我们提供了一种详细的实验方案，利用基因编码的BAS FRET传感器在活细胞中研究胆汁酸动态。该胆汁酸传感器是一种独特的工具，可用于在多种细胞类型中研究胆汁酸转运及其调控以及FXR的激活。
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摘要
摘要
荧光共振能量转移（FRET）已成为监测单个细胞中蛋白质折叠、相互作用和定位的有力工具。基于FRET原理的生物传感器实现了在活细胞中以高时间和空间分辨率实时可视化亚细胞信号事件。本文介绍了基因编码的胆汁酸传感器（BAS）的应用，该传感器由两个荧光团与法尼醇X受体配体结合域（FXR-LBD）融合而成，从而形成一种可被多种胆汁酸及其他（合成）FXR配体激活的胆汁酸传感器。该传感器可靶向至不同的细胞区室，包括细胞核（NucleoBAS）和细胞质（CytoBAS），以实现对局部胆汁酸浓度的测量。该方法无需使用荧光标记或放射性核素，即可快速、简便地定量细胞内胆汁酸的流入、流出以及内源性胆汁酸的亚细胞分布。此外，BAS FRET传感器还可用于监测FXR配体的结合情况。最后，我们展示了该FRET生物传感器可与其他光谱不同的荧光团成像相结合，从而在同一细胞中联合分析细胞内胆汁酸动态变化与i）目标蛋白的定位和/或丰度，或ii）细胞内信号传导过程。
引言
荧光共振能量转移（Förster Resonance Energy Transfer, FRET）被广泛用于以高时间和空间分辨率深入理解活细胞中的细胞功能1。在FRET过程中，激发态的供体荧光团的能量会转移至受体荧光团。FRET效率高度依赖于供体与受体荧光团之间的距离及其相对取向，因此可灵敏地反映影响这两个荧光团的构象变化。该现象被用于构建基于FRET的生物传感器，以实现对小分子的成像。其浓度变化可通过受体与供体荧光团发射光强度比值的升高或降低进行监测2。例如，基于FRET的钙离子生物传感器可实现对活细胞内游离钙离子浓度的快速且稳定的检测3。基于FRET的生物传感器其他优势还包括可在单个活细胞中进行成像、具有非侵入性、并可靶向不同类型的细胞及细胞器4。
细胞内胆汁酸动态的许多方面目前仍知之甚少。例如，关于结合型与非结合型胆汁酸转运调控机制的研究仍十分有限。现有的监测该转运过程的技术主要依赖基于荧光素酶的报告系统、放射性标记的胆汁酸或荧光标记的胆汁酸类似物。其中，后者需要对胆汁酸进行化学修饰，可能影响其原有性质；基于荧光素酶的报告系统则时间分辨率较差。此外，这些技术通常导致样本损耗，且不适用于单细胞成像。因此，若能采用基于FRET生物传感器的方法实现活体单细胞水平的转运活性成像将具有显著优势，尤其是该方法具备比例检测（ratiometric detection）的优点5,6。尽管CFP/YFP变体是最常用的FRET配对组合，但近年来利用携带自缔合诱导突变的mOrange和mCherry所开发的新策略，已拓展了FRET工具箱，催生了包括红移胆汁酸传感器在内的多种新型传感器7。
我们先前构建了一种基因编码的FRET胆汁酸传感器（BAS），该传感器由供体荧光蛋白（cerulean）和受体荧光蛋白（citrine）组成，二者与法尼醇X受体（FXR）的配体结合结构域（FXR-LBD）以及一段含有LXXLL基序的肽段融合8。该肽段以胆汁酸依赖的方式与FXR-LBD结合。当FXR被激活时，由于发生构象变化，citrine与cerulean之间的距离会发生改变。在哺乳动物细胞系中，FXR激活会导致citrine/cerulean比值显著升高，而纯化的传感器则表现出相反的趋势，即FXR激活后FRET比值下降。该传感器（CytoBAS）可用于监测细胞质中胆汁酸的动态变化。通过在羧基末端添加亚细胞定位基序，可将BAS构建体靶向定位于细胞核（NucleoBAS）和过氧化物酶体（PeroxiBAS），从而实现对不同细胞区室中胆汁酸浓度的测量。尽管添加过氧化物酶体靶向基序并未影响其对胆汁酸的响应能力，但细胞可渗透的FXR配体并未引起过氧化物酶体内PeroxiBAS的任何FRET信号变化8。由于这一差异的原因尚不明确，本实验方案主要聚焦于CytoBAS和NucleoBAS。
最近在表达肝胆汁酸转运蛋白Na+/牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）和有机溶质转运蛋白α/β（OSTαβ）的细胞中验证了这种基因编码的FRET传感器的应用8。NTCP是肝脏胆汁酸主要的摄入转运蛋白，而OSTαβ是一种位于肠上皮基底侧的胆汁酸转运蛋白，可根据电化学梯度作为摄入或外排转运蛋白发挥作用9,10。最新数据显示，在NTCP和/或OSTαβ介导胆汁酸转运后，可观察到由配体-FXR-LBD相互作用引起的FRET比值显著且快速的变化。
本文详细描述了用于测量FRET的方法，包括共聚焦显微镜分析和荧光激活细胞分选（FACS）的实验方案，重点说明了关键步骤，讨论了可能遇到的问题，并介绍了替代方法。利用这种基因编码的FRET传感器，可在活细胞中直接定量并监测胆汁酸与FXR-LBD的相互作用，为实时观察胆汁酸的转运与动态变化提供了一种快速而简便的方法。编码CytoBAS和NucleoBAS的哺乳动物表达质粒可商业获取。因此，该生物传感器有望进一步促进对胆汁酸转运蛋白或FXR激活化合物的研究，加深对胆汁酸生物学及其信号通路的理解。
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方案
1. 瞬时转染
注意：CytoBAS 和 NucleoBAS（参见材料表）已在多种细胞类型中成功使用（U2OS、Huh7、HepG2、H69、MDCK 和 HEK293T 细胞）。使用该传感器的主要要求是其必须在细胞内表达，因此编码该传感器的 DNA 需进入细胞。
- 从一个80%汇合度的25 cm2 培养瓶中收集细胞。将细胞悬浮于适合特定细胞系的完全培养基中（U2OS和Huh7细胞使用含10% FBS、1% L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素的培养基）。
- 以所需密度将细胞接种至无菌的8孔腔载玻片（0.8 cm2）中。实验当天细胞汇合度应达到亚汇合状态（60–80%），但此条件并非必需。
- 每孔加入完全培养基至终体积400 µl。静置培养24小时，使细胞贴壁。
- 在无菌离心管中配制转染混合液：加入0.5 µg NucleoBAS或CytoBAS DNA至100 µl无血清/抗生素的培养基中，充分涡旋混匀。随后加入转染试剂，并通过涡旋混合。转染试剂的选择取决于细胞类型，高效试剂需根据细胞种类优化，可能需要预先测试。
- 例如，可使用2.5 µl 1 mg/ml聚乙烯亚胺（PEI），室温孵育DNA/PEI混合物15分钟。
- 将转染混合液以滴状加入细胞中，并用手轻轻晃动培养板以混匀。对于约9.6 cm2 的孔，每孔加入100 µl混合液；对于瞬时转染的单个成像腔室，使用10 µl转染混合液。
注意：转染后24–48小时，细胞将表达胆酸传感器，可用于后续实验。
2. 稳定转染
- 从汇合度为80%的25 cm²培养瓶中收集细胞2 离心管中。用适合特定细胞系的完全培养基（U2OS和Huh7细胞使用含10%胎牛血清、1% L-谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素的培养基）重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至每毫升150,000个细胞，每孔加入约300,000个细胞至6孔培养板中（终体积2 ml）。
- 让细胞贴壁培养24小时。
- 在无菌离心管中配制转染混合物，加入 0.5 µg CytoBAS 或 NucleoBAS DNA（详见 材料表) 加入100 µl培养基（无血清/抗生素），充分涡旋混匀。加入转染试剂，再次涡旋混匀。
- 例如，使用2.5 µl的1 mg/ml聚乙烯亚胺（PEI），将DNA/PEI混合物在室温下孵育15分钟。
- 将100 µl转染混合物以滴加方式加入细胞中，用手轻轻摇动培养板混匀。在构建稳定细胞系时，务必设置未转染的对照组。
- 在 37 °C、5% CO₂ 条件下过夜培养细胞2.
- 根据制造商说明书进行细胞消化（将细胞在37 °C下与1.5 ml预热的胰蛋白酶共同孵育，每25 cm²培养面积）2 细胞培养）在室温下以 250 × g 离心沉淀 孵育5分钟。移除上清液，将细胞重悬于13 ml完全培养基中。将细胞分种至多个直径10 cm的培养皿中：0.5 ml（低密度）、1.5 ml（中密度）和4.5 ml（高密度）。对剩余的6.5 ml细胞悬液进行同样操作。
- 加入培养基至终体积为10 ml。对于U2OS细胞，使用800 µg/ml G418筛选含有新霉素抗性盒的质粒（如CytoBAS和NucleoBAS构建体）转染后的阳性细胞。该浓度因细胞类型而异，可通过筛选未转染细胞在2至10天内完全死亡的最低抗生素（G418）浓度来确定（U2OS细胞为800 µg/ml G418）。
- 每72小时更换一次含有适当抗生素（G418）的新鲜培养基，直至未转染的细胞全部死亡。
- 在显微镜下使用20倍物镜观察培养板，筛选阳性菌落（可使用大多数用于绿色、青色或黄色荧光的滤光片组来监测荧光）。
- 用记号笔在培养皿外底部标记那些与其他菌落分离的阳性菌落。
- 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤平板两次，并吸去液体。取约15个无菌克隆环，将其浸入无菌硅胶中。轻轻按压使克隆环固定在选定菌落周围，确保每个克隆环内仅包含一个菌落。
- 用移液器将20 µl预热的胰蛋白酶（1x，0.25%）加入克隆环中，于37 °C孵育，直至大多数细胞变圆（在显微镜下观察）。
- 在克隆环中加入150 µl含血清和适当抗生素的培养基（U2OS和Huh7细胞使用含10% FBS和800 µg/ml G418的培养基），用移液器吹打数次以重悬细胞，随后转移至96孔板。4–24小时后更换培养基，并在接下来的几天中于37 °C、5% CO₂条件下培养至细胞融合2用于U2OS和Huh7细胞。
- 每隔3至4天更换含抗生素的培养基。当细胞生长至融合状态时，将其转移至更大的孔板中。重复此步骤，直至培养的细胞量足以进行实验。同时冻存部分细胞作为备份。冻存液的成分为20% FBS和20% DMSO，溶于不含添加剂的培养基（DMEM）中。
注意：此时细胞系已为单克隆，可稳定表达胆汁酸传感器。维持该稳定细胞系的表达仅需半浓度的抗生素G418（400 µg/ml）。
3. 慢病毒转导
注意：某些细胞系使用聚乙烯亚胺（PEI）等传统方法转染较为困难。病毒转导细胞是基因递送和稳定外源基因表达的一种高效替代方法。
- 从汇合度为80%的25 cm²培养瓶中收集细胞2 培养瓶。用适合特定细胞系的完全培养基（U2OS和Huh7细胞使用含10% FBS、1% L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素的培养基）稀释细胞，每孔加入约200,000个细胞至6孔培养板中。
- 每孔加入培养基至终体积为2 ml，孵育24小时使细胞贴壁。
- 使用含有10 µg/ml二乙基氨基乙基（DEAE）-葡聚糖或其他慢病毒转导增强剂的完全培养基将细胞与500 µl CytoBAS慢病毒悬液（可应要求提供）共同孵育4–6小时，总体积补至1 ml。务必设置未转导的对照细胞孔。
- 吸除培养基，加入2 ml含目标抗生素（500 µg/ml潮霉素）的完全培养基。使用可使细胞获得潮霉素抗性的慢病毒载体进行CytoBAS转导。在目标条件下培养细胞。
- 每3天更换含抗生素（500 µg/ml 潮霉素）的培养基，并在细胞融合度达到80%时进行传代，直至所有阴性对照细胞死亡（大多数细胞系约需1-2周）。此时，该细胞系已视为稳定表达胆汁酸传感器。
- 或者，在病毒转导后1至3天内使用细胞进行实验。由于可能存在活病毒，因此需要在具备相应安全级别的实验室内使用FRET检测设备。
- 或者，为了快速分离稳定细胞系，可进行荧光激活细胞分选（FACS）。
- 从汇合度为100%的160 cm²培养皿中收集细胞2 烧瓶
- 用 Leibovitz 培养基（L-15 培养基）稀释细胞 <5% 血清至最高浓度 5 x 106 每毫升细胞数
- 为收集分选后的细胞，将FACS管中加入1 ml收集培养基（L-15培养基 + 1.5% 青霉素/链霉素，1% L-谷氨酰胺和20% 血清）。
- 使用405 nm激光激发，按黄色荧光蛋白（citrine，520-580 nm）或青色荧光蛋白（cerulean，450-520 nm）对细胞进行分选。
- 在分选约 500,000 个细胞后，将细胞离心（5 分钟，250 × g），弃上清，用 5 ml 正常完全培养基（含 10% FBS，U2OS 和 Huh7 CytoBAS 细胞另加 250 µg/ml Hygromycin）重悬，接种至 T25 培养瓶中。在适宜条件下（37 °C，5% CO₂）培养细胞。2 用于U2OS和Huh7细胞。
4. 胆汁酸传感器的活细胞成像
注意：含有胆汁酸转运蛋白的细胞可在含1-10%活性炭过滤血清的培养基中培养，该处理可去除疏水性化合物。普通血清常含有胆汁酸，可能导致细胞内胆汁酸蓄积并使胆汁酸传感器饱和。
- 使用共聚焦显微镜进行FRET测量
- 将稳定或瞬时表达传感器的细胞以所需密度接种于无菌的8孔盖玻片底培养板（0.8 cm2）中。使用活性炭过滤血清的完全培养基培养细胞，使实验当天细胞融合度达到约60–70%。
- 用200 µl 1× PBS或Leibovitz's L-15培养基洗涤培养板中的贴壁细胞一次。
- 吸除液体，加入300 µl Leibovitz's L-15培养基，以避免需要CO2控制。
注意：也可使用不含酚红的DMEM，但需维持CO2缓冲条件。胆汁酸传感器对（某些）pH值敏感，因此在数据采集期间应尽量保持pH恒定。 - 将共聚焦成像实验中使用的化合物同样用L-15培养基稀释。考虑到成像过程中需向各孔中加入相对大量的液体（50–100 µl）以确保样品快速混合，因此应配制3–5倍浓度的储备液。
- 启动配备37 °C孵育腔的共聚焦显微镜成像软件，并打开405 nm紫激光。在物镜上滴加一滴浸油，将8孔板置于其上。进行单细胞FRET成像时，使用63倍油镜。该传感器在室温下也可成功使用，但细胞行为可能发生变化。
- 正确设置共聚焦显微镜参数。
- 设置采集模式：xyt（单焦平面时间序列成像）。
- 以20秒间隔采集图像，以便在不中断实验的情况下于采集间隙加入化合物。
- 设置发射光检测的光谱范围：Cerulean：450–520 nm；Citrine：520–580 nm。
- 使用透射光聚焦于单层细胞。开始成像并更精确地调整z轴位置。调节各通道的增益和偏移，以区分信号与背景，同时确保目标细胞中所有像素的信号远低于饱和水平。
- 绘制圆形以定义感兴趣区域（ROI）。选择荧光强度相似的细胞。避免选择在大小和形状上明显偏离平均水平的细胞。应尽可能缩短细胞暴露于光照的时间，以最小化传感器的光漂白。建议将ROI绘制在距离细胞边缘较远的位置。该区域对因焦平面漂移（细胞在z方向移动）引起的荧光强度变化最为敏感，从而更难监测实验过程中荧光比值的变化。
- 开始使用共聚焦显微镜进行测量。等待Cerulean和Citrine荧光信号稳定。
- 在测量过程中选定的时间点加入50–100 µl胆汁酸或其他化合物。加入相对大量的液体（最终体积的五分之一至三分之一）是必要的，以确保液体在10秒内充分混合，而无需振荡或反复吹打。确保移液枪头不接触8孔板边缘，并缓慢加入液体，以免细胞失焦。在达到平台期之前不得加入新的化合物。此过程约需200秒。
- 每次实验结束时加入100 µl GW4064（终浓度5–10 µM，为传感器饱和剂量），并等待传感器荧光信号稳定。
- 保存实验数据，并将其导出为.avi文件。
- 在ImageJ中通过选择“插件 > 图像堆栈 > 堆栈交错”功能打开两个avi文件（通道00为Cerulean；通道01为Citrine）。或者，使用适当的插件（可在http://www.openmicroscopy.org获取）直接在ImageJ中导入共聚焦文件（例如，.lsm或.lif文件），然后进入步骤4.1.14。
- 对于堆栈1：使用通道01（Citrine）。
- 对于堆栈2：使用通道00（Cerulean）。
- 点击“编辑 > 选择 > 添加到管理器”，以打开ROI管理器窗口。勾选“显示全部”复选框。
- 使用椭圆选区工具绘制覆盖特定细胞的若干感兴趣区域（ROI）。同时在无细胞区域或不表达传感器的细胞内部绘制一个圆圈，以确定背景信号。若实验中因焦平面漂移（细胞在z方向移动）或细胞迁移导致荧光强度变化明显，建议将ROI绘制在远离细胞边缘的位置。
- 选择一个细胞。点击“插件 > 比值分析器”。将出现三个窗口：RAW、ratio和Ratio_Profile。RAW窗口显示Citrine荧光强度增加（蓝线）和Cerulean荧光强度降低（红线），表明发生FRET。Ratio窗口显示Citrine/Cerulean比值，该比值随FRET增强而升高。Ratio_Profile窗口显示两个通道测得的荧光强度实际数值。若使用显微镜设备特异性文件（例如，.lsm或.lif而非.avi），通道顺序可能相反。
- 将Ratio_Profile窗口中的数据复制到作为补充资料附带的电子表格中。对所有其他细胞（及背景ROI）重复此操作。
注意：在线电子表格中，所有数据均归一化至预期胆汁酸传感器（BAS）激活达到最大值的条件。由于GW4064是FXR最强效的激活剂，因此与过量GW4064孵育后的荧光比值被设定为1。因此，所有实验均应以加入GW4064作为结束步骤至关重要。这样做的优势在于数据不再依赖于激光强度或检测器增益，从而更便于比较不同日期的实验结果。此外，在电子表格的底部图表中，可使用滑动平均法平滑实验噪声。但在分析动力学数据时，请勿使用此图表，因为滑动平均会同时平滑快速的动力学响应。
- 使用荧光激活细胞分选（FACS）进行FRET测量
- 将FACS实验中使用的所有化合物稀释于无菌FACS摄取缓冲液（0.3 mM EDTA、0.5% BSA、0.01% NaN3和10 mM D-葡萄糖）中。
- 使用含5 mM EDTA的PBS从80%融合度的T-160 cm2细胞培养瓶中收集细胞。在250 × g下离心5分钟。在室温下用5 ml FACS摄取缓冲液洗涤细胞沉淀两次。
- 使用库尔特计数器或计数板对细胞进行计数。
- 将细胞沉淀用FACS摄取缓冲液重悬至浓度为1 × 106 个细胞/ml。反复吹打以形成均匀的单细胞悬液。若细胞难以解聚，分选前应先通过细胞筛过滤，以减少喷嘴堵塞。
- 每管FACS管中加入200 µl细胞悬液，并避光保存。
- 加入所需浓度的化合物（例如，胆汁酸、合成FXR配体、转运体抑制剂）。涡旋混匀。在室温下避光振荡孵育20–30分钟。
- 同时，启动FACS仪器（激光器需要预热时间）。
- 设置流式细胞术实验的门控参数（见图3）：
- 加载约100,000–200,000个转染NucleoBAS或CytoBAS的细胞以确定门控。
- 首先调节FSC和SSC电压，使细胞位于图中央。
- 使用紫激光调节Cerulean（450/40 nm）电压值和Citrine（525/20 nm）电压，确保所有NucleoBAS或CytoBAS阳性细胞均显示在散点图中。
- 设置正确的门控（从P1门至P4门），见图4。
- 使用P1门排除死细胞，通常通过在SSC-A/FSC-A图中选择位于中间的主要细胞群，而死细胞通常位于左下角。
- 在FSC-H/FSC-A窗口中使用P2门从分析中去除双联体。单细胞在图中呈更接近对角线的分布，而双联体则偏离对角线。
- 在Citrine（525/20 nm）/Cerulean（450/40 nm）窗口中使用P3门选择NucleoBAS/CytoBAS阳性细胞，通过圈选Citrine和Cerulean高表达的细胞群（位于图右上角对角线区域）。
- 在细胞群的左上方绘制P4门，尽可能靠近细胞群边缘，并确保落入该门的细胞不超过5%。
- 加载部分未转染细胞（不表达CytoBAS或NucleoBAS）以确定自发荧光。未转染细胞群体不应位于P3门内。必要时调整P3门以排除自发荧光细胞。
- 将样品管放入FACS前进行涡旋混匀。对每个样品，在P3门中至少检测10,000个细胞。
注意：群体层级窗口显示每个门所显示的事件数量及其相对于父门的百分比。在P4门中，“相对于父门的百分比”表示Citrine/Cerulean比值升高的细胞占所有NucleoBAS阳性细胞的百分比。
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结果
本研究中展示的FRET-BAS传感器基于法尼醇X受体（FXR）的配体结合结构域（LBD-FXR），其上连接有两种荧光蛋白（citrine和cerulean）以及一个LXXLL基序。该传感器可用于在活细胞中以高时空分辨率研究胆汁酸的转运过程（图1A）。通过对citrine和cerulean引入突变，促进分子内复合物的形成（图1B）。胆汁酸及其他FXR配体结合至FXR后，通过构象变化改变citrine与cerulean之间的距离。在活体哺乳动物细胞中，这导致FRET效率升高（citrine信号增强，cerulean信号减弱）（图1C、图1D）。在利用共聚焦显微镜进行的活细胞定量强度型FRET实验中观察到，表达缺乏胆汁酸转运蛋白的NucleoBAS的U2OS细胞经牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA，30 µM）处理后未出现FRET变化，而经GW4064（5 µM）处理后，其平均citrine/cerulean比值显著升高（图1C
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讨论
本文介绍了一种新型遗传编码胆汁酸传感器的详细使用方案，该传感器能够监测活细胞中胆汁酸转运的时空动态。该生物传感器由青色荧光蛋白（cerulean）和黄色荧光蛋白（citrine）组成，二者与FXR-LBD融合，从而形成基于荧光共振能量转移（FRET）的胆汁酸传感器（BAS）。
当具备细胞培养以及FACS或（共聚焦）显微镜操作的基本经验时，胆汁酸传感器的使用相对简单且便捷。然而，某些方面可能需要进行故障排查。当将胆汁酸传感器与胆汁酸转运蛋白联合使用时，建议使用经活性炭过滤处理的血清培养细胞。活性炭可通过吸附作用进一步降低血清中的胆汁酸水平。特别是在表达诸如NTCP等摄取转运蛋白的情况下，这一点至关重要，可防止在培养过程中传感器被饱和，因为这是实验中传感器灵敏度降低最常见的原因。因此，研究人员构建了另一种传感器（NucleoBAS N354K/I372V），其含有可改变胆汁酸敏感性的突变，从而扩大了动态检测范围8。为了判断传感器是否已经饱和，可将实验细胞中的黄荧光蛋白/青色荧光蛋白（citrine/cerulean）比值与未表达任何胆汁酸转运蛋白的对照细胞中的比值...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了欧洲研究理事会启动基金（ERC-2011-StG 280255 和 ERC-2013-StG 337479）以及荷兰健康研究与发展组织（Vidi 91713319）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM） | Lonza | BE12-614F | 高糖，不含L-谷氨酰胺 |
| 青霉素-链霉素（pen/strep） | Lonza | 17-602E | |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | Lonza | 17-605E | |
| 胎牛血清（FBS） | Invitrogen | 102-70 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（10倍浓度） | Lonza | CC-5012 | |
| T-25 细胞培养瓶 | VWR international | 392-0253 | 层粘连蛋白包被 |
| T-175 细胞培养瓶 | VWR international | 392-0238 | 层粘连蛋白包被 |
| 6孔板 | VWR international | 734-0229 | 聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白包被 |
| 10 cm 培养皿 | VWR international | 392-0243 | 层粘连蛋白包被 |
| 二乙氨基乙基（DEAE）-葡聚糖 | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| 聚乙烯亚胺（PEI） | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418（遗传霉素）50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| 潮霉素B，50 mg/ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| 克隆环（6 × 8 mm） | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 莱博维茨培养基 | Invitrogen | 21083-027 | 不含酚红 |
| 聚苯乙烯圆底管（5 ml），流式管 | Falcon BD | 352008 | 无盖，非无菌 |
| Falcon 2,063 管（5 ml） | Falcon BD | 352063 | snap cap，无菌 |
| Nunc Lab-Tek 8孔盖玻片 | Thermo scientific | 155409 | 无菌 |
| 活性炭处理的FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| 其他化学品 | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
参考文献
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