人类微小RNA从宿主红细胞转运至Plasmodium falciparum寄生虫。本文描述了将合成的微小RNA转染到宿主红细胞以及从P. falciparum中分离全部RNA所使用的技术。此外，本文还将详细介绍一种用于分离P. falciparum多聚核糖体的方法，以确定寄生虫转录本的核糖体占据情况及其翻译潜能。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
研究小型RNA与Plasmodium falciparum核糖体占据率调控作用的方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
导致镰状细胞等位基因（HbS）的遗传变异使红细胞能够抵抗疟原虫P. falciparum的感染。这种抗性的分子基础已知具有多因素性，但目前尚未完全阐明。最近的研究发现，红细胞微小RNA（miRNA）在被转运至疟原虫后，可影响寄生虫的基因调控和生长。后续研究进一步表明，这些miRNA通过与特定亚群的寄生虫mRNA发生5'端RNA融合，形成嵌合RNA转录本，从而抑制mRNA的翻译。本文将详细介绍用于研究红细胞miRNA在P. falciparum基因调控和翻译潜能中功能作用及其潜在机制的技术，包括将修饰后的合成miRNA转染至宿主红细胞的方法。 最后，采用多聚体梯度离心法评估这些转录本的翻译程度。综合这些技术，我们得以证明红细胞miRNA表达水平的失调有助于镰状红细胞内在的抗疟疾能力。
引言
疟疾，由顶复门疟原虫属寄生虫引起 疟原虫是全球最常见的寄生虫病，每年约感染2亿人，导致约60万例死亡1. 五个中的 疟原虫 感染人类的物种中，与人类疾病关系最密切的是 P. falciparum 和 P. vivax，由于其分布广泛且可能导致严重的疟疾并发症。疟原虫的生活周期需要感染蚊子和人类两种宿主。当受感染的蚊子叮咬人类时，寄生虫通过血液进入肝脏，在肝细胞内进行初次复制。裂殖子从宿主肝细胞破裂释放后，会感染附近的红细胞，进而启动无性或有性复制。无性复制阶段在人体内每48小时完成一个周期 P. falciparum是本研究的重点，因为它是大多数疟疾症状的来源，且易于重现 体外.
尽管包括改进抗疟药物治疗在内的多项公共卫生举措在一定程度上减轻了全球疟疾负担，但耐药寄生虫的持续出现仍给疟疾防控工作带来了挑战。研究不同遗传变异如何赋予疟疾抗性，可能为开发新的治疗策略提供线索。在疟疾流行地区，多种红细胞多态性相当常见2,3。这些突变——其中镰状细胞特征可能最为显著——通常与显著降低症状性疟疾感染风险密切相关4。目前对这些突变导致红细胞抵抗疟原虫感染的具体机制尚不完全清楚。携带血红蛋白突变的寄生虫感染红细胞会因细胞刚性增加和脱水而更易被吞噬细胞吞噬，这一过程与P. falciparum侵入能力下降相关5。HbC等位基因还会影响红细胞表面蛋白的表达以及细胞骨架的重构，从而进一步抑制疟原虫的发育6,7。最后，P. falciparum在纯合型镰状细胞（HbSS）红细胞内的体外生长能力较差8,9 in vitro，提示红细胞内在因素在疟疾抗性中起重要作用。然而，尽管上述机制似乎均参与其中，但仍不足以完全解释镰状细胞对疟疾产生抗性的全部机制。
一组尚未被充分理解的红细胞内在因素是成熟红细胞中存在的大量miRNA。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度为19–25个核苷酸的小分子非编码RNA，可通过与靶mRNA的3'非翻译区（UTR）进行碱基配对，介导靶mRNA的翻译调控和/或稳定性调节。miRNA已被证实参与调控哺乳动物的免疫应答过程，包括抑制病毒复制10，并在植物中被证明可赋予抗病毒能力。此外，miRNA还被发现可调控多种红细胞相关过程，包括红细胞生成11,12和铁代谢13。既往研究已鉴定出红细胞中存在丰富且多样化的miRNA群体，其在HbSS型红细胞中的表达水平发生显著改变14,15。由于成熟红细胞缺乏活跃的转录和翻译活动，这些红细胞miRNA的功能作用仍不明确。在疟原虫红内期发育周期（IDC）中，宿主红细胞与P. falciparum之间存在显著的物质交换16，因此有研究推测，HbS红细胞中miRNA表达谱的改变可能直接参与介导红细胞内在的抗疟疾能力。
这些研究最终建立了一条用于分离、鉴定并功能研究人类miRNA在疟原虫P. falciparum中作用的流程，结果表明，宿主/人类miRNA最终会共价融合，并在翻译水平上抑制疟原虫的mRNA转录本17。这为首个通过反式剪接形成的跨物种嵌合转录本提供了例证，并提示此类miRNA-mRNA融合可能也存在于其他物种中，包括其他寄生虫。所有锥虫的mRNA均通过剪接前导序列（splice-leader, SL）进行反式剪接，以调控多顺反子转录本的分离18。由于P. falciparum缺乏Dicer/Ago的同源物19,20，红细胞中的miRNA可能劫持了P. falciparum中类似的SL机制，从而整合到靶基因中。事实上，近期在P. falciparum中的研究已提示存在5'剪接前导序列21。本研究详细描述了发现人-寄生虫miRNA-mRNA融合转录本的方法，包括转录组学和翻译调控技术。这些方法的总体目标是探究小RNA对P. falciparum转录本基因调控、表型及翻译潜能的影响。
最初对人-寄生虫嵌合转录本的鉴定依赖于RNA分析技术，例如实时PCR、转录组测序和EST文库捕获技术，这些技术涵盖总RNA和小RNA，而不仅限于仅分离小RNA的技术。将所有RNA合并为一个大样本进行提取，而非分别分离，使得研究人员能够鉴定出寄生虫中转移的人源小RNA，以及这些小RNA序列作为更大序列组成部分的存在情况。随后需要对这些融合mRNA的翻译状态进行分析，以确定这些融合事件的功能性后果。
尽管对疟原虫基因组和转录组的广泛研究已加深了对其生物学特性的理解22-25，但关于P. falciparum生命周期中mRNA转录组的翻译调控机制，目前所知仍十分有限26。对疟原虫蛋白质组的了解不足，严重阻碍了对其生物学特性的深入认识，也限制了下一代抗疟药物靶点的发现。这一细胞生物学认知上的空白长期存在，主要原因是缺乏适用于研究P. falciparum翻译调控的充分技术手段。最近一项研究报道了利用核糖体足迹图谱（ribosomal footprinting）技术测定P. falciparum全基因组翻译状态的方法21。评估转录本翻译潜能的一个成熟指标是通过多聚核糖体分析（polysome profiling）测定其结合的核糖体数量。然而，当该技术应用于P. falciparum时，往往难以回收大多数多聚核糖体，而主要捕获到单核糖体（monosomes）。近期，多个研究团队27,28通过同时裂解红细胞和疟原虫以保持多聚核糖体的完整性，优化了P. falciparum的多聚核糖体分析技术，从而实现了对这些疟原虫在宿主红细胞内无性发育阶段的核糖体占据情况及翻译潜能的系统表征28。
总体而言，这些方法表明，人源miRNA与寄生虫mRNA的融合可调控这些融合mRNA的寄生虫蛋白翻译，该结论通过先前报道的方法27得以证实，并且是HbAS和HbSS红细胞中疟疾抗性的重要决定因素17。这些方法适用于任何旨在识别并功能探索RNA剪接事件的研究体系，无论这些融合RNA存在于P. falciparum还是其他真核生物系统中。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1：红内期发育周期中从P. falciparum分离小分子RNA
- 获取处于无性培养阶段的疟原虫29。
注意：所需培养物的体积取决于具体应用目的；然而，10 ml、寄生率3-5%、红细胞压积5%的培养物足以提供用于实时PCR（RT-PCR）的RNA。该技术最初针对异步培养物进行优化，但若需特定感染周期时间点的样本，可在入侵后10-12小时内通过山梨醇同步化方法对环状体阶段的疟原虫进行同步化处理。同步化操作应在一个周期后（约48小时）重复一次29 。 - 将感染细胞合并（约5 × 109个红细胞，寄生率3-5%），用冷PBS加至管顶，于800 × g离心5分钟（不启用刹车）以沉淀红细胞。
- 离心后，使用连接真空泵的移液器小心去除上清液，因为红细胞沉淀容易松动。再用冷的1×PBS洗涤沉淀一次。
- 将细胞沉淀重悬于冷的0.15%皂苷溶液（溶于1×PBS）中，置于冰上30分钟。
- 在4 °C下以1,500 × g离心12分钟，弃去上清液（呈深红色），将沉淀重悬于冷PBS中。重复此步骤一次。
注意：为确保所检测的microRNA真实反映疟原虫内部的microRNA水平，而非红细胞污染所致，测试了多种疟原虫分离条件：1）皂苷裂解；2）皂苷裂解联合RNaseA处理宿主细胞miRNA；3）甲基-β-环糊精处理以将疟原虫从宿主红细胞中释放。上述处理均获得相似结果。 - 使用推荐的600 µl裂解缓冲液裂解分离得到的疟原虫沉淀。该体积的裂解缓冲液适用于血细胞压积2%、寄生率5%、体积约30 ml以内的培养物。
注意：对于更大的疟原虫培养物，可适当增加裂解缓冲液体积。务必通过充分涡旋振荡至少1分钟，确保疟原虫沉淀完全裂解。此外，为便于提取，可将裂解后的样品转移至1.7 ml微量离心管中。 - 加入60 µl（即步骤6所用裂解缓冲液体积的1/10）均质化添加剂（2 M醋酸钠，pH 4）。
- 将样品置于冰上静置10分钟。
- 向每个样品中加入600 µl（或与步骤6中加入的裂解缓冲液体积相等）酸性酚-氯仿试剂，并涡旋振荡1分钟。
- 以10,000 × g离心5分钟，分离水相与有机相。此离心时间比试剂盒建议更长，以确保所有血红蛋白/疟色素均进入有机相。
- 收集上层（水相）并转移至新管中。若水相呈白色或（更常见）棕色，提示存在蛋白质污染，应重复步骤9和10。
- 用移液器测定所得上清液体积，然后加入1.25倍体积的100%乙醇（约800 µl），通过倒置1.7 ml微量离心管5次混匀。
- 通过离心（14,000 × g，1分钟）或使用真空抽滤装置，将每个样品通过所提供的RNA结合滤柱（市面上有多种可选）。
- 使用微量离心机，以14,000 × g离心1分钟，用700 µl microRNA洗涤缓冲液1洗涤滤柱。
- 用500 µl洗涤缓冲液2/3洗涤滤柱两次，每次均以14,000 × g离心1分钟。
- 用预热至95 ºC的100 µl DEPC水进行洗脱，分两次每次50 µl，每次以14,000 × g离心1分钟。通过260 nm处的紫外吸光度测定RNA浓度。
注意：可使用RNA凝胶电泳（如TBE-尿素丙烯酰胺凝胶或变性甲醛琼脂糖凝胶）评估所分离RNA的片段大小分布。
注意：所提取RNA适用于微阵列分析、RNA测序、Northern印迹及核糖核酸酶保护实验。
2：在P. falciparum红内期发育周期（IDC）期间对小分子RNA进行定量
- 使用260 nm紫外分光光度法测定第1步中分离得到的各样品的浓度。
- 为所需RNA种类设计实时PCR引物。对于miRNA单独检测，我们使用预制成的miRNA qPCR检测试剂；而对于mRNA或融合型miRNA-mRNA，则设计适用于SYBR Green的引物。对于融合RNA，上游引物采用miRNA本身的序列（miR-451：AAACCGTTACCATTACTGAGTT），下游引物则为位于mRNA序列中miRNA下游约100 bp处的基因特异性引物（PKA-R：ATCGAACATGCTGTGAACAT）。
- 使用发夹引物对miRNA（仅使用20–40 ng RNA）或使用随机六聚体引物对mRNA和/或miRNA-mRNA融合体（使用1 µg RNA）进行cDNA合成。将RNA与引物在65 °C下混合孵育5分钟，然后冷却至室温。随后加入逆转录酶混合液（0.5 µl 逆转录酶，0.5 µl RNase抑制剂，1 µl dNTPs（各2.5 mM），4 µl 5×缓冲液，2 µl 0.1 M DTT，1 µl H2O）。
- 在能够检测SYBR Green或TaqMan探针的实时荧光定量PCR仪上运行样品。针对特定基因的SYBR Green定量PCR30采用三步法PCR程序：95 °C变性15秒，引物最低退火温度减5 °C退火30秒，68 °C延伸30秒，共40个循环，使用商业化的SYBR Green预混液。miRNA的实时PCR采用两步法程序：95 °C变性15秒，60 °C退火/延伸1分钟，共40个循环。
- 采用ΔΔCt法对检测结果进行定量，并以Rab GTPase（PF08_0110）或18S rRNA31作为内参进行归一化处理。
3：将小RNA导入疟原虫
- 在800 × g、刹车档1的条件下离心5分钟，用完全疟疾培养基沉淀每次转染所需的300 µl红细胞（最终使用约250 µl红细胞，约1.5 × 109个细胞）。
- 用RPMI洗涤红细胞两次，然后在800 × g、刹车档1的条件下离心5分钟，以完全细胞混合液（120 mM KCl；0.15 mM CaCl2；10 mM K2HPO4/KH2PO4，pH 7.6；25 mM HEPES，pH 7.6；2 mM EGTA，pH 7.6；5 mM MgCl2；用KOH调节pH）重悬至50%血细胞比容。
- 将细胞转移至0.2 cm电穿孔比色皿中。
- 向比色皿中加入10 µg或适当量的定制合成寡核苷酸，并重悬细胞。
- 将电穿孔仪设置为310 V/950 µF，对每个比色皿施加一次电脉冲。
- 将比色皿中的300 µl红细胞重悬于预热的完全疟疾培养基中，接种至24孔板，在密闭容器中于37 °C、疟疾血液气体混合气（3% O2，5% CO2）条件下培养。
- 4小时后，用同步化的晚期滋养体感染已转染的红细胞，使最终寄生虫血症约为1%。
- 每4–6天向感染培养物中添加新转染的红细胞，并通过YoYo-1染色结合流式细胞术（FACS）测定寄生虫血症百分比，具体方法见第4节。
4：红细胞microRNA对寄生虫感染率影响的测定
- 用微量移液器取100 µl重悬的培养物，放入1.7 ml微量离心管中。用1 ml 1× PBS洗涤两次，然后在台式微量离心机中以800 × g离心5分钟。
- 将沉淀重悬于1 ml 0.025%戊二醛中。室温孵育20分钟。
注意：样品可在4 °C保存数周。之后，在800 × g下离心5分钟，沉淀感染的红细胞，并用1 ml 1× PBS洗涤两次。 - 将沉淀重悬于1 ml 0.015%皂苷中，在4 °C孵育15分钟。在800 × g下离心5分钟，沉淀感染的红细胞，并用1 ml 1× PBS洗涤两次。重复一次。将细胞重悬于含1 µl（1,000倍稀释）DNA染料的1 ml 1× PBS中。
- 在流式细胞仪上检测寄生虫血症程度，激发波长为488 nM，发射波长约530 nM（FL-1通道）。
- 首先根据前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）设门，聚焦于红细胞群。然后通过FL-1通道的荧光信号测定门内红细胞中感染红细胞的比例（即寄生虫血症程度）。
注意：晚期阶段的寄生虫荧光强度比早期阶段高约10倍，比未感染红细胞高约100倍。此外，低速采集可减少背景噪声。最后，该方法已与3H-次黄嘌呤掺入法和吉姆萨染色法进行比较（如先前文献13所述），三种技术结果相似。
5：miRNA-mRNA 融合产物的生物素标记与洗脱
- 直接订购5'端共价连接脱硫生物素（Db-）的定制合成RNA寡核苷酸。
- 按照步骤3所示，将脱硫生物素偶联（Db-）的miRNA和未修饰的miRNA（阴性对照）转染至未感染的红细胞中。
- 用P. falciparum寄生虫感染已转染的红细胞，起始寄生率设为0.5%（步骤1.1）。
- 转染4天（96小时）后，按照上述步骤1所述方法提取寄生虫RNA。
- 将10 µg寄生虫RNA与50 µl压紧的链霉亲和素磁珠混合，使用微量移液器加入，并在4 °C下于微型离心管旋转仪上旋转孵育1小时。
- 在800 × g离心30秒使磁珠沉淀，随后用20 mM KCl溶液和1/1,000 RNase抑制剂洗涤。
- 通过2 mM生物素竞争洗脱磁珠上的RNA，在4 °C下加入200 µl RNA捕获洗脱缓冲液（20 mM KCl、1/1,000 RNase抑制剂和2 mM生物素），并持续旋转过夜。
- 使用SYBR Green qRT-PCR检测目标P. falciparum转录本的富集程度，并按照步骤2所述采用TaqMan qPCR检测miRNA的富集情况（作为阳性对照）。
6：多聚核糖体分离以确定核糖体占据情况 P. falciparum
- 将5 ml 15%蔗糖溶液（含400 mM醋酸钾、25 mM HEPES钾盐，pH 7.2、15 mM醋酸镁、200 µM环己酰亚胺、1 mM DTT、1 mM PMSF、40 U/ml RNase抑制剂和15%蔗糖）加入一支SW41超速离心管（14 x 89 mm）中。
- 使用5 ml注射器和长钢针，在15%蔗糖溶液下方加入5 ml 50%蔗糖溶液（含400 mM醋酸钾、25 mM HEPES钾盐，pH 7.2、15 mM醋酸镁、200 µM环己酰亚胺、1 mM DTT、1 mM PMSF、40 U/ml RNase抑制剂和50%蔗糖），然后取出钢针。
- 用封口膜密封梯度管顶部，将管子缓慢倾斜并侧放于稳定位置，防止滚动，使其水平放置在台面上。保持管子侧放至少2小时。等待期间，开始进行步骤6.5。
- 孵育2小时后，缓慢将离心管恢复至直立位置，转移至冰上，冷却至少15分钟后再进行样品上样（步骤14）。
- 收集足够的 疟原虫-感染的红内期培养物以获得100–500 µg总RNA，或大约100 ml、寄生率3–5%的非同步培养物。加入1/10th 含有10倍体积（2 mM）放线菌酮（CHX）的培养基，37 °C孵育10分钟。
- 500 × g 离心 7 分钟（离心机刹车设为 1）形成菌体沉淀，随后用室温含 200 µM CHX 的 1× PBS 洗涤两次。将寄生虫培养物重悬于含 200 µM CHX 的 1× PBS 中，置于冰上保存。
- 估算红细胞沉淀的体积。向红细胞沉淀中加入裂解缓冲液（400 mM 醋酸钾、25 mM HEPES 钾盐，pH 7.2、15 mM 醋酸镁、200 µM CHX、1 mM DTT、1 mM PMSF、40 U/ml RNase抑制剂、1% (v/v) IGEPAL CA-630 和 0.5% (w/v) DOC），使最终体积达到4.25 ml。将裂解液在4 °C下孵育 4°C下旋转孵育10分钟。
- 将裂解液转移至微量离心管中，然后在微量离心机中于 16,000 x g 和 4 ℃ 条件下离心样品 °C 下 10 分钟
- 使用移液器将1.25 ml冷的0.5 M蔗糖缓冲液（400 mM醋酸钾、25 mM HEPES钾盐，pH 7.2、15 mM醋酸镁、200 µM环己酰亚胺、1 mM DTT、1 mM PMSF、40 U/ml RNase抑制剂和0.5 M蔗糖）加入SW55超速离心管（13 x 51 mm）中，制备蔗糖垫。
- 使用注射器和细针头（约27号），将3.75 ml裂解液上清（来自步骤7）小心地铺加在蔗糖垫上方。剩余裂解液（约500 µl）于-80 °C保存，用于后续提取总RNA水平，具体操作见第1部分。
- 将样品加入已预冷至4℃的超速离心机转子中 °C，可容纳13.2 ml离心管。在4 °C、366,000 x g条件下离心样品146分钟。
- 使用移液器将上清液转移至15 mL锥形管中。将上清液于-80 °C保存，用于游离RNA（未与核糖体结合的RNA）的提取。
- 用移液器吹打5分钟，将核糖体沉淀重悬于500 µl核糖体重悬缓冲液（400 mM醋酸钾，25 mM HEPES钾盐，pH 7.2，15 mM醋酸镁，200 µM环己酰亚胺，1 mM DTT，1 mM PMSF和40 U/ml RNase抑制剂）中。
- 在微量离心机中以16,000 x g离心，4℃条件下离心样品 °C 下 10 分钟
- 在将第4步中的梯度管保持在冰上的同时，移除封口的Parafilm，然后使用注射器和细针头（约27号）小心地将核糖体悬液铺加到梯度上方。
- 将离心管放入预冷的超速离心机转子中，在 200,000 × g 和 4 °C 条件下离心 180 分钟。离心结束后，将离心后的梯度液置于 4 °C 保存 °C，直至准备上样至分选仪。
- 将一支空的超速离心管装入梯度分馏器中（可使用先前运行中用过的管子），然后以100 × 10速度用无RNA酶的水清洗5分钟。
- 在步骤6.16的洗涤过程中，设置紫外吸收检测器的灵敏度。一个合适的起始灵敏度为0.2，但后续运行中可能需要根据A值进行调整254 信号（根据寄生虫数量的不同而变化， 等等。).
- 检测器灵敏度设定后，在水流通过检测器时将基线信号调至零。
- 清洗馏分收集器后，反转液体流向，直至管路排空，然后移除空的超速离心管。
- 将60%蔗糖溶液通过分级分离装置，直至其从针头装置流出。
- 将装有第一层梯度液的离心管插入加样室顶部，拧紧密封圈，注意不要过度拧紧。随后用针头刺穿离心管底部。
- 将流速重置为 12.5 × 10（通过泵前面板上的流速控制旋钮调节），然后设置自动组分收集器，以在微量离心管中每 18 秒收集一次组分（约 330 µl/组分）。
- 启动60%蔗糖溶液的正向流动。
- 当梯度溶液的第一滴落入微量离心管时，立即开始组分收集和A的实时记录254 信号
- 一旦观察到 A 出现急剧下降254 信号，对应于50%和60%蔗糖溶液界面处，停止流体流动和A254 记录
- 将梯度组分于 -80 ℃ 保存 °C 以备后用。
- 以100 × 10的速度反向流体流动，直至60%蔗糖溶液完全从超速离心管中排出。
- 如果有额外的梯度需要进行分级分离，从上样室中取出空的超速离心管，并从步骤6.21重新开始。如果所有样品均已处理完毕，按照步骤6.16和6.19中的方法清洗装置。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
人类microRNA全局分析 P. falciparum
本文所采用的技术用于在多种条件下从寄生虫中提取microRNA。需要注意的是，未感染红细胞（RBC）的RNA提取按照文献32所述方法进行，该方法常作为本文及原始研究29中microRNA数据的参考基准。先前的研究还表明，HbSS红细胞中含有更高水平的某些miRNA，尤其是miR-451。上述技术足以揭示感染HbS（HbAS或HbSS）红细胞的寄生虫中miRNA丰度的变化。RNA样本按上述方法提取，并以18S rRNA为内参进行标准化。例如，来自HbSS红细胞的寄生虫样本显示出多种microRNA水平的显著升高，包括miR-451（图1）。寄生虫从宿主红细胞摄取miRNA的现象也与先前的研究结果一致34,35。
将miR-451转染至HbAA红细胞中，使其miR-451水平升高至与HbSS红细胞相似的程度（图1）。随后采用...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
HbS 是疟疾流行地区最常见的血红蛋白变异体之一，主要是因为它能提供针对恶性疟原虫引起的重症疟疾的保护作用 P. falciparum. 用于表征人类微小RNA在基因调控中作用所需的技术 P. falciparum 在本手稿中详细描述了相关方法。通过提取包含所有小RNA的总RNA，并采用相对简便的寄生虫裂解程序，这些融合RNA得以通过多种独立技术被鉴定出来。
这些步骤相对简单，但如果操作不当，容易出现问题和污染。在寄生虫提取过程中，关键是要进行皂苷裂解以去除污染的宿主红细胞。这一点在RNA分离过程中的皂苷裂解步骤尤为重要。宿主红细胞中的miRNA含量比寄生虫的miRNA高出数个数量级，部分原因是大多数红细胞未被感染，因此尽可能去除红细胞污染至关重要。同时，维持疟原虫培养物处于健康且合适的发展阶段（如果实验需要感染周期中的特定时间点）也非常重要，以获得准确的miRNA谱型。同样，在苯酚-氯仿提取过程中，必须确保水相清晰透明；若水相浑浊，则需重复苯酚-氯仿提取步骤，以避免残留污染。
此外，在脱硫...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无竞争性财务利益。
致谢
本研究由多丽丝·杜克慈善基金会、伯勒斯·威康基金、美国国立卫生研究院（NIH）R21DK080994 项目、杜克大学校长试点项目基金、罗氏贫血研究基金会以及比尔和梅琳达·盖茨基金会资助。G.L. 获杜克大学 UPGG 项目和美国国立卫生研究院（NIH）（资助号 #5R01AI090141-03）支持，K.A.W. 获美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂——所有试剂必须为无RNA酶。 | |||
| 焦碳酸二乙酯 | Sigma | D5758 | DEPC |
| 经DEPC处理的水（见试剂配制） | |||
| Yoyo-1 DNA荧光染料 | Thermo Fisher | ||
| Gene Pulser II电穿孔仪 | Bio-Rad | ||
| 0.2 cm电穿孔比色皿 | |||
| 4 M乙酸钾 | Mallinckrodt | 6700 | |
| 2 M HEPES钾盐 | Sigma | H0527 | pH 7.2 |
| 1 M乙酸镁 | Sigma | M-2545 | |
| 1 M二硫苏糖醇 | Research Products International | D11000 | DTT |
| 100 mM苯甲基磺酰氟 | Sigma | P7626 | PMSF，溶于异丙醇 |
| 10% (v/v) Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| 10% (w/v) 脱氧胆酸钠 | Sigma | D-6750 | DOC |
| 环己酰亚胺 | Sigma | C-7698 | CHX |
| 蔗糖 | Mallinckrodt | 8360-04 | |
| RNAseOUT（Invitrogen，货号 100000840） | Invitrogen | 100000840 | |
| RPMI-1640 培养基（含 L-谷氨酰胺） | Cellgro | 10-040-CV | |
| 10% AlbuMAX I | Invitrogen | 11020-039 | 溶于无菌水，w/v |
| 庆大霉素 | Gibco | 15750-060 | |
| HT补充剂（100倍）（Invitrogen，货号 11067030） | |||
| 45% (w/v) 蔗糖（Sigma，货号 G8769） | |||
| 1 M HEPES缓冲液（Gibco，货号 15630-080） | |||
| 1×磷酸盐缓冲液（PBS；Cellgro，货号 2109310CV） | |||
| Corning 500 ml真空滤瓶（VWR，货号 430769） | |||
| 载玻片（VWR，货号 48311-702） | |||
| 吉姆萨染液（50倍）（VWR，货号 m708-01） | |||
| mirVana miRNA提取试剂盒（Ambion，ThermoFisher Scientific） | |||
| 5' 生物素标记的成熟miRNA（序列根据目标miRNA而定）（Dharmacon） | |||
| 生物素粉末（Sigma-Aldrich） | |||
| 1 M氯化钾 | |||
| 链霉亲和素Sepharose高容量磁珠（GE Healthcare） | |||
| 核糖体重悬缓冲液（见试剂配制） | |||
| 裂解缓冲液（见试剂配制） | |||
| 15% (w/v) 蔗糖梯度溶液（见试剂配制） | |||
| 50% (w/v) 蔗糖梯度溶液（见试剂配制） | |||
| 0.5 M蔗糖垫层（见试剂配制） | |||
| 60% (w/v) 蔗糖洗脱液（见试剂配制） | |||
| 疟原虫细胞培养基（见试剂配制） | |||
| RNA捕获洗涤缓冲液（见试剂配制） | |||
| RNA洗脱缓冲液（见试剂配制） | |||
| 试剂配制 | |||
| 溶液 | |||
| 疟原虫细胞培养基 | |||
| 500 ml RPMI-1640 培养基（含 L-谷氨酰胺） | |||
| 0.5 ml庆大霉素 | |||
| 5 ml HT补充剂 | |||
| 2.5 ml 45%葡萄糖 | |||
| 25 ml 10% AlbuMAX I | |||
| 12.5 ml 1 M HEPES | |||
| 使用0.2 mm真空滤瓶进行无菌过滤。 | |||
| 含10倍CHX的疟原虫细胞培养基 | |||
| 配方同上，额外添加： | |||
| 2 mM环己酰亚胺 | |||
| 按常规方法配制培养基，然后加入CHX至终浓度为2 mM，并进行过滤。 | |||
| 含环己酰亚胺的1× PBS | |||
| 将环己酰亚胺新鲜加入1× PBS中，终浓度为200 mM，并于4 °C保存至使用。 | |||
| 核糖体重悬缓冲液 | |||
| 400 mM乙酸钾 | |||
| 25 mM HEPES钾盐，pH 7.2 | |||
| 15 mM乙酸镁 | |||
| 200 mM环己酰亚胺（现配现加） | |||
| 1 mM DTT（现配现加） | |||
| 1 mM PMSF（现配现加） | |||
| 40 U/ml RNaseOUT（现配现加） | |||
| 裂解缓冲液 | |||
| 配方同上核糖体重悬缓冲液，额外添加： | |||
| 1% (v/v) Igepal CA-630 | |||
| 0.5% (w/v) DOC | |||
| 蔗糖溶液 | |||
| 配方同上核糖体重悬缓冲液，额外添加不同量的蔗糖： | |||
| 15% (w/v) 蔗糖配制15%蔗糖梯度溶液 | |||
| 50% (w/v) 蔗糖配制50%蔗糖梯度溶液 | |||
| 0.5 M蔗糖配制0.5 M蔗糖垫层 | |||
| 同上，环己酰亚胺、DTT、PMSF和RNaseOUT必须现配现加。 | |||
| 60%蔗糖洗脱液仅需蔗糖和水，无需其他组分 | |||
| 在DEPC处理的水中配制60% (w/v) 蔗糖，以制备60%蔗糖洗脱液 | |||
| RNA捕获洗涤缓冲液 | |||
| 20 mM KCl | |||
| 5 单位/ml Rnase Out（Invitrogen） | |||
| RNA捕获洗脱缓冲液 | |||
| 配方同RNA捕获洗涤缓冲液，额外添加： | |||
| 2 mM 生物素 | |||
| 设备 | |||
| SW55 Ti超速离心转子（Beckman，货号 342194） | |||
| SW41 Ti超速离心转子（Beckman，货号 331362） | |||
| Ultra-ClearTM ½ × 2 英寸（13 × 51 mm）超速离心管（用于SW55，Beckman，货号 344057） | |||
| Polyallomer 9/16 × 3 ½ 英寸（14 × 89 mm）超速离心管（用于SW41，Beckman，货号 331372） | |||
| L8-80M超速离心机（Beckman） | |||
| 钢制钝头注射针，4英寸，16 G（Aldrich，货号 Z261378） | |||
| 1 ml注射器配27 G½针头（Becton Dickinson，货号 309623） | |||
| 5 ml注射器（Becton Dickinson，货号 309646） | |||
| Parafilm封口膜 | |||
| 旋转混合仪（翻转式） | |||
| 带制冷功能的微量离心机 | |||
| 密度梯度分馏系统（Teledyne Isco，货号 69-3873-179） | |||
| TracerDAQ（Measurement Computing） | |||
| Eppendorf 5810R离心机 | |||
| Eppendorf A-4-81转子（Eppendorf，货号 022638807） |
参考文献
- World Health Organization. World Malaria Report. , (2014).
- Livincstone, F. B. Malaria and human polymorphisms. Annu Rev Genet. 5, 33-64 (1971).
- Nagel, R. L., Roth, E. F. Malaria and red cell genetic defects. Blood. 74, 1213-1221 (1989).
- Aidoo, M., et al. Protective effects of the sickle cell gene against malaria morbidity and mortality. Lancet. 359, 1311-1312 (2002).
- Tiffert, T., et al. The hydration state of human red blood cells and their susceptibility to invasion by Plasmodium falciparum. Blood. 105, 4853-4860 (2005).
- Fairhurst, R. M., et al. Abnormal display of PfEMP-1 on erythrocytes carrying haemoglobin C may protect against malaria. Nature. 435, 1117-1121 (2005).
- Cyrklaff, M., et al. Hemoglobins S and C interfere with actin remodeling in Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Science. 334, 1283-1286 (2011).
- Friedman, M. J. Erythrocytic mechanism of sickle cell resistance to malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75, 1994-1997 (1978).
- Pasvol, G., Weatherall, D. J., Wilson, R. J. Cellular mechanism for the protective effect of haemoglobin S against P. falciparum malaria. Nature. 274, 701-703 (1978).
- Lecellier, C. H., et al. A cellular microRNA mediates antiviral defense in human cells. Science. 308, 557-560 (2005).
- Niu, Q. W., et al. Expression of artificial miroRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance. Nature biotechnology. 24, 1420-1428 (2006).
- Zhao, G., Yu, D., Weiss, M. J. MicroRNAs in erythropoiesis. Curr Opin Hematol. 17, 155-162 (2010).
- Lee, Y. T., et al. LIN28B-mediated expression of fetal hemoglobin and production of fetal-like erythrocytes from adult human erythroblasts ex vivo. Blood. 122, 1034-1041 (2013).
- Sangokoya, C., Doss, J. F., Chi, J. T. Iron-responsive miR-485-3p regulates cellular iron homeostasis by targeting ferroportin. PLoS genetics. 9, e1003408(2013).
- Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS ONE. 3, e2360(2008).
- Sangokoya, C., Telen, M. J., Chi, J. T. microRNA miR-144 modulates oxidative stress tolerance and associates with anemia severity in sickle cell disease. Blood. 116, 4338-4348 (2010).
- Deitsch, K., Driskill, C., Wellems, T. Transformation of malaria parasites by the spontaneous uptake and expression of DNA from human erythrocytes. Nucleic acids research. 29, 850-853 (2001).
- Liang, X. H., Haritan, A., Uliel, S., Michaeli, S. trans and cis splicing in trypanosomatids: mechanism, factors, and regulation. Eukaryotic cell. 2, 830-840 (2003).
- Baum, J., et al. Molecular genetics and comparative genomics reveal RNAi is not functional in malaria parasites. Nucleic acids research. 37, 3788-3798 (2009).
- Hall, N., et al. A comprehensive survey of the Plasmodium life cycle by genomic, transcriptomic, and proteomic analyses. Science. 307, 82-86 (2005).
- Caro, F., Ahyong, V., Betegon, M., DeRisi, J. L. Genome-wide regulatory dynamics of translation in the asexual blood stages. eLife. 3, (2014).
- Oehring, S. C., et al. Organellar proteomics reveals hundreds of novel nuclear proteins in the malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome biology. 13, R108(2012).
- Lasonder, E., et al. Analysis of the Plasmodium falciparum proteome by high-accuracy mass spectrometry. Nature. 419, 537-542 (2002).
- Bozdech, Z., et al. The transcriptome of the intraerythrocytic developmental cycle of Plasmodium falciparum. PLoS biology. 1, E5(2003).
- Gardner, M. J., et al. Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Nature. 419, 498-511 (2002).
- Zhang, M., Joyce, B. R., Sullivan, W. J. Jr., Nussenzweig, V. Translational control in Plasmodium and toxoplasma parasites. Eukaryotic cell. 12, 161-167 (2013).
- Lacsina, J. R., LaMonte, G., Nicchitta, C. V., Chi, J. T. Polysome profiling of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Molecular and biochemical parasitology. 179, 42-62 (2011).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome biology. 14, R128(2013).
- LaMonte, G., et al. Translocation of sickle cell erythrocyte microRNAs into Plasmodium falciparum inhibits parasite translation and contributes to malaria resistance. Cell host & microbe. 12, 187-199 (2012).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. The Journal of parasitology. 65, 418-420 (1979).
- Bourgeois, N., et al. Comparison of three real-time PCR methods with blood smears and rapid diagnostic test in Plasmodium sp. infection. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 16, 1305-1311 (2010).
- Abruzzo, L. V., et al. Validation of oligonucleotide microarray data using microfluidic low-density arrays: a new statistical method to normalize real-time RT-PCR data. Biotechniques. 38, 785-792 (2005).
- Sangokoya, C., LaMonte, G., Chi, J. T. Isolation and characterization of microRNAs of human mature erythrocytes. Methods in molecular biology. 667, 193-203 (2010).
- Rathjen, T., Nicol, C., McConkey, G., Dalmay, T. Analysis of short RNAs in the malaria parasite and its red blood cell host. FEBS Lett. 580, 5185-5188 (2006).
- Xue, X., Zhang, Q., Huang, Y., Feng, L., Pan, W. No miRNA were found in Plasmodium and the ones identified in erythrocytes could not be correlated with infection. Malar J. 7, 47(2008).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
