我们介绍一种用于创建基于细胞的神经递质荧光工程报告系统（CNiFERs）的方案，以实现对容积性神经递质释放的光学检测。
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摘要
摘要
基于细胞的神经递质荧光工程报告系统（CNiFERs）为神经科学家提供了一种通过光学手段检测大脑中神经递质释放的新工具 体内. 一种特定的CNiFER由稳定表达某种特异性G蛋白偶联受体（该受体与G蛋白偶联）的人胚胎肾细胞构建而成q/11 G蛋白，以及基于FRET的Ca2+-检测器，TN-XXL。受体激活会导致FRET信号增强。CNiFER细胞具有纳摩尔（nM）级别的灵敏度和秒级的时间响应，这是因为CNiFER克隆株利用了特定神经递质的天然受体， 例如，D2R 用于多巴胺。CNiFERs 可直接植入大脑，能够以低于一百 µm 的空间分辨率感知神经递质释放，因此非常适合用于测量容积传递 体内CNiFERs 还可用于筛选其他药物是否存在潜在的交叉反应性 体内我们最近扩展了CNiFER家族，以包括与G蛋白偶联的G蛋白偶联受体（GPCRs）输入/输出 G蛋白。CNiFER可用于检测乙酰胆碱（ACh）、多巴胺（DA）和去甲肾上腺素（NE）。鉴于任何G蛋白偶联受体（GPCR）均可用于构建新型CNiFER，而人类基因组中约有800种GPCR，本文将介绍设计、实现和测试各类CNiFER的一般性实验流程。
引言
要充分理解神经元在大脑中如何进行通信，必须具备一种能够检测神经递质释放的方法。 体内有几种成熟的技术可用于神经递质的测定 体内一种常用的技术是微透析法，即将套管插入脑内，收集少量脑脊液，并采用高效液相色谱结合电化学检测进行分析。1微透析的空间分辨率在探针直径的数倍范围内。 例如，对于直径为200 μm的微探针，空间分辨率约为0.5 mm。然而，该技术的时间分辨率较低，因为采样间隔通常持续约5分钟或更长1此外，分析并非实时进行。另一种技术是快速扫描循环伏安法（FSCV），该技术使用插入脑内的碳纤维探针。FSCV具有优异的时间分辨率（亚秒级）、高灵敏度（纳摩尔级）以及借助探针实现的空间分辨率 直径为5至30 μm。然而，快速扫描循环伏安法（FSCV）仅限于检测那些在碳电位探针上能产生特征性氧化和还原电压曲线的神经递质2.
测量神经递质的第三种技术是通过基因编码的神经递质（NT）生物传感器直接检测3通过该方法，可创建一种融合蛋白，该蛋白包含一个与荧光共振能量转移（FRET）荧光基团对偶联的神经递质配体结合域。4 或一种重排的GFP5与前两种方法不同，这些生物传感器是基因编码的，可通过转基因动物的制备或利用病毒载体急性感染细胞，使其在宿主细胞（如神经元）表面表达。迄今为止，基因编码的生物传感器仅针对谷氨酸和GABA的检测得到开发。3-5这些技术的局限性在于灵敏度较低，处于纳摩尔（nM）范围。 以及无法将检测范围扩展到大量神经递质， 例如，经典神经递质、神经肽和通过G蛋白偶联受体（GPCRs）介导信号传导的神经调质。事实上，人类基因组中包含近800个GPCRs。
为解决这些不足，我们开发了一种创新工具，可光学检测任何通过G蛋白偶联受体（GPCR）信号通路释放的神经递质。CNiFERs（基于细胞的神经递质荧光工程报告细胞）是经基因工程改造的单克隆HEK293细胞，可表达特定的GPCR，当其被激活时，会触发细胞内[Ca²⁺]浓度升高2+]，该信号由基于FRET的遗传编码钙指示剂检测2+ 传感器，TN-XXL。因此，CNiFERs 将神经递质受体结合转化为荧光信号的变化，从而对局部神经递质活性提供直接且实时的光学读出。通过利用特定神经递质的天然受体，CNiFERs 保留了内源性表达受体的化学特异性、亲和力以及时间动力学特性. 迄今为止，我们已开发出三种类型的 CNiFER，一种利用 M1 受体检测乙酰胆碱，一种利用 D2 受体检测多巴胺，另一种利用 α1a 受体检测去甲肾上腺素。6,7CNiFER 技术具有良好的可扩展性和可放大性，适用于任何类型的 GPCR。在本 JoVE 文章中，我们描述并展示了设计、实现和测试该技术的方法学 体内 适用于任何应用的CNiFERs。
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方案
本研究中进行的所有动物实验均遵循机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南，并已获得西奈山伊坎医学院和加州大学圣地亚哥分校IACUC的批准。
1. 生成表达G蛋白偶联受体的慢病毒以转化HEK293细胞
- 从商业来源获取特定 GPCR 的 cDNA， 例如，cdna.org。或者，使用PCR从cDNA文库中扩增GPCR基因。获取一种可表达慢病毒的载体，例如pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro（pCDH），用于DNA扩增及慢病毒的产生。
- 通过PCR将GPCR cDNA克隆至慢病毒表达载体中。参见Lorenz8有关PCR亚克隆的详细信息。
- 使用无内毒素的“大提”质粒抽提试剂盒，按照制造商说明书扩增并纯化 GPCR-pCDH DNA。通过DNA测序确认亚克隆至pCDH中的GPCR cDNA无突变。
注意：在提交 DNA 用于病毒制备之前，应取部分样品用适当的限制性内切酶进行消化，以确认插入片段的大小和 DNA 的纯度。 - 使用病毒核心设施（如索尔克研究所、宾夕法尼亚大学或北卡罗来纳大学的设施）制备慢病毒 等等。，或内部制备9. 使用约 25 μg>1 μ克/μl) 用于在T75培养瓶中对HEK细胞进行转染的无内毒素DNA。确保DNA具有高纯度，其吸光度比值（A260/A280约为 1.8。
注意：病毒滴度约为1011-1012 GC/ml 是转导 HEK293 细胞的最佳浓度。
2. 选择用于培养的 HEK293/TN-XXL 骨架细胞类型 体外
注意：确定G蛋白偶联特异性， 例如，G输入/输出，Gq/11，或 Gs G蛋白，属于GPCR，因为这决定了CNiFER是否需要G蛋白嵌合体。对于Gq偶联受体 例如M1 毒蕈碱受体，选择 HEK293/TN-XXL(#3g8) 作为主干的 HEK293 细胞类型。对于 G输入/输出-偶联受体，嵌合G蛋白 Gqi5 是必需的10. 对于 Gs偶联受体，Gqs5 需要嵌合体10在本方案中，以构建D2R CNiFER为例。 D2R 通过 G 介导信号传导输入/输出 G蛋白，需要稳定表达嵌合G蛋白G的HEK293细胞qi5, 例如, HEK293/TN-XXL/Gqi5_#qi5.6.
- 从研究实验室获取 HEK293/TN-XXL/Gqi5_#qi5.6 单克隆细胞。注意：以下单克隆细胞可应要求免费提供6,7：用于 Gq 偶联受体的 HEK293/TN-XXL(#3g8)、用于 Gi/o 偶联受体的 HEK293/TN-XXL/Gqi5 (#qi5.6)，以及用于 Gs 偶联受体的 HEK293/TN-XXL/Gqs5 (#qs5.47)。
- 在含有 5 ml HEK293 生长培养基（表 1）的 T25 培养瓶中，将 HEK293/TN-XXL/Gqi5_#qi5.6 细胞培养至约 90% 汇合度。在 37 °C、含 5% (v/v) CO2 的湿润培养箱中培养细胞。
注意：所有 HEK293 细胞培养操作均应采用标准无菌组织培养技术进行。 - 首先从 T25 培养瓶中吸除培养基以收获细胞。加入 5 ml PBS 轻柔洗涤细胞，并轻轻晃动培养瓶。
- 移除 PBS，加入 1 ml 0.05% (w/v) 胰蛋白酶/EDTA（表 2）。在 37°C、含 5% (v/v) CO2 条件下孵育 1 至 2 分钟 。
- 收集细胞并转移至无菌的 15 ml 圆锥形离心管中。在细胞培养离心机中以 1,000 × g 离心 5 分钟 。吸除上清液。
- 用 5 ml HEK293 生长培养基重悬细胞沉淀。使用台盼蓝在血细胞计数板上计数细胞。计算细胞密度，并进入步骤 3。
3. HEK293/TN-XXL/Gqi5 细胞的慢病毒转导
- 在T25培养瓶中接种0.7 x 10⁶个细胞6 HEK293/TN-XXL/Gqi5 细胞。将细胞置于37℃、湿润的培养箱中培养。 °C，含5%（v/v）CO₂2 培养约1天，直至细胞融合度达到约50%。将剩余细胞冻存（步骤8.2–8.3）。这些细胞将作为CNiFER对照细胞， 即一种缺乏G蛋白偶联受体的CNiFER。
- 感染当天，将表达GPCR的慢病毒（步骤1.4）稀释至终浓度约为~109 GC/ml，总体积为2 ml的HEK293生长培养基（表1）。例如，加入 20 μ10 分之 111 将GC/ml病毒加入T25培养瓶中的2 ml培养基中。
注意：病毒滴度信息应由病毒核心平台提供。将慢病毒与培养基在离心管中轻柔混匀。高滴度慢病毒属于生物安全二级（BSL-2）级别。 - 从T25培养瓶中吸除培养基。加入步骤3.2中制备的2 ml病毒/培养基混合液。将T25培养瓶在37℃过夜孵育。 °含5%（v/v）CO的C2.
- 感染一天后，吸除病毒/培养基混合液，更换为含有嘌呤霉素（2 μg/ml 表1）。嘌呤霉素用于筛选转导细胞。将培养瓶在37℃孵育 °含5%（v/v）CO的C2 培养约1-2天，直至细胞融合度达到约90%。
- 准备一个96孔板（黑色板体，透明底），包被纤维连接蛋白，用于在步骤4.1中生成10点激动剂/激活曲线。在无菌操作台中，加入50 μl 纤连蛋白 (5 μ每孔加入 g/ml，在 96 孔板的 A 行和 B 行中孵育，室温孵育 1 小时。用缓冲液冲洗两次 5 分钟 每次用PBS冲洗后，加入50 μl 的 HEK293 生长培养基，37℃ 过夜培养 °C，含5%（v/v）CO₂2.
注：已处理纤维连接蛋白的培养板可商业购买。 - 按照步骤 2.3-2.6 中所述方法收获 T25 培养瓶中的细胞表 2).
- 将细胞沉淀重悬于5 ml HEK293生长培养基中。取1.5 ml细胞接种至T25培养瓶用于FACS分析。另取1 ml细胞接种至T75培养瓶用于冻存和保存（见步骤8.2–8.3）。
- 对于10点激动剂曲线，将第3.5步中制备的纤维连接蛋白包被的96孔板的前两行（A和B）每孔接种100 μ每孔加入细胞悬液 l。
- 将培养于T25培养瓶、T75培养瓶和96孔板中的HEK293细胞在37℃下孵育至约90%汇合度 °C，5%（v/v）CO₂2约1-2天后。
4. FACS 及单个 CNiFER 克隆的分离
- 使用96孔板生成10个浓度点的激动剂激活曲线。
注意：在开始荧光激活细胞分选（FACS）分析之前，需通过检测转导细胞对激动剂的反应（10点激动剂浓度曲线）来确认G蛋白偶联受体（GPCR）的表达。该检测使用荧光酶标仪进行。- 为10点激动剂激活曲线制备药物板。选择10种不同的激动剂浓度，使其范围涵盖预测的EC50, 可根据文献确定。
注意：药物板中每种浓度包含3个复孔 （设两个重复）以校正CNiFER板中1:3的稀释倍数。例如，用于测试D2型CNiFER的药物板中含有10种不同浓度的多巴胺，其浓度按3倍递增，分别为0.2、0.5、1、3、5、10、20、30、50和1,000 nM；因此，在CNiFER板中，多巴胺的终浓度分别为0.067、0.167、0.333、1.00、1.67、3.33、6.67、10.0、16.7和333 nM。 - 使用人工脑脊液（ACSF）配制激动剂溶液表1）。使用两个孔进行“ACSF”处理， 例如，A1 和 A2，以及两个“无细胞”孔 例如，B1 和 B2。
注意：使用倍比稀释法配制不同浓度的药物。创建一个模板，用于记录 CNiFER 克隆株及药物浓度（图3). - 使用软件对96孔荧光检测仪进行编程，以测量FRET并执行溶液转移。
- 将酶标仪温度设置为 37 °C.
- 使用TN-XXL测量FRET时，将激发波长设置为436 ± 4.5 nm（中心） ± 半高宽（HWHM）。将发射滤光片设置为 485 ± 7.5 nm（eCFP）和527 ± 7.5 nm（Citrine）。将截止滤光片分别设置为eCFP 475 nm和Citrine 515 nm。
- 将酶标仪设置为每 4 秒测量一次 485 nm 和 527 nm 处的发射光 共计 180 秒。选择输送 50 的选项 µ从3倍药物板转移至100 μ在收集30秒后，于CNiFER板中 基线荧光强度。
- 吸弃 A 行和 B 行的培养基，加入 100 µ向约90%融合的96孔CNiFER板（步骤3.9）中加入l ACSF。
- 将96孔CNiFER板和“3倍稀释”药物板放入酶标仪中，孵育约30分钟 使培养板在37℃下平衡 °C. 然后，启动程序。
- 为分析酶标仪数据，将荧光值导出至电子表格。建立公式，从含CNiFERs的孔中减去背景信号值（即无细胞孔中各信号的测量值）。将荧光强度归一化至刺激前基线值，FCitrine(t)/F黄色荧光蛋白Citrine（基线），并计算FRET比率（ΔR/R；公式1），使用527 nm和485 nm发射波长处的峰值响应（见步骤11）。
注意：如果出现显著变化 Δ若加入激动剂后出现FRET反应，则表明GPCR表达成功，可进行后续的FACS分析（步骤4.2）。若激动剂刺激后无FRET响应，可通过使用Ca²⁺检测等方法进行故障排查2+ 离子载体， 例如，A21387，用于检测Ca2+ 响应并确认基于FRET的传感器正常工作。如果离子载体发挥作用，则表明受体很可能未表达。
- 为10点激动剂激活曲线制备药物板。选择10种不同的激动剂浓度，使其范围涵盖预测的EC50, 可根据文献确定。
- 在FACS前一天，准备四个已包被纤连蛋白的96孔板（参见步骤3.5），用于收集分选后的细胞。每孔加入50 μl 的 HEK293 生长培养基，过夜孵育 37 °C，5%（v/v）CO₂2.
- 在 PBS 中配制 5% (w/v) BSA（5 g/100 ml），过滤（0.2 μm) 转移至无菌瓶中。
- 收获在T25培养瓶中培养的细胞（参见步骤2.3-2.5）， 表 2将细胞沉淀重悬于4 ml含5%（w/v）BSA的PBS中。以1,000 × g离心5分钟。
- 吸弃培养基，将细胞沉淀重悬于约 5 ml 的 PBS 中 5% (w/v) BSA 溶液中，使最终细胞浓度约为 5 x 10⁶ 个/ml。6 细胞/毫升
注意：请向流式细胞分选核心平台咨询有关细胞密度和分选条件的具体要求。 - 用40 μm细胞筛过滤重悬的细胞 μ使用m细胞滤网去除细胞团块。将细胞转移至5 ml聚丙烯圆底管中。将试管置于冰上，运送至流式细胞分选（FACS）实验中心。
- 在FACS平台分选转导的HEK293细胞。在FACS流式细胞仪上设置以下参数：设4 °样品台 C，100 μ喷嘴的 m 值和 20 p.s.i.。根据分选前分析，选择细胞， 即，选择一个具有强eCFP荧光（eCFP激发，eCFP发射）和强FRET荧光（eCFP激发，Citrine发射）的“门”（见下文结果部分） 图2).
- 将单个分选后的细胞接种到步骤4.2中准备好的96孔板中，每孔一个克隆，每孔含有50 μ含嘌呤霉素的 HEK293 生长培养基。加入 50 μ含嘌呤霉素的 HEK293 生长培养基 毫升表1) 总计100 μ每孔1升。过夜培养细胞 37℃ °含 5% (v/v) CO 的 C2.
注意：HEK293 生长培养基中含有嘌呤霉素，用于筛选转导细胞。
5. 分选后克隆型 CNiFER 细胞的培养与扩增
- 通过从每个孔中移除 50 μl 旧培养基，并加入含嘌呤霉素的新鲜 HEK293 生长培养基 50 μl，维持 CNiFERs 在 96 孔板中的培养（表 1）。每 5 至 7 天重复一次，持续 2 至 3 周，直至细胞融合度达到约 90%。
- 轻轻吸除培养基以收获 CNiFER 细胞，并用 PBS 轻柔冲洗一次。吸除 PBS 后，加入 20 μl 0.05% (w/v) 胰蛋白酶/EDTA。在 37°C、5% (v/v) CO2 条件下孵育 1 至 2 分钟 。
- 向经胰蛋白酶处理的细胞中加入 100 μl HEK293 生长培养基并重悬细胞。将细胞悬液转移至含有 400 μl 新鲜含嘌呤霉素 HEK293 生长培养基的 24 孔板中。在 24 孔板中，每 5 至 7 天更换 250 μl HEK293 生长培养基，维持细胞培养，直至孔内细胞融合度达到约 90%。
6. 使用荧光酶标仪通过FRET反应鉴定候选CNiFERs
注意：在进行FACS之后，若有四个96孔板，则应 >100 个可检测的克隆，这些克隆能够存活并扩增至 24 孔板阶段，因为许多原始克隆无法生长。为鉴定潜在的候选 CNiFERs，需使用三点分析法检测其对相应激动剂的 FRET 反应， 例如，多巴胺用于D2R。
- 当24孔板中的细胞汇合度达到约90%时，轻柔吸除培养基。加入约100 μL胰蛋白酶进行消化。 μ0.05 % (w/v) 胰蛋白酶/EDTA 溶液，孵育 1–2 分钟 37℃ °C，含5%（v/v）CO₂2. 加入400 μ向经胰蛋白酶处理的HEK293细胞中加入l生长培养基，并通过轻柔吹打混匀细胞。
- 为克隆的初步筛选建立三点激动剂曲线。针对每个CNiFER克隆， 即，从24孔板的一个孔中，分装100 μ细胞悬液的 l（约 4 x 103 每孔细胞数）分别加入三个孔中， 例如，A1、A2、A3，加入经纤连蛋白包被的96孔板（黑色板身，透明底）中（参见步骤3.5）。
- 转移剩余的约200 μ将细胞悬液转移至含1,000的12孔板中 μl HEK293 生长培养基（最终体积 1.2 ml）。将两块培养板在 37℃ 下孵育 °C，含5%（v/v）CO₂2，直至细胞汇合度达到约90%。96孔板用于荧光测定，12孔板用于克隆的培养与扩增。
- 对于三点分析，确定激动剂的三个不同浓度，分别为 EC50 针对特定的GPCR。按照步骤4.1.1-4.1.2所述，在药物板中配制激动剂浓度。按照步骤4.1.3-4.1.5所述，进行荧光测定法微孔板检测。
- 计算FRET比率（ΔR/R)，具体操作如步骤 4.1.6 所述。选择具有适当敏感性和最大 FRET 响应的 CNiFERs 用于扩增、冻存以及更全面的分析（步骤 7）。
- 对于在步骤6.5中筛选出并在12孔板中生长的克隆，移除并替换600 μL培养基。 μ每5至7天更换一次HEK293生长培养基，直至细胞融合度达到约90%。
- 逐步将克隆从12孔板扩增至6孔板，然后扩增至T25培养瓶（步骤2.3 - 2.6及 表 2当T25培养瓶中细胞融合度达到约90%时，按前述方法收集细胞（步骤2.3–2.5）。将细胞沉淀重悬于5 ml HEK293生长培养基中。
- 将1 ml细胞悬液加入含有9 ml HEK293生长培养基的T75培养瓶中。剩余4 ml细胞悬液用于冷冻保护并储存于液氮中2 （步骤 8.2–8.3）准备八个 1.5 ml 冻存管，置于冰上。
- 在T75培养瓶中，通过更换为新鲜的HEK293生长培养基来维持细胞 例如每3-5天换液10 ml，持续约1-2周，直至细胞融合度达到70-80%。
7. 使用荧光酶标仪对CNiFER克隆进行最终筛选
- 在进行微孔板读板实验的前一天：
- 从一个约 90% 汇合度的 T75 培养瓶中收集细胞（参见步骤 2.3–2.6 和表 2）。将细胞悬液以每孔约 100 μl、接种密度为 5 × 104/孔，接种至经纤维连接蛋白包被的 96 孔板（黑色板体，透明底）。注意：每个克隆分配至一个单独的 96 孔板中。
- 为全面筛选 CNiFER 克隆，制备药物板，以区分特异性激动剂反应与非特异性 CNiFER 反应。
- 为获得完整的剂量-反应曲线，选择围绕预测 EC50 的 10 种不同激动剂浓度。设置两个“无细胞”孔和两个“人工脑脊液（ACSF）”孔。
- 为确定非特异性反应，选择 12 种不同神经递质或调节剂的三种浓度（共 72 孔）（图 3）。与激动剂相同，药物板中每种物质以三倍浓度梯度设置重复孔。例如，将乙酰胆碱、谷氨酸、食欲素、血管活性肠肽（VIP）、腺苷、5-羟色胺、去甲肾上腺素、γ-氨基丁酸（GABA）、P 物质、褪黑素、生长抑素和组胺各三种浓度（50、1,000 和 3,000 nM）分别取 100 μl 加入 96 孔药物板中。
- 根据步骤 4.1.3–4.1.5 的描述，在荧光微孔板读板仪上设置测量 FRET 及执行溶液转移的参数。
- 分析完整剂量-反应曲线时，计算峰值 FRET 比值（ΔR/R）（步骤 4.1.6），以对数激动剂浓度为横坐标作图，并用 Hill 方程拟合（步骤 11.4），确定 EC50、Hill 系数和最大 FRET 比值。对于其余 12 种神经递质/调节剂，以药物浓度为横坐标，绘制峰值 ΔR/R 曲线。
- 选择约 10 个 FRET 比值较大、对相应激动剂具有合适 EC50、且对其他神经递质激动剂无明显背景反应（非特异性反应）的 CNiFER 克隆。
8. 冻存选定的 CNiFER 克隆
- 使用一个 ~90% 汇合度的单个 CNiFER 克隆 T75 培养瓶。按所述方法收集细胞（步骤 2.3–2.5， 表2）。冷冻细胞时，将细胞沉淀重悬于5 ml HEK293生长培养基中。标记10个1.5 ml冻存管并置于冰上。
- 为进行冷冻保护，将细胞与含20%（v/v）DMSO的HEK293生长培养基按1:1比例混合， 例如将5 ml的20%（v/v）DMSO/培养基混合液与5 ml细胞悬液轻轻混合（DMSO的终浓度为10%）。
- 将1 ml分装至各冻存管中。将含有细胞的冻存管于-80℃冻存 °C 冻存盒中过夜，置于泡沫保温箱内（参见 材料将冻存管转移至液氮中进行长期保存。
9. CNiFER 植入小鼠皮层
- 将所有手术器械在高压灭菌器中灭菌 手术前，使用70%乙醇擦拭并铺上干净的实验垫，以准备半无菌手术区域。
- 使用垂直电极拉制仪将玻璃毛细管（内径0.53 mm）拉制成CNiFER注射移液管。用一对5号尖头镊子将电极尖端折断至直径约40 μm
注意：此操作最好在带有目镜测微尺的体视变倍显微镜下完成。 - 麻醉一只成年（出生后第 60–90）使用异氟烷对 C57BL/6 小鼠进行麻醉：诱导浓度为 4%（v/v），维持浓度为 1.5% 至 2.0%（v/v）。通过尾部或足趾夹捏反应确认小鼠已完全麻醉。
注意：手术过程中需定期重新检查夹趾反应，并评估胡须颤动，以再次确认麻醉深度。 - 用眼膏覆盖眼睛以防止干燥。将小鼠固定在立体定位仪框架中 耳杆。保持小鼠体温在37℃ °使用直肠探针调节的加热垫维持体温。
- 用动物专用电动剃毛器剃除约5 mm × 12 mm区域的毛发。先涂抹聚维酮碘，再使用70%（v/v）异丙醇处理。 使用手术刀片切开并移除颅骨表面的皮肤。使用手术刀片去除颅骨表面的骨膜。 暴露并清洁颅骨表面，操作方法同立体定向手术所述11.
- 将空的玻璃移液管降至前囟，记录前后（A/P）和内侧-外侧（M/L）坐标。参考小鼠脑图谱，计算注射位点的位置。将移液管移至目标位点，并在颅骨上标记，以备后续开窗操作。参见 Cetin 等 有关啮齿类动物立体定位注射的详细信息11.
注意：注射位点和观察窗口的位置取决于所研究的脑区以及皮层中神经递质或肽类释放投射的分布情况。例如，在最近的一项研究中7，采用立体定位坐标 A/P +1.0 至 +2.0 mm 和 M/L +1.0 至 +2.0 mm 将 CNiFER 细胞注射至额叶皮层 体内 经典条件反射过程中多巴胺释放的成像 - 制作一个 2 mm × 3 mm 的薄颅窗，操作步骤如前所述12,13.
注意：窗口中的骨组织应为15-20 μm 厚。当颅骨表面湿润时，若骨层已充分磨薄，则骨中的小白点不应可见。12,13. - 在准备注射细胞时，将浸有ACSF的海绵放在窗口上以保持湿润。
- 收获在T75培养瓶中生长至约80%汇合度的CNiFER克隆。吸除培养基，并用无菌PBS洗涤细胞。
注意：这些步骤中省略了胰蛋白酶。 - 吸除 PBS，加入 10 ml ACSF 以使细胞从培养瓶底部脱落。吹打细胞以分散细胞团块。离心后将沉淀重悬于 100 μl ACSF。离心30秒 在1,400 × g离心后去除上清液，保留含有ACSF的沉淀。此步骤使细胞团块保持悬浮状态。
- 用矿物油回填第9.2步制备的注射移液管，将移液管装入纳米注射仪，推进活塞以排出少量油珠。放入5 μ将 CNiFER 细胞悬液滴加到靠近小鼠制备区域的塑料石蜡膜条上。用拉制的移液管吸取 CNiFER 细胞或对照 CNiFER 细胞。
- 将移液器移动至目标 X 和 Y 坐标， 即，A/P 和 M/L 参见步骤 9.5。降低移液管，刺穿变薄的颅骨，继续插入至约 200–400 μ颅骨表面下方 m 处，将 CNiFER 细胞植入大脑皮层第 2/3 层。
- 使用纳米注射器在最深位点注射约 4.6 nl 的 CNiFER 细胞，观察油液与细胞界面的移动，随后等待 5 分钟 用于细胞分配。将移液器回撤约100 μm，并注射约4.6 nl的CNiFER细胞，等待5分钟. 然后缓慢轻柔地抽出移液管，以防止CNiFERs回流。在一处或多处邻近位点重复注射。
- 重复步骤9.8–9.12，使用对照HEK293细胞（即，HEK293/TN-XXL/Gqi5 克隆缺失GPCR）。将CNiFER细胞与对照细胞的注射位点间隔约200 μm
- 细胞植入完成后，用ACSF冲洗颅窗，等待颅骨干燥。滴加一滴氰基丙烯酸酯胶（参见 材料) 上，迅速将预先切割好的无菌盖玻片置于胶水之上。轻轻按压盖玻片使其贴合颅骨，持续数秒。让胶水干燥 2 分钟。12,13.
- 用牙科水泥密封盖玻片边缘，并在窗口周围形成一个蓄水井，用于浸水物镜的使用。
- 为在成像过程中固定小鼠头部，使用少量氰基丙烯酸酯胶水将定制的头部固定杆粘附于窗口后方（参见14 有关尺寸和材料的详细信息，请参见相关说明）。让胶水彻底干燥，然后添加更多牙科水泥，以进一步加固自制的头杆。
- 用牙科水泥覆盖颅骨表面的其余部分（窗口除外）。确保皮肤边缘被水泥覆盖，并静置干燥 20 分钟。
- 手术后，停止异氟烷给药，将小鼠置于笼内加热垫上，直至其完全从麻醉中恢复。皮下注射生理盐水配制的5%（w/v）葡萄糖以补充水分，腹腔注射0.05至0.1 mg/kg布托啡诺（速释型）用于术后镇痛。
注意：为尽量减少对人源 CNiFERs 可能产生的免疫反应，需每日向小鼠注射 20 μ每100克体重腹腔注射环孢素A（i.p.），从CNiFERs注射前一日开始。 - 将小鼠放回其饲养笼中，提供食物和水。
10. 体内 成像 CNiFER 克隆
注意：使用双光子显微镜和头部固定装置对小鼠进行活体成像。成像过程中无需麻醉。 在清醒动物成像时，每次头部固定时间应限制在数小时内，以降低应激水平。成像间歇期间应将动物放回其饲养笼中，以提供食物和饮水。通过调暗室内灯光并将小鼠部分身体置于围栏中，可进一步减少潜在的应激刺激。
- 术后次日，通过将颅骨上植入的金属头杆拧接到头部固定架上，将小鼠固定于成像平台。
注意：对清醒小鼠进行成像时，由于头部固定装置可能引起应激反应，成像时间不应超过数小时。 - 将带有头部固定小鼠的成像平台置于配备10X（0.30 NA）和40X（0.80 NA）水浸物镜的双光子成像显微镜中。
- 插入用于FRET成像（eCFP和Citrine）的滤光片组，该滤光片组包含505 nm的二向色镜，以及用于检测eCFP的460 nm至500 nm带通滤光片和用于检测Citrine的520 nm至560 nm带通滤光片。
- 将人工脑脊液（ACSF）加入含有去颅骨窗的孔中，并将水浸物镜浸入ACSF中。结合汞灯和GFP滤光镜，使用目镜定位去颅骨窗下皮层表面及下方的血管结构。
注意：血管的分布模式有助于在多次成像过程中定位并重复观察同一区域。 切换至40倍水浸物镜，使用GFP滤光立方体和汞灯，通过手动聚焦于细胞上方的皮层表面来定位CNiFERs。 - 双光子成像设置。选择适用于双光子成像的光路。对于典型的商用系统，使用软件切换至双光子成像模式，并将光信号引导至非扫描探测器中的光电倍增管（PMTs）。开启近红外飞秒脉冲激光器，选择820 nm的波长和5–15%的功率设置。注意：5%的功率通常 在样本处提供约 25 mW 的功率。
- 设置 PMT1 & PMT2 电压接近最大值，通常为 700–1,000 V，具体取决于 PMT。将每个通道的增益设置为 1 并将物镜的 z 位置归零。
- 将物镜降低约100至200 μ从皮层表面下方 m 处开始进行 x-y 扫描。为每个通道调整激光功率、增益和 PMT 电压， 即，eCFP 和 Citrine，以优化 CNiFER 荧光的信噪比。
- 使用软件中的缩放功能，将图像限定在包含CNiFER细胞及背景区域的范围内。扫描速率不得慢于每2秒一帧（0.5 Hz），在4 μ每像素秒。调整线平均以获得合适的信噪比， 例如，卡尔曼2线平均。
- 在CNiFER细胞周围绘制感兴趣区域（ROI），每层包含约3至4个细胞。设置对ROI平均荧光强度的实时分析。开始采集以随时间监测CNiFER荧光信号。
- 在实验操作前后收集CNiFERs的荧光信号， 例如，电刺激，ChR2 刺激，行为，由用户确定
- 成像实验完成后，将小鼠放回其饲养笼中。根据需要，可在不同天重复进行成像。再次对细胞成像时，参考先前获取的低倍率血管图像，以重新定位至相同的成像区域（步骤10.4）。
注：植入的 CNiFERs 可至少成像 7 天。
11. 数据分析
- 打开成像文件，为CNiFERs选择感兴趣区域（ROI），并为背景选择一个ROI。对每个ROI的两个通道均选择“序列分析”。将每个ROI的平均荧光强度导出为制表符分隔的文件。
- 使用数学软件（见材料）分析荧光值。对每个信号进行低通滤波（0.3 Hz），然后从eCFP和Citrine荧光强度中减去每个ROI的背景荧光。
- 计算基线的平均荧光强度，并按照公式1所述方法计算比值，以测量FRET比值ΔR(t)/R。
- 为确定CNiFERs的灵敏度，绘制FRET比值随激动剂浓度对数变化的曲线。使用科学统计软件和Hill方程（公式2）拟合数据，以确定EC50和Hill系数（n）。
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结果
CNiFER 来源于经基因工程改造的、可稳定表达至少两种蛋白的人胚胎肾（HEK293）细胞：一种特异性的G蛋白偶联受体（GPCR）和一种基因编码的[Ca2+] 传感器 TN-XXL。TN-XXL 在响应 Ca²⁺ 时，其青色荧光蛋白 eCFP 与黄色荧光蛋白 Citrine 之间发生荧光共振能量转移（FRET）。2+ 离子6,15. 激活与内源性G蛋白偶联的GPCRq G蛋白触发胞质内[Ca2+] 通过 PLC/IP3 通路，导致TNXXL Ca的FRET信号增强2+ 检测器 (图1).
图1：CNiFERs 的构建示意...
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讨论
CNiFERs 的创建为光学检测脑内神经递质的释放提供了一种创新且独特的方法 体内CNiFERs 非常适合用于测量突触外释放， 即，体积传导，用于神经递质。重要的是，每种CNiFER都具有天然G蛋白偶联受体（GPCR）的特性，可对脑内神经递质量变提供生理性的光学测量。迄今为止，已开发出用于检测乙酰胆碱的CNiFER（M1-CNiFER）6，多巴胺（D2-CNiFER）7 和去甲肾上腺素（α1a-CNiFER）7.
原则上，任何通过G蛋白偶联受体（GPCR）传递信号的神经递质均可构建相应的CNiFER。对于GPCR通过G蛋白介导信号传导的情况q G蛋白，无需对HEK293细胞进行进一步修饰。通过G蛋白介导信号的GPCR输入/输出，然而，需要共表达一种Gqi5 嵌合G蛋白将GPCR与G蛋白偶联q/PLC 信号通路7,10同样，通过G蛋白偶联受体（GPCRs）介导G蛋白信号通路的...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢加利福尼亚大学旧金山分校的 B. Conklin 提供 Gqi5 和 Gqs5 cDNA、A. Schweitzer 在电子设备方面的协助、N. Taylor 在克隆筛选方面的协助、Ian Glaaser 和 Robert Rifkin 的校对，以及 Olivier Griesbeck 提供的 TN-XXL。本研究得到了美国国家药物滥用研究所（NIDA）（DA029706；DA037170）、国家生物医学成像与生物工程研究所（NIBIB）（EB003832）、罗氏公司（Hoffman-La Roche）（88610A）的科研基金资助。 "与滥用药物相关的神经科学" 通过NIDA获得的培训资助（DA007315）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro | System Biosciences | CD510B-1 | 克隆：用于生成慢病毒 |
| 12 x 75 毫米 BD Falcon 高透明度聚丙烯圆底试管 | BD 生物科学 | 352063 | FACS |
| BD 40 μm Falcon 细胞滤网 | BD Biosciences | 352340 | FACS |
| 0.05% 胰蛋白酶 EDTA | Invitrogen | 25200056 | FACS |
| 96孔板，平底，透明 | 康宁 | 3596 | FACS |
| 96孔细胞培养板 | 康宁 | CLS3997 | Flexstation |
| Optilux 黑色透明底板 | 康宁 | 3603 | Flexstation |
| Flexstation 移液吸头 | Molecular Devices | 9000-0911 | Flexstation |
| 乙酰胆碱氯化物 | Sigma-Aldrich | A2661 | Flexstation |
| 去甲肾上腺素 | Sigma-Aldrich | A7256 | Flexstation |
| 盐酸多巴胺 | Sigma-Aldrich | PHR1090 | Flexstation |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | Flexstation |
| 组胺 | Sigma-Aldrich | H7125 | Flexstation |
| 谷氨酸 | Sigma-Aldrich | 49621 | Flexstation |
| 肾上腺素 | Sigma-Aldrich | E4642 | Flexstation |
| 生长抑素 | Sigma-Aldrich | S1763 | Flexstation |
| 5HT | Sigma-Aldrich | H9523 | Flexstation |
| VIP | Alpha Diagnostics 公司 | SP-69627 | Flexstation |
| Orexin A | Alpha Diagnostics 公司 | 12-p-01 | Flexstation |
| P 物质 | Sigma-Aldrich | S6883 | Flexstation |
| 腺苷 | Sigma-Aldrich | A4036 | Flexstation |
| 褪黑素 | Sigma-Aldrich | M5250C | Flexstation |
| 荧光酶标仪 &和软件 | Molecular Devices | Flexstation 3 | Flexstation |
| 含谷氨酰胺和高糖的DMEM | Life Technologies | 10569-010 | 组织培养 |
| 胎牛血清 | Life Technologies | 10082-139 | 组织培养 |
| 青霉素/链霉素 抗生素 | Life Technologies | 15140-122 | 组织培养 |
| 嘌呤霉素 | InvivoGen | ant-pr-1 | 组织培养 |
| 纤连蛋白 | Sigma-Aldrich | F0895 | 组织培养 |
| CoolCell LX 无酒精程序降温细胞冻存盒 | Bioexpress | D-3508 | 组织培养 |
| 氰基丙烯酸酯胶水 | Loctite | Loctite 495号 | 手术与立体定位注射 |
| 塑料石蜡膜 | VWR | Parafilm® | 手术与立体定位注射 |
| 纳米注射器 | 德拉蒙德 | 3-000-204 | 手术与立体定位注射 |
| 玻璃电极 | 德拉蒙德 | 3-000-203G | 手术与立体定位注射 |
| 手持电钻 | OSADA | Exl-M40 | 手术与立体定位注射 |
| 钻头磨具 | 精细科学 | 19007-05; 19007-07) | 手术与立体定位注射 |
| 灭菌浴 | FST | 18000-45，热珠灭菌器 | 手术与立体定位注射 |
| 异氟烷麻醉舱/面罩 | 高地医疗设备 | 564-0427，HME 109 台式麻醉机，配备异氟烷蒸发器、氧气流量计和总阀；564-0852，诱导室 16×7×7.5 cm | 手术与立体定位注射 |
| 带臂的3D内窥镜 | 蔡司 | 手术与立体定位注射 | |
| 光纤光源 | 手术与立体定位注射 | ||
| 聚维酮碘 | 手术与立体定位注射 | ||
| 70 %（v/v）异丙醇 | 手术与立体定位注射 | ||
| 聚维酮碘消毒垫 | dynarex | 1108 | 手术与立体定位注射 |
| 0.9% 氯化钠注射液（USP，918610） | 手术与立体定位注射 | ||
| 环孢素（注射剂，USP） | 手术与立体定位注射 | ||
| 布托啡诺（注射剂）丁丙诺啡（0.03 μ克/克啮齿动物 | Sigma-Aldrich | 手术与立体定位注射 | |
| 眼用软膏 | 阿克恩 | NDC 17478-235-35 | 手术与立体定位注射 |
| Surgifoam | Ethicon | 手术与立体定位注射 | |
| 握持牙科水泥 | Dentsply | #675571, 675572 | 手术与立体定位注射 |
| 瞬间超级胶水 | NDindustries | 手术与立体定位注射 | |
| LOCTITE 4041 | 手术与立体定位注射 | ||
| METABOND | C&B | 手术与立体定位注射 | |
| 0号盖玻片 | Fisher | 手术与立体定位注射 | |
| 立体定位仪 | Kopf | 手术与立体定位注射 | |
| 直肠探头和加热垫 | FHC | 40-90-8D，直流温度控制器，40-90-2-06，6.5×9.5 cm加热垫，40-90-5D-02，直肠热敏电阻探头 | 手术与立体定位注射 |
| 用于成像的光学平台 | Thorlabs | 手术与立体定位注射 | |
| 矿物油 | Fisher | S55667 | 手术与立体定位注射 |
| Kwik-Cast（硅胶弹性体） | 世界精密仪器公司 | 手术与立体定位注射 | |
| 缝合 | Ethicon | 18’’, 1667, 4-0 | 手术与立体定位注射 |
| 剪刀 | 精细科学工具 | 91500-09, 15018-10 | 手术与立体定位注射 |
| Forcepts | 精细科学工具 | 11252-30；#55，11295-51；Grafe，11050-10 | 手术与立体定位注射 |
| 学生用哈尔斯泰德-蚊式止血钳 | 精细科学工具 | 91308-12 | 手术与立体定位注射 |
| 小型血管电凝器套装 | 精细科学工具 | 18000-00 | 手术与立体定位注射 |
| 热珠灭菌器 | 精细科学工具 | 18000-45 | 手术与立体定位注射 |
| 带硅胶垫的仪器箱 | 精细科学工具 | 20311-21 | 手术与立体定位注射 |
| 带硅胶垫的塑料灭菌容器 | 精细科学工具 | 20810-01 | 手术与立体定位注射 |
| 用于2P固定阶段荧光显微镜的 体内 成像 | Olympus | FV1200 MPE | 活体成像 |
| 多光子激光器 | SpectraPhysics | Mai Tai DeepSee | 活体成像 |
| 绿色激光 | Olympus | 473 nm 激光器 | 活体成像 |
| xy 平移基座 | Scientifica | MMBP | 活体成像 |
| 用于YFP和CFP的FRET滤光片组 | 奥林巴斯 | 活体成像 | |
| 10x 和 40x 水浸物镜 | Olympus | 活体成像 | |
| 气浮台 | 纽波特 | 活体成像 | |
| 定制的避光笼 | Thorlab | 活体成像 |
参考文献
- Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems. Methods. 23, 21-39 (2001).
- Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin Chem. 49, 1763-1773 (2003).
- Liang, R., Broussard, G. J., Tian, L. Imaging Chemical Neurotransmission with Genetically Encoded Fluorescent Sensors. ACS Chem Neurosci. , (2015).
- Okubo, Y., et al. Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 6526-6531 (2010).
- Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10, 162-170 (2013).
- Nguyen, Q. T., et al. An in vivo biosensor for neurotransmitter release and in situ receptor activity. Nat Neurosci. 13, 127-132 (2010).
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