） | |||
| 45% (w/v) 蔗糖（Sigma，货号 G8769） | |||
| 1 M HEPES缓冲液（Gibco，货号 15630-080） | |||
| 1×磷酸盐缓冲液（PBS；Cellgro，货号 2109310CV） | |||
| Corning 500 ml真空滤瓶（VWR，货号 430769） | |||
| 载玻片（VWR，货号 48311-702） | |||
| 吉姆萨染液（50倍）（VWR，货号 m708-01） | |||
| mirVana miRNA提取试剂盒（Ambion，ThermoFisher Scientific） | |||
| 5' 生物素标记的成熟miRNA（序列根据目标miRNA而定）（Dharmacon） | |||
| 生物素粉末（Sigma-Aldrich） | |||
| 1 M氯化钾 | |||
| 链霉亲和素Sepharose高容量磁珠（GE Healthcare） | |||
| 核糖体重悬缓冲液（见试剂配制） | |||
| 裂解缓冲液（见试剂配制） | |||
| 15% (w/v) 蔗糖梯度溶液（见试剂配制） | |||
| 50% (w/v) 蔗糖梯度溶液（见试剂配制） | |||
| 0.5 M蔗糖垫层（见试剂配制） | |||
| 60% (w/v) 蔗糖洗脱液（见试剂配制） | |||
| 疟原虫细胞培养基（见试剂配制） | |||
| RNA捕获洗涤缓冲液（见试剂配制） | |||
| RNA洗脱缓冲液（见试剂配制） | |||
| 试剂配制 | |||
| 溶液 | |||
| 疟原虫细胞培养基 | |||
| 500 ml RPMI-1640 培养基（含 L-谷氨酰胺） | |||
| 0.5 ml庆大霉素 | |||
| 5 ml HT补充剂 | |||
| 2.5 ml 45%葡萄糖 | |||
| 25 ml 10% AlbuMAX I | |||
| 12.5 ml 1 M HEPES | |||
| 使用0.2 mm真空滤瓶进行无菌过滤。 | |||
| 含10倍CHX的疟原虫细胞培养基 | |||
| 配方同上，额外添加： | |||
| 2 mM环己酰亚胺 | |||
| 按常规方法配制培养基，然后加入CHX至终浓度为2 mM，并进行过滤。 | |||
| 含环己酰亚胺的1× PBS | |||
| 将环己酰亚胺新鲜加入1× PBS中，终浓度为200 mM，并于4 °C保存至使用。 | |||
| 核糖体重悬缓冲液 | |||
| 400 mM乙酸钾 | |||
| 25 mM HEPES钾盐，pH 7.2 | |||
| 15 mM乙酸镁 | |||
| 200 mM环己酰亚胺（现配现加） | |||
| 1 mM DTT（现配现加） | |||
| 1 mM PMSF（现配现加） | |||
| 40 U/ml RNaseOUT（现配现加） | |||
| 裂解缓冲液 | |||
| 配方同上核糖体重悬缓冲液，额外添加： | |||
| 1% (v/v) Igepal CA-630 | |||
| 0.5% (w/v) DOC | |||
| 蔗糖溶液 | |||
| 配方同上核糖体重悬缓冲液，额外添加不同量的蔗糖： | |||
| 15% (w/v) 蔗糖配制15%蔗糖梯度溶液 | |||
| 50% (w/v) 蔗糖配制50%蔗糖梯度溶液 | |||
| 0.5 M蔗糖配制0.5 M蔗糖垫层 | |||
| 同上，环己酰亚胺、DTT、PMSF和RNaseOUT必须现配现加。 | |||
| 60%蔗糖洗脱液仅需蔗糖和水，无需其他组分 | |||
| 在DEPC处理的水中配制60% (w/v) 蔗糖，以制备60%蔗糖洗脱液 | |||
| RNA捕获洗涤缓冲液 | |||
| 20 mM KCl | |||
| 5 单位/ml Rnase Out（Invitrogen） | |||
| RNA捕获洗脱缓冲液 | |||
| 配方同RNA捕获洗涤缓冲液，额外添加： | |||
| 2 mM 生物素 | |||
| 设备 | |||
| SW55 Ti超速离心转子（Beckman，货号 342194） | |||
| SW41 Ti超速离心转子（Beckman，货号 331362） | |||
| Ultra-ClearTM ½ × 2 英寸（13 × 51 mm）超速离心管（用于SW55，Beckman，货号 344057） | |||
| Polyallomer 9/16 × 3 ½ 英寸（14 × 89 mm）超速离心管（用于SW41，Beckman，货号 331372） | |||
| L8-80M超速离心机（Beckman） | |||
| 钢制钝头注射针，4英寸，16 G（Aldrich，货号 Z261378） | |||
| 1 ml注射器配27 G½针头（Becton Dickinson，货号 309623） | |||
| 5 ml注射器（Becton Dickinson，货号 309646） | |||
| Parafilm封口膜 | |||
| 旋转混合仪（翻转式） | |||
| 带制冷功能的微量离心机 | |||
| 密度梯度分馏系统（Teledyne Isco，货号 69-3873-179） | |||
| TracerDAQ（Measurement Computing） | |||
| Eppendorf 5810R离心机 | |||
| Eppendorf A-4-81转子（Eppendorf，货号 022638807） |
参考文献
- World Health Organization. World Malaria Report. , (2014).
- Livincstone, F. B. Malaria and human polymorphisms. Annu Rev Genet. 5, 33-64 (1971).
- Nagel, R. L., Roth, E. F. Malaria and red cell genetic defects. Blood. <....
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