一种基于ELISA的结合与竞争方法以快速确定配体-受体相互作用

摘要

本文所述方案介绍了两种基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的技术，用于快速研究配体-受体相互作用：第一种检测方法可用于测定配体与受体之间的解离常数；第二种检测方法则可实现对配体-受体相互作用阻断肽的快速筛选。

摘要

要全面理解信号通路，需要对配体-受体相互作用有深入的认识。本文介绍了两种快速且可靠的酶联免疫吸附测定（ELISA）逐点实验方案，用于研究配体-受体相互作用：直接配体-受体相互作用测定法（LRA）和竞争性LRA。以λ干扰素（IFNLs）与其受体α亚基（IL28RA）之间相互作用的ELISA分析为例进行说明：直接LRA用于测定受体与IFN配体之间的解离常数（K_D值），竞争性LRA则用于测定一种寡肽的抑制能力，该寡肽被设计用于在IFNLs的受体结合位点处与其竞争结合。文中详细描述了估算K_D值和半数最大抑制浓度（IC₅₀）值的分析步骤。最后，讨论部分重点阐述了所介绍方法的优缺点，以及这些结果如何促进对配体-受体相互作用的分子机制的深入理解。

引言

要全面理解信号通路，需要深入了解配体-受体相互作用。目前大多数评估特定配体与其受体相互作用的方法均成本高昂、耗时较长、劳动强度大，且需要专门的仪器设备和技术专长¹。

本文介绍了两种基于酶联免疫吸附测定法（ELISA）的快速、可靠的逐点检测方案，用于研究配体-受体相互作用：直接配体-受体相互作用检测法（LRA）和竞争性LRA。ELISA是一种高度灵敏、特异且易于获取的技术，几乎在每个实验室中常规使用。ELISA可根据需要以多种方式进行实施和调整。本文所述方案已针对不同λ型干扰素（INFLs）与其受体之间的相互作用研究进行了优化。

直接LRA能够根据配体浓度对配体-受体结合进行定量，从而得到结合曲线。通过使用适当的配体-受体相互作用模型，可进一步分析数据以估算解离常数（K_D）。

在本方案中，采用常用的Hill方程对配体-受体结合进行建模。尽管其他方法（如表面等离子共振技术^2,3）可用于测定两种蛋白质之间的结合亲和力，但该技术通常耗时耗力、成本高昂，且需要特殊的实验设备。

竞争性配体-受体结合分析（LRA）可用于筛选抑制性肽：通过测定不同肽浓度下的配体-受体结合量，获得描述肽抑制效应的剂量-反应曲线。进一步分析数据可估算阻断肽的半数最大抑制浓度（IC₅₀）。

两种ELISA方案均易于使用，并可适用于广泛的研究问题。任何类型的重组蛋白均可用于可靠且快速地确定相互作用区域。此外，可通过使用阻断肽的竞争性LRA来确定配体与受体的关键相互作用位点，这些阻断肽被设计为模拟配体或受体。如果阻断肽显示出高效且特异性的抑制作用，则表明该肽占据了配体的关键相互作用位点（当肽模拟受体时）或受体的关键相互作用位点（当肽模拟配体时）。

第一个方案描述了K_D 不同INFLs及其受体α亚基的值测定 即， 白细胞介素-28受体（IL28RA）的直接LRA检测方法。接下来，第二种方案展示了如何测定一段由20个氨基酸组成的肽段抑制INFL-IL28RA相互作用的能力。该肽段设计用于在干扰素λ（IFNLs）的受体结合位点与其竞争结合，从而实现对这一相互作用的分子层面理解。此外，该肽段还可用于阻断IL28RA的功能 体外 确定对下游信号传导效应影响的实验⁴.

方案

1. 试剂配制

1. 配制碳酸盐包被缓冲液：将 0.36 g Na₂CO₃ 和 0.84 g NaHCO₃ 溶解于 100 ml 蒸馏水中；使用真空驱动的 0.22 µm 聚醚砜（PES）膜滤器对缓冲液进行无菌过滤，并在室温下保存备用。
2. 通过在磷酸盐缓冲液（PBS）中加入 0.05% v/v Tween 20 配制洗涤液。
3. 在 PBS 溶液中配制 5% 牛血清白蛋白（BSA）（封闭液），方法是将 5 g BSA（≥98%）溶解于 100 ml PBS 中，并在 4 °C 下保存。
4. 重组受体、配体及阻断肽
   1. 根据生产商说明书，重悬重组人白细胞介素受体α亚基（IL28RA）以及带 His 标签的重组人干扰素配体（IFNL1-3），并在 -80°C 下保存。合成阻断肽，并按先前所述方法使用⁴。使用 PBS 配制不同浓度的配体和肽，用于后续检测。
5. 配制一抗：将 6x His 小鼠单克隆抗体用含 0.1% BSA 的 PBS 按 1:1,000 稀释。配制二抗：将辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L）用含 0.1% BSA 的 PBS 按 1:10,000 稀释。
6. 根据生产商说明书，将 TMB 试剂 A 和试剂 B 混合配制 TMB 溶液。
7. 通过将 5 N 硫酸（H₂SO₄）加入蒸馏水中配制终止液，并在室温下保存。

2. 酶联免疫吸附测定（ELISA）

注意：直接配体-受体相互作用 ELISA（直接 LRA，图 1）可用于测定配体-受体解离常数（K_D），以评估配体与受体之间的结合亲和力。竞争性配体-受体相互作用 ELISA（竞争性 LRA，图 2）可用于筛选能够干扰配体与受体相互作用的多肽（及其他阻断化合物）。此前发表的基本方案⁵已进一步优化。
注意：在两种 ELISA 方法中，每一步向 96 孔板的孔中添加溶液时，均应使用多通道移液器。在倾倒溶液或洗涤步骤中，可直接将液体弃入水槽。

1. 直接配体-受体相互作用检测（direct LRA）
   注意：有关工作流程的示意图（见 图1).
   1. 用重组受体包被培养板
      1. 将重组受体用碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为100 ng/µl。使用多通道移液器将100 µl稀释后的受体溶液（浓度为100 ng/µl）加入96孔微孔板的各孔中，以包被固定浓度的受体。避免使用板的外周孔，以防止边缘效应。用盖子封板后，于4 °C过夜孵育。
   2. 封闭与配体添加
      1. 次日，将包被液倾斜倒出，用洗涤液（PBS + 0.05% v/v Tween 20）洗涤平板3次。
      2. 使用多通道移液器向包被好的酶标板每孔加入200 µl 5% BSA溶液，封闭游离的受体结合位点，室温孵育2小时。
      3. 弃去封闭液（参见步骤 2.1.2.1），用洗涤液洗板 3 次。
      4. 制备不同浓度的重组 His 标签配体（例如， 8 µg/ml、4 µg/ml、2 µg/ml、1 µg/ml、0.5 µg/ml、0.25 µg/ml、0.125 µg/ml、0.063 µg/ml、0.031 µg/ml、0.0 µg/ml）的PBS溶液。空白孔中仅加入PBS。
      5. 将每种配体浓度各100 µl加入孔中，每个浓度设复孔，于室温孵育2小时，使受体与配体相互作用。
   3. 抗体孵育
      1. 孵育配体后，用洗涤液洗涤平板3次。
      2. 向每个孔中加入100 µl一抗（抗His小鼠单克隆抗体溶液，1:1,000稀释）。
      3. 室温孵育 2 小时；孵育结束后，弃去抗体溶液（参见步骤 2.1.2.1），用洗涤液洗涤 3 次。
      4. 每孔加入 100 µl HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG 二抗溶液（1:10,000）。室温孵育 45 分钟。
      5. 弃去抗体溶液（参见步骤 2.1.2.1），用洗涤液洗涤平板 3 次。
   4. 底物添加与显色反应
      1. 将TMB底物溶液恢复至室温，并按1:1比例配制TMB底物溶液A和B。每孔加入100 µl新鲜配制的底物溶液，室温避光孵育15–30分钟。待显色充分后，每孔加入50 µl终止液。
   5. 读取酶标板与数据分析
      注意：本方案基于信号来源于特异性结合的假设。可能需要评估非特异性结合对信号的贡献，但此项内容不在本方案的范围之内。
      1. 在450 nm处直接读取吸光度（光密度，OD）值。
      2. 从测得的OD值中减去背景信号并进行归一化处理。将所有配体浓度值转换为以10为底的对数尺度（log）₁₀).
      3. 将经归一化和背景校正的吸光度值（Y轴，对应受体结合位点的占据比例）对配体浓度的对数（X轴，log）作图₁₀ 比例尺）。
      4. 为了估算 K_D 值，将数据拟合到以下形式的希尔方程：
         
         注意：此处 Y 表示受体结合位点被占据的比例，Y_最大值 最大结合量；[L] 表示游离配体的浓度和希尔系数。如果配体只有一个结合位点，则希尔系数为 n = 1。对于具有多个配体结合位点的系统，当 n > 1 时，结合表现出正协同性 >1，若 n < 1，则为负协同性<1，当 n = 1 时无协同性。微观解离常数称为，对应于半最大效应浓度 EC₅₀⁶表观解离常数为 K_d = (K_D)ⁿ在最简单的情况下（n = 1），解离常数对应于一半受体结合位点被配体占据时的配体浓度，此时K_d = K_D该模型假定在平衡条件下遵循质量作用定律的结合反应，且仅有少量加入的配体与受体结合。 即， [L] >> [RL]

图 1. 直接配体-受体相互作用检测法（直接 LRA）。 直接 LRA 的逐步操作流程。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 竞争性配体-受体相互作用实验（竞争性 LRA）
   注意：实验流程示意图参见图2。竞争性 LRA 的操作步骤与直接 LRA 相同（包被酶标板、抗体孵育、显色），但在配体和多肽的添加步骤中存在关键差异。本实验必须设置适当的阴性对照。在先前的一项筛选研究中⁴，错序阻断多肽未表现出拮抗效应。
   1. 阻断 — 配体与阻断多肽的添加
      1. 次日，移除包被液并洗涤酶标板（参见 2.1.2.1）。
      2. 向每孔加入 200 µl 5% BSA 溶液以封闭酶标板，并在室温下孵育 2 小时。
      3. 在 PBS 中将重组 His 标签配体（IFNL1-3）配制成固定浓度（2×–20 ng/ml）。
      4. 将阻断多肽（参见表3）用 PBS 配制成不同浓度（范围从 10 nM 至 100 µM），以确保获得剂量-反应曲线。
         注意：此步骤可为后续确定阻断多肽的 IC₅₀ 值提供依据。在对照孔中仅加入固定浓度的配体而不加多肽，以获得最大结合值（100%）。在空白孔中仅加入 PBS，不加配体或多肽。
      5. 向各孔中分别加入 50 µl 配体（IFNL1-3）和 50 µl 不同浓度的多肽，每组设复孔。
      6. 在室温下孵育 2 小时。
   2. 读板与数据分析
      注意：本方案基于所测信号来源于特异性结合的假设。可能需要评估非特异性结合对信号的贡献，但该内容不在本方案范围内。
      1. 直接在 450 nm 处读取吸光度（光密度，OD）。
      2. 从测得的 OD 值中减去背景信号并进行归一化处理。将所有多肽浓度值转换为以 10 为底的对数形式（log₁₀）。
      3. 以归一化并扣除背景后的 OD 值为纵坐标（Y 轴，代表受体结合位点被占据的比例），以多肽浓度的对数值为横坐标（X 轴，log₁₀ 标度），绘制曲线。
      4. 为估算 IC₅₀ 值，将数据拟合至以下方程：
         
         注意：其中 [P] 为多肽浓度，h 为 Hill 斜率。Hill 斜率描述剂量-反应曲线的陡峭程度。IC₅₀ 表示配体与受体结合被抑制 50% 时的抑制剂浓度。

图 2. 竞争性配体-受体相互作用检测（竞争性 LRA）。 竞争性 LRA 的逐步操作流程。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

通过直接配体结合分析法（LRA）测定了INFL1-3与其受体α亚基IL28RA之间的解离常数。结果如图3所示：结合位点的占有率随相应干扰素（IFN）浓度的对数值变化而变化。数据的Scatchard图显示在右下角。结果表明，直接LRA可获得一条结合曲线，该曲线可进一步分析以估算K_D值。K_D值通过将数据拟合至Hill方程（公式1）而确定。

IFNL1 的结合亲和力最高，其次是 IFNL2 和 IFNL3。Hill 系数 n >1 表明，在初始配体-受体相互作用之后，对后续配体的亲和力增强（见讨论部分）。估计的解离常数和 Hill 系数总结于表 1中。

采用竞争性LRA定量分析阻断肽对IFNL1-3与IL28RA相互作用的...

讨论

ELISA 是许多实验室常用的标准且成熟的方法。我们对先前发表的方法^5,7进行了进一步的改进和优化。本演示的逐步操作方案展示了如何以简便的方式测定配体-受体相互作用的K_D值。此外，还可测定干扰配体-受体相互作用的阻断肽的IC50值。

主要优势包括操作快速、试剂制备简便以及操作方式熟悉，因为大多数研究人员此前都使用过ELISA方案。直接LRA方案具有高度灵活性，可适用于检测多种蛋白质-蛋白质相互作用。应使用带有His6标签或其他标签的重组蛋白作为与固定化配体结合的结合伴侣。竞争性LRA可用作筛选工具，用于（i）确定阻断性化合物（如多肽、抗体或小分子）的抑制潜力，以及（ii）通过使用模拟受体或配体的阻断性多肽，确定关键的相互作用位点。

阴性对照对于正确解读所展示的实验至关重要。在之前的一项筛选研究⁴中，所用阻断肽的随机序列未显示出拮抗作用。然而，其他一些肽段在随机化后仍表现出阻断能力，这可能是由于非特异性的静电相互作用所致。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp)	Thermo Scientific	442404	ELISA 板
碳酸钠 (Na2CO3)	Merck	497-19-8	用于 ELISA 板包被缓冲液
碳酸氢钠(NaHCO3)	Merck	144-55-8	用于 ELISA 板包被缓冲液
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma	A7030-100G	用于封闭的 PBS 中 5% BSA
rhIL-28Rα/IFNλR1	R&D systems	5260-MR	重组人白细胞介素-28 受体 α
rhIL-29/IFNλ1	R&D systems	1598-IL/CF	重组人白细胞介素-29/无载体蛋白/C端10-His标签
rhIL-28A/IFNλ2	R&D systems	1587-IL/CF	重组人白细胞介素-28A/无载体蛋白/C端6-His标签
rhIL-28B/IFNλ3	R&D systems	5259-IL/CF	重组人白细胞介素-28B/无载体蛋白/C端6-His标签
6x His 单克隆抗体（小鼠）	Clontech	631212	用于捕获带 His 标签配体的一抗
山羊抗小鼠 IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	115-035-166	辣根过氧化物酶标记的二抗
BDoptEIA TMB 试剂盒	BD Biosciences	555214	ELISA - TMB 底物溶液
硫酸 (H2SO4)	Fulka	84720	5 N H2SO4（酶反应终止液）
Synergy/H1 - 微孔板读数仪	BioTeK		ELISA 板读数仪