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使用优化方法制备急性脑切片 N甲基-D-葡糖胺保护回收法

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DOI：

10.3791/53825

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2018年2月26日

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1Cell Types Program, Allen Institute for Brain Science, 2The Ben and Catherine Ivy Center for Advanced Brain Tumor Treatment, Swedish Neuroscience Institute

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案演示了一种优化方法的实施 NN-甲基-D-葡萄糖胺（NMDG）保护性复苏法在脑片制备中的应用。该方法采用单一培养基配方，可稳定地从任何年龄的动物获取健康的脑组织切片，适用于多种实验研究。

摘要

本方案是脑切片制备中 N-甲基-D-葡萄糖胺（NMDG）保护性复苏方法的实用指南。近年来大量研究已证实，该方法在提高神经元保存效果和整体脑切片活性方面具有显著优势。早期采用者应用该技术，已成功开展多种实验研究，涵盖不同动物年龄、脑区和细胞类型，深入探究了脑功能。本文详细阐述了采用优化的 NMDG 人工脑脊液（aCSF）培养基配方及改进操作流程进行保护性复苏脑切片技术的步骤，以稳定获得适用于膜片钳电生理实验的健康脑切片。通过这一改进方法，在靶向膜片钳记录实验中，吉欧姆封接（gigaohm seal）的形成速度和可靠性得到显著提升，同时保持优异的神经元保存状态，从而促进了高难度实验的实施。文中提供了来自多神经元膜片钳记录实验的代表性结果，用于检测由年轻成年转基因小鼠和成年成人神经外科手术标本获取的新皮层脑切片中的突触连接性。此外，优化后的 NMDG 保护性复苏脑切片方法适用于幼年和成年动物，解决了原始方法的一项局限性。总之，该单一培养基配方和脑切片制备流程可广泛应用于不同物种和年龄段，实现优异的组织活性与保存效果。

引言

急性脑切片制备是神经科学中一种重要的实验模型系统。近半个世纪以来，该平台使得对多种解剖脑区和动物物种的活体脑组织进行动态功能研究成为可能。无论研究目的为生物化学、功能成像、形态学还是电生理学，确保切片组织的最佳完整性和存活能力都至关重要。正因如此，目前最受青睐的仍是具有高度韧性的幼年啮齿类动物脑切片制备（即，对小鼠而言，出生后30天以内）。从成年及衰老动物中获得足够健康的脑切片一直是一项巨大挑战，对大多数研究者而言构成了严重限制，阻碍了对成熟大脑功能结构的深入研究。这一点在膜片钳记录技术中尤为突出，该技术要求细胞形态和功能的高度保存，是表征已鉴定单个神经元内在特性和突触特性的不可或缺手段。在过去数十年中，绝大多数膜片钳电生理学者依赖一种“保护性切割”方法，即使用蔗糖替代的低Na+人工脑脊液（aCSF1）来制备健康脑切片，适用于幼年动物，而在较小程度上也用于年轻成年动物。该方法基于如下假设：在切片过程中，被动的Na+内流及其引发的水分进入和细胞肿胀是导致神经元存活率低下的主要损伤机制，特别是位于表层的神经元，更易因刀片移动造成直接机械损伤。然而，无论采用何种aCSF配方，保护性切割法在制备成年动物脑切片方面仍存在明显不足。

已有研究描述了一种简单而有效的解决方案2,3,4,5,6，称为“保护性复苏”脑片制备法。该方法的原始版本使用以NMDG替代钠离子的aCSF，因为NMDG在多种候选的钠离子替代物（包括蔗糖、甘油、胆碱和Tris）中被证实为最通用且最有效的成分。通过添加HEPES以抵抗脑片水肿并提供更强的pH缓冲能力7，以及加入可拮抗氧化应激有害作用的补充成分，进一步优化了该培养基配方（表1）。经验确定，在成年动物脑组织切片后，立即在低Na+、低Ca2+、高Mg2+的NMDG aCSF中进行初始恢复孵育步骤，对于在广泛的脑区、细胞类型和动物年龄条件下改善神经元的保存效果，既必要又充分3,5,6。

值得注意的是，现在被称为保护性恢复法的技术，其早期形式在文献中已有记载1,8,9,10,11,12,13，尽管早期研究尚未认识或展示成年及衰老动物脑片与膜片钳记录技术的全部潜力。此外，为支持特定实验应用，细微的操作步骤差异仍在不断涌现4,14,15,16大量研究团队的集体工作成果充分验证了该保护性复苏方法在改善组织保存方面的稳健性和可靠性。目前，NMDG保护性复苏方法已被广泛采纳并应用于众多利用成年动物脑片制备的已发表研究中。这些急性脑片研究涵盖了新皮层3,17,18海马体15,19,20,21, 纹状体22,23,24中脑25,26,27,28,29和后脑30,31,32,33,34 区域，以及多种神经递质和神经调质类型，包括谷氨酸能4,30，GABA能18,20,31,35,36多巴胺能24,29,37,38胆碱能14,37,38,39去甲肾上腺素能40，以及5-羟色胺能的27,28 神经传递。该方法也适用于对转基因动物来源的脑片中神经元活动进行光遗传学控制3,39 或在之后 体内 病毒注射17,27,28,40,41,42,43以及功能性 Ca2+ 神经元活动成像2,44,45,46短期可塑性的分析4,47,48 以及多种形式的长时程可塑性16,35,48 已有相关报道。最近一项研究采用NMDG保护性恢复法，结合八通道膜片钳记录配置，对成年成熟小鼠脑切片视觉皮层中的突触连接进行了广泛而系统的探究。49 ——充分展示了该方法的有效性和稳健性。保护性回收方法甚至已成功应用于此前未曾预料的实验场景中，例如在成年动物大脑皮层脑片中实现了对血管系统及周细胞的更佳保存50在1至1.5岁阿尔茨海默病小鼠模型中对移植的中间神经元群体进行膜片钳记录20以及成年脑切片受体运输检测51.

以下方案详细描述了采用优化的NMDG保护性复苏法进行脑片制备的逐步操作流程，以提高急性脑片的存活率。文中讨论了改善神经元保存效果的基本原理，并展示了该方法在年轻成年转基因小鼠脑片以及成熟成年中国人脑神经外科脑片的复杂多神经元膜片钳记录实验中的显著优势。本方案已验证适用于21天至一岁以上的实验小鼠，以及来自成年患者的神经外科人脑组织标本。

方案

涉及转基因小鼠的操作已获得艾伦脑科学研究所机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。本实验使用了雄性和雌性C57BL/6小鼠（体重范围为10-30 g）。部分代表性结果描述了从活体人脑切片中收集的数据。新皮质组织样本是在进行肿瘤切除的神经外科手术期间获得的。为了接触到病变组织，有必要切除覆盖其上的新皮质组织。在所有情况下，均按照瑞典医疗中心机构审查委员会批准的方案，获得了患者同意将其神经外科手术组织用于科研的知情同意。

1. 培养基与试剂的准备（表1）

注意：溶液应使用不含痕量金属及其他杂质的纯化水配制。建议在实验当天新鲜配制溶液，但若需要，未使用的溶液可在 4 °C 保存最多 1 周。上述每种配方配制 1 L 可满足 1–2 次切片操作的需求。所有 aCSF 溶液在使用前必须用碳氧混合气（95% O2/5% CO2）饱和，以确保稳定的 pH 缓冲能力和充分的氧合。所有溶液的 pH 应调节至 7.3–7.4，渗透压应测定并调节至 300–310 mOsmol/kg。

  1. 配制NMDG-HEPES人工脑脊液（aCSF，单位：mM）：92 NMDG、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、30 NaHCO3、20 HEPES、25 葡萄糖、2 硫脲、5 Na-抗坏血酸、3 Na-丙酮酸、0.5 CaCl2·2H2O 和 10 MgSO4·7H2O。用17 mL ± 0.5 mL的5 M盐酸将pH值滴定至7.3–7.4。
    注意：理想情况下，应在加入二价阳离子之前完成该滴定步骤，以避免沉淀；然而，若发生沉淀，在将pH调整至生理范围后可逆转沉淀现象。
  2. 配制HEPES保存用人工脑脊液（aCSF，单位：mM）：92 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、30 NaHCO3、20 HEPES、25 葡萄糖、2 硫脲、5 Na-抗坏血酸、3 Na-丙酮酸、2 CaCl2·2H2O 和 2 MgSO4·7H2O。滴加数滴浓10 N NaOH，将pH值调至7.3–7.4。
  3. 配制记录用人工脑脊液（aCSF，单位：mM）：124 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、24 NaHCO3、12.5 葡萄糖、5 HEPES、2 CaCl2·2H2O 和 2 MgSO4·7H2O。滴加数滴浓10 N NaOH，将pH值调至7.3–7.4。
  4. 配制Na+加标溶液（2 M）：将580 mg NaCl溶解于5 mL新配制的NMDG-HEPES aCSF中。该体积足够一次脑片制备使用。
  5. 配制用于组织包埋的2%琼脂糖。将2 g 1B型琼脂糖（见材料表）溶于100 mL 1× PBS中，微波加热至刚好沸腾。轻轻摇动混匀，然后倒入无菌的10 cm培养皿中，静置使其凝固。将琼脂糖平板置于密封塑料袋中，4 °C保存备用。
  6. 配制注射用麻醉剂工作液。将2.5 g 2,2,2-三溴乙醇与5 mL 2-甲基-2-丁醇混合，然后逐渐溶于200 mL PBS（pH 7.0–7.3）中。使用前用0.22 µm滤器过滤，并避光保存于4 °C。
    注意：关于麻醉剂工作液的有效期及废弃处理程序，请参照相关动物使用委员会的指南与规定。

2. 切片工作站的设置

  1. 使用组织切片机和外科器械设置切片工作站（参见材料表）。为校准切片机，使用快干胶将氧化锆陶瓷切割刀片固定在刀臂上，然后插入样本架，并将刀片前缘与样本架边缘对齐，留出微小间隙，以确保刀片不会刮擦金属表面。
    注意：若刀片边缘未发生物理损伤，可在数周甚至数月内重复使用而无需更换。市面上有多种型号的组织切片机，许多型号在经过优化校准后均可提供优异性能。理想的仪器应具有最小的Z轴偏转，可通过直接测量调节或经验观察实现。
  2. 准备一个250 mL烧杯，加入200 mL NMDG-HEPES aCSF溶液，并置于冰上预冷，同时通过浸入培养液中的气体扩散石持续通入碳合气（carbogen），时间不少于>10分钟。
    注意：该溶液将用于心脏灌注以及切片过程中填充切片机储液槽。
  3. 设置初始脑片恢复室，加入150 mL NMDG-HEPES aCSF（保持持续碳合气通入），并将恢复室置于恒温水浴中，温度维持在32–34 °C。
    注意：建议采用Edwards和Konnerth（1992）52设计的切片恢复室。此类恢复室可使用常见实验器材自制（250 mL烧杯、尼龙网筛、50 mL锥形管、35 mm塑料培养皿）。需特别注意确保切片网筛不附着气泡，尤其是碳合气扩散石持续产生的气泡，这些气泡可能导致脑片上浮并受损。网筛应浸没于液面下约1 cm处。
  4. 准备脑片保存室；建议使用具有多个独立孔井的大容量储液装置（参见材料表）。向储液槽中加入450 mL HEPES aCSF，并在持续通入碳合气条件下升温至室温，待用。
    注意：脑片将在电生理记录前从初始恢复室转移至此保存室进行长期储存。必须始终确保切片网筛无气泡附着。
  5. 准备用于组织包埋的熔融琼脂糖。使用50 mL锥形管的开口端作为模具，从预先制备的琼脂糖平板中切取一块2%琼脂糖。将锥形管盖松松盖上，微波加热10–30秒，直至琼脂糖完全熔化，避免过热。
  6. 将熔融琼脂糖倒入1.5 mL离心管中。使用设定为42 °C并剧烈振荡的恒温混匀仪保持琼脂糖处于熔融状态。需小心操作，防止琼脂糖提前凝固。
  7. 将切片机的辅助冷却块置于冰上进行预冷。

3. 经心灌注

注意：在处理成年动物时，经心脏灌注是一项重要步骤，可通过向脑部灌注低钠（Na+）、低钙/高镁（Ca2+/Mg2+）人工脑脊液（aCSF）实现脑组织的快速冷却并减缓代谢。经心脏灌注还可清除脑血管中的红细胞，从而减少自发荧光，避免对转基因品系中荧光标记细胞群体的观察与定位造成干扰。不建议省略经心脏灌注步骤。

  1. 通过腹腔注射麻醉工作液（250 mg/kg：每10 g体重注射0.2 mL的1.25%麻醉工作液，参见材料表）对小鼠进行深度麻醉。约2–3分钟后，通过检测脚趾夹捏反射判断麻醉深度是否足够。如有必要，追加一定量的麻醉工作液，并在2–3分钟后再次检测脚趾夹捏反射。
  2. 从预冷的250 mL烧杯（最佳温度为2–4 °C，避免使用冰沙状或冻结的溶液）中吸取25 mL充有碳合气体的NMDG-HEPES aCSF，装入30 mL注射器。安装一支25 5/8规格的针头。
  3. 将小鼠仰卧固定，用针固定前肢和后肢以保持稳定。使用装有硬化硅胶的15 cm玻璃培养皿作为基底效果良好。
  4. 使用手术刀在膈肌水平处做侧向切口，打开胸腔。使用精细剪刀剪开两侧肋骨，注意避免损伤心脏和肺组织。
  5. 将肋骨中央部分向后固定，暴露心脏。将30 mL注射器的针头插入左心室，同时用精细剪刀剪开右心房，以使血液从心脏流出。
  6. 用手施加持续压力推动注射器活塞，以约10 mL/min的速度用预冷的NMDG-HEPES aCSF灌注动物。
    注意：若灌注成功，肝脏颜色将由深红色变为浅黄色，有时在操作接近结束时可观察到清亮液体从鼻孔流出。

4. 脑组织解剖与切片

  1. 将动物断头。使用解剖刀切开头部皮肤，暴露颅骨帽。
  2. 使用精细的超剪剪除颅骨帽上方的皮肤，并在颅骨后腹侧基部两侧做小的侧向切口。从颅骨后背侧开始，沿背侧中线向前端方向进行额外的浅层切割，注意不要损伤下方的大脑组织。在嗅球水平处，垂直于中线做最终的“T”形切口。
    注意：必须小心操作，确保不损伤目标脑区。尤其应注意，任何时候均不得对大脑本身施加任何压迫性力量。
  3. 使用圆头镊子从颅骨前端中线处开始夹住颅骨，向后外侧方向剥离。两侧重复此操作，以打开并移除颅骨背侧半部，暴露大脑。轻轻将完整的大脑舀入盛有预冷NMDG-HEPES aCSF的烧杯中。让大脑均匀冷却约1分钟。
  4. 使用大刮铲将大脑从烧杯中取出，置于铺有滤纸的培养皿上。根据所需的切片角度和目标脑区，修剪并修整脑组织。操作应迅速，以避免在处理过程中长时间缺氧。
    注意：可采用多种切片角度。具体的修块方法和切片角度取决于所研究的特定脑区、细胞类型及神经环路。
  5. 使用粘合胶将脑组织块固定在样品托上。将样品托的内芯部分回缩，使脑组织块完全收入其中。将熔化的琼脂糖直接倒入样品托中，直至完全覆盖脑组织块。将预冷的辅助冷却块夹紧在样品托周围约10秒，直至琼脂糖完全凝固。
  6. 将样品托插入切片机的插槽中，并确认其位置对齐。用250 mL烧杯中剩余的预冷且充氧的NMDG-HEPES aCSF填充储液槽，并将气泡石放入储液槽中，持续供氧直至切片完成。
  7. 调节微米计，开始推进包埋在琼脂糖中的脑组织样本。启动切片机，并根据经验将推进速度和振荡频率调节至理想水平。
    注意：两个参数均应设置在较低范围内。为获得最佳效果，刀臂单次行程应耗时约20秒，振荡应产生非常平滑且轻柔的嗡鸣声，不应出现明显的嗡嗡声。
  8. 以300 µm（或其他设定厚度）为增量持续推进并切片，直至目标脑区被完全切完；整个切片过程总时长应少于15分钟。

5. 优化的NMDG保护性恢复步骤

  1. 初始NMDG恢复步骤（关键步骤）：切片完成后，使用截断的塑料巴斯德移液管收集所有切片，并将其转移至已预热（34 °C）的初始恢复室中，该恢复室内含有150 mL NMDG-HEPES aCSF溶液。尽快连续转移所有切片，并在所有切片完全转移至恢复室后立即启动计时器。
  2. 参考表2，根据小鼠年龄确定最佳的Na+梯度添加方案。
    注意：该程序是一种实现Na+在脑片培养室中受控速率重新引入的实用方法，已针对特定脑片培养室的几何结构、储液体积和类型进行优化（见材料表）。
  3. 按照指定时间加入指定体积的Na+添加溶液，执行分步Na+梯度添加程序。将Na+添加溶液直接加入初始恢复室的鼓泡管中，以促进快速混合。
  4. 将所有切片转移至室温维持的HEPES aCSF长期保存室中。在开始膜片钳记录实验前，让切片在HEPES保存室中继续恢复1小时。

6. 膜片钳记录

注意：以下基本操作步骤仅提供一些实际考虑因素，并非旨在作为膜片钳记录的详细方案，详细的方案可参见其他文献53,54。本应用需要配备膜片钳电生理系统。该系统通常包括一台配备红外微分干涉差（IR-DIC）光学装置和荧光照明系统的直立显微镜、膜片钳放大器和数据采集系统、电动显微操作器和显微镜载物台、隔振台、法拉第笼，以及溶液加热和灌流系统。样本记录室和载物台应设计为适用于浸没式脑片记录。对于多神经元膜片钳记录，需要配备多个放大器、探头级装置和高质量显微操作器的系统。此外，为获得最佳效果，强烈推荐系统配备900 nm红外带通滤光片及匹配的光学组件，以确保能够清晰观察位于脑片深度>50 µm处的细胞。正确调节科勒照明对于清晰成像也至关重要。

  1. 配制细胞内电极液（单位：mM）：130 K-葡萄糖酸盐，4 KCl，10 HEPES，0.3 EGTA，10 磷酸肌酸钠2，4 MgATP，0.3 Na2-GTP 和 13.4 生物胞素。用 1 M KOH 调节 pH 至 7.35，并根据需要使用蔗糖将渗透压调节至 285–290 mOsmol/kg。
  2. 使用厚壁硼硅酸盐玻璃毛细管制备膜片钳电极；理想的膜片钳电极应具有相对较短且粗短的锥形，浸入浴液中时电极尖端电阻约为 3–6 MΩ。
  3. 确保银电极丝经过适当的氯化处理，以保证记录的稳定性。通常可通过将银丝末端3-4 mm浸入液体漂白剂中约30分钟，或直至银丝表面变黑来实现。
  4. 使用蠕动泵以3–4 mL/min的流速建立灌流系统。将通入碳氧气体的记录用人工脑脊液（aCSF）循环通过记录室，注意调节进液与出液流速一致，以防止溢出。
  5. 将单个脑切片转移至浸没式记录室中，并使用带有尼龙横线的U形切片固定锚将其固定。先用4倍空气物镜识别目标脑区，然后切换至更高倍率的物镜例如，高数值孔径40X或60X水浸物镜）。
  6. 通过红外微分干涉差显微镜（IR-DIC）观察神经元胞体膜的形态，以判断目标细胞是否适合进行膜片钳记录。选择外观健康的细胞作为记录目标。
    注意：健康的神经元通常具有以下特征：胞体既不收缩也不肿胀，膜边缘对比度柔和，膜表面光滑。此外，大多数健康细胞位于 >切片深度为30 µm，因为浅层神经元的树突过程可能已受损。应避免选择表面皱缩、细胞核明显可见或呈“煎蛋样”，以及膜边缘过暗或对比度过高的神经元。
  7. 用约5 µL细胞内液反向填充记录电极，并将其安装到电极夹持器上。将电极移至脑片上方的记录浴槽中，施加轻微正压以清除尖端可能存在的堵塞物。将电极偏移电压调零，并使用膜测试功能监测尖端电阻。
  8. 将移液管尖端移至目标神经元胞体表面并与其接触，由于轻微的正压，细胞膜表面应形成一个小凹陷。
  9. 一旦观察到膜出现凹陷，立即撤去正压并施加轻柔的负压，以促进封接形成。当移液管电阻增大至 >100 MΩ时，开启钳制指令，将其调至与目标细胞类型预期静息膜电位相匹配的水平（-70 mV 是一个合适的起始点）。
  10. 当尖端电阻达到≥1 gigaohm时，通过短暂施加强烈吸力以破裂膜片电极下方的细胞膜，尝试进入细胞；必要时可使用“zap”功能以促进破膜。
    注意：皮层神经元的电压钳实验建议采用 -70 mV 的保持电位。健康的神经元在整个实验过程中漏电流不应超过 -100 pA，但该值在一定程度上取决于细胞类型。若神经元的静息膜电位去极化程度超过 -50 mV，或接入电阻变化超过 20%，则应将其排除在分析之外。
  11. 获得稳定的全细胞膜片钳记录后，通过重复步骤6.6–6.10，对其他目标神经元进行记录。操作时需注意避免机械干扰，以防丢失首次记录。
    1. 在距离首个神经元100 µm范围内选择额外的神经元，以确保有合理的概率找到突触连接的神经元。
      注意：在某些情况下，预先识别多个候选神经元，并在建立首个膜片钳记录之前，将所有移液管预先加载并定位到各个目标细胞附近，可能会有所帮助。

结果

本节提供了使用优化的NMDG保护性复苏方法进行常规脑片制备和膜片钳电生理实验的代表性结果即，NMDG保护性复苏联合逐步Na+ spike-in 操作）。首先，在实施或未实施优化的 NMDG 保护性复苏方法制备的脑切片中，评估了不同脑区神经元的形态学保存情况（图1）。选择三个月大的成年小鼠进行这些实验，我们使用红外差分干涉相衬（IR-DIC）显微镜根据胞体及近端树突的形态和整体外观来评估神经元的健康状况。请注意，在未采用保护性复苏方法制备的脑切片代表性图像中，大多数神经元呈现皱缩、浓染的形态（所有图像均在切片制备后1–2小时内获取）。这些对照切片在灌流和切片过程中使用NMDG人工脑脊液（aCSF），但最初恢复时置于高Na+含HEPES的aCSF。相比之下，采用优化的NMDG保护性复苏方法制备的脑片所获得的代表性图像显示，神经元形态更佳（表面更光滑、饱满，皱缩更少），适合进行膜片钳记录图1在多个脑区均观察到改善的神经元保存效果，包括新皮层II/III层和V层、下托以及背外侧膝状核（dLGN）。

接下来，将优化的NMDG保护性复苏方法与原始的NMDG保护性复苏方法进行比较（即，不进行逐步的 Na+ 尖峰插入程序）。在膜片钳记录尝试中，形成吉欧姆密封的平均时间显著且大幅度缩短（9.9 秒 vs 33.3 秒，**p <0.005，配对 t-test）当逐步的 Na+ 内参对照程序与NMDG保护性复苏步骤一并应用（图2）。更快且更可靠的膜封接时间显著提高了在年轻成年脑片中进行膜片钳记录的通量。最佳的 Na+ 根据动物年龄进一步调整了spike-in时间表（表 2）并且对所有测试年龄段（3周龄至1岁小鼠）均有益。提供了在加标过程中钠离子浓度逐步升高的变化曲线（图3) 以配合所示的时间表 表 2.

作为艾伦脑科学研究所细胞类型项目（http://celltypes.brain-map.org/）的一部分，目前正在开展一项大规模研究，旨在系统性地表征来自年轻成年小鼠（出生后第40至80天）视觉皮层脑片中单个神经元的固有电生理特性。这些脑片来源于转基因小鼠品系，其遗传定义的神经元群体（皮层层级和细胞类型特异性的Cre驱动品系与Cre依赖性荧光报告基因品系杂交）具有细胞类型特异性的荧光标记表达55。图4展示了在一系列持续1秒的阶梯电流注入（覆盖神经元放电的动态范围）下，从表达小清蛋白（Parvalbumin, Pvalb）的皮层快速放电（fast-spiking, FS）中间神经元（Pvalb-IRES-Cre/Ai14小鼠）记录到的放电模式示例。右侧显示了22个皮层FS中间神经元数据集的F-I曲线。类似的目标性膜片钳记录实验也用于表征来自Rorb-IRES-Cre/Ai14小鼠皮层第IV层的23个表达Rorb的兴奋性神经元（图4）。采用本优化方案，在脑片制备后至少6至8小时内，可常规且可靠地靶向记录包括FS中间神经元和锥体神经元在内的多种健康神经元类型，覆盖皮层不同区域和层级。

除了测量神经元的固有特性外，还对视觉皮层微环路中多种特定类型神经元之间的突触连接性进行了探测。多神经元膜片钳记录技术具有极高的操作难度，因为需要在脑片相对较小的视野范围内存在足够数量的健康且类型明确的候选神经元，才能确保有较大概率获得高质量的同步记录并完成细胞类型的鉴定 真正 突触连接 图5 显示了来自年轻成年Pvalb-IRES-Cre/Ai14小鼠脑切片视觉皮层中两个tdTomato+快放电中间神经元的成对记录。检测到一个强的单向抑制性突触连接（使用高氯化物内液灌注电极记录）。展示了用于测量短时程突触可塑性特性的示例记录及实验方案。采用高频刺激串（每次10个脉冲，频率分别为10、50和100 Hz）刺激后，间隔不同时间（1、2或4 s）给予单次恢复性测试脉冲，以测量突触抑制恢复的时间进程。

在成熟成人ex vivo脑片中的新皮层神经元研究中也取得了极佳的成功。神经外科标本来自当地医院接受计划性肿瘤切除手术的患者。人类神经外科组织取材及脑片制备的步骤在若干实际操作方面与小鼠脑片制备有所不同。简而言之，切除的新皮层组织（远离病变部位）从手术室取出后，立即浸入冰浴、持续通氧的NMDG-HEPES aCSF溶液中，并在30分钟或更短时间内保持低温和持续供氧，从手术室运送至实验室。脑片采用NMDG保护性复苏方法制备，并在开始膜片钳记录前，给予约3小时的延长恢复时间。图6展示了利用该方法从人额叶皮层制备的ex vivo脑片中成功进行的成对记录实验和四细胞膜片钳记录实验。成对记录显示了一个皮层锥体神经元向皮层中间神经元的单向兴奋性突触输入（记录为兴奋性突触后电流）。在四细胞膜片钳实验中，同时记录了两个兴奋性神经元和两个抑制性神经元，在共检测的12个连接中，发现了3个抑制性突触连接（记录为抑制性突触后电位）。因此，这种优化的脑片方法使得在最具挑战性的脑片应用中也能实现可靠的实验成功，包括在急性切除的成熟成人人类脑组织中进行多神经元膜片钳实验以研究神经环路连接性。

脑区组织学比较；新皮层第V/II/III层、下托、背外侧膝状体显微镜图像
图1：采用优化的NMDG保护性复苏法进行脑片制备可显著改善神经元保存效果。 从三个月龄小鼠的急性脑片中获取多个不同脑区的代表性红外微分干涉差（IR-DIC）图像。左侧图示为未包含保护性复苏步骤的传统NMDG保护性切片法（对照），右侧图示为优化后的NMDG保护性复苏法。(A) 新皮层第V层，(B) 新皮层第II/III层，(C) 下托，以及(D) 背外侧膝状体（dLGN）。所有图中比例尺均为 20 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

电生理学数据；图表显示吉欧姆封接时间与静息膜电位分析。
图 2：采用NMDG保护性恢复法结合Na+脉冲注入程序的膜片钳记录实验中，吉欧姆封接形成速度加快且可靠性提高。（A）单独使用NMDG恢复法（黑色数据点，n = 19）与NMDG恢复法结合Na+脉冲注入程序（红色数据点，n = 23）的吉欧姆封接形成时间图。所有记录细胞均为视觉皮层第II/III层或第V层的锥体神经元。注意，最大时间限制为100秒，以涵盖那些始终未形成吉欧姆封接的细胞。配对t检验，**p <0.005。（B）第V层锥体神经元（橙色数据点，n = 10/11）、第II/III层锥体神经元（绿色数据点，n = 9/10）以及皮层Pvalb+快速放电中间神经元（蓝色数据点，n = 23/22）的静息膜电位（RMP）图。实心圆表示仅使用NMDG恢复条件，空心圆表示NMDG恢复结合Na+脉冲注入程序。每个数据点代表一个神经元，均显示均值及±标准误（SEM）。三种细胞类型在不同脑片制备条件下，其静息膜电位无显著差异（配对t检验）。请点击此处查看该图的放大版本。

显示年龄相关变化和实验分析结果的 NaCl 浓度随时间变化图
图 3：在加标过程期间钠离子浓度逐步升高的变化曲线。（A）加标 NaCl 浓度随时间变化图。（B）总细胞外 NaCl 浓度随时间变化图。请点击此处查看该图的放大版本。

神经元放电频率图；电流注入反应；A图60mV，B图80mV；示意图。
图4：遗传定义的皮层细胞类型的固有电生理特性。（A）Pvalb+ 皮层快速放电中间神经元在阶梯电流注入下的神经元放电示例轨迹（左图）。在 Pvalb-IRES-Cre/Ai14 小鼠的脑切片中，对 tdTomato+ 神经元进行记录。右侧显示放电频率与电流注入关系的汇总数据（F-I 曲线）（n = 22）。（B）Rorb 表达的皮层第IV层兴奋性神经元在阶梯电流注入下的神经元放电示例轨迹（左图）。在 Rorb-IRES-Cre/Ai14 小鼠的脑切片中，对 tdTomato+ 神经元进行记录。右侧显示放电频率与电流注入关系的汇总数据（F-I 曲线）（n = 23）。每条细彩色线代表单个神经元的 F-I 曲线；粗黑线代表每组的平均值 ± 标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。

神经科学实验；突触可塑性示意图；神经元IPSP幅度图；电生理学。
图 5：表达Pvalb的皮层快发放电中间神经元之间突触连接的短期可塑性。 （A）采用微分干涉相差显微镜和落射荧光技术，靶向小鼠初级视觉皮层中tdTomato阳性且表达Pvalb的快发放电中间神经元。彩色编码的示意图显示了两个中间神经元之间的单向突触连接。（B）用于评估突触连接神经元短期动态特性的刺激方案示意图。在突触前神经元中诱发一串10个动作电位（10、50和100 Hz），随后在刺激串终止后以不同的时间延迟（1、2和4 s）给予单个动作电位（恢复测试脉冲，RTP）。每个RTP以不同颜色编码以便清晰识别。（C）细胞#1中诱发的动作电位串所引发的细胞#2中单向抑制性突触后电位（uIPSP）的平均反应轨迹。灰色插图显示了扩展的时间尺度，以清晰展示uIPSP串的波形。（D）归一化的uIPSP振幅作为刺激串中不同位置的函数，在不同频率下绘制。在所有输入频率下均表现出明显的净抑制效应，且在4 s时uIPSP有显著恢复。请点击此处查看该图的放大版本。

用于突触研究分析的人类成对及四联记录迹线的神经元活动示意图。
图 6：成人人类神经外科脑片中的多神经元膜片钳记录。（A）低倍和高倍红外微分干涉差（IR-DIC）图像，显示所记录神经元的位置和类型（上图）。同时记录了一个锥体神经元（黑色星号）和邻近的中间神经元（红色星号）。示例为颜色编码的迹线，显示从锥体细胞到中间神经元的单向兴奋性突触连接（ESPC）（在电压钳下测得的兴奋性突触电流EPSCs），以及相应的物理连接图谱（下图）。（B）在成人人类背外侧前额叶皮层神经外科脑片中进行的四联膜片钳记录实验。同时记录两个锥体神经元和两个中间神经元，从而可依次探测十二种可能的突触连接。在细胞#3中诱发的动作电位序列（绿色迹线）导致在其余三个同时记录的神经元中均检测到抑制性突触后电位（IPSPs）（三个方框区域，上图）。每个神经元记录的反应均以颜色编码以便清晰识别。物理连接图谱见于下图。注意，（B）中所示原始迹线代表至少连续20次扫描的平均值。细胞类型的推测性鉴定基于胞体形态、记录期间通过荧光染料填充进行的形态学分析，以及固有的电生理特性，包括对电流阶跃注入的放电模式。请点击此处查看该图的放大版本。

NMDG-HEPES aCSFHEPES 维持用 aCSF记录用 aCSF
成分mMMWg/LitermMMWg/LitermMMWg/Liter
NMDG92195.2217.96
HCl9236.46*
NaCl9258.445.3812458.447.25
KCl2.574.550.192.574.550.192.574.550.19
NaH2PO41.2138.000.171.2138.000.171.2138.000.17
NaHCO33084.012.523084.012.522484.012.02
HEPES20238.314.7720238.314.775238.311.19
葡萄糖25180.204.5125180.204.5112.5180.202.25
抗坏血酸钠5198.000.995198.000.990198.000.00
硫脲276.120.15276.120.15076.120.00
丙酮酸钠3110.040.333110.040.330110.040.00
MgSO4.7H2O10246.485 mL2246.481 mL2246.481 mL (2M 储液)
CaCl2.2H2O0.5147.010.25 mL2147.011 mL2147.011 mL (2M 储液)
* 使用浓 HCl 将 NMDG-HEPES aCSF 的 pH 值滴定至 7.3–7.4
所有溶液的渗透压应在 300–310 mOsm/Kg 范围内

表1： 培养基配方。

动物年龄
时间（min）*<1个月1至3个月3–6个月6–12个月12 个月以上
0250 µL250 µL
1
2250 µL
3
4500 µL
5250 µL250 µL
61000 µL
7
82000 µL
9
10转移500 µL250 µL250 µL
11
12
13
14
151000 µL500 µL250 µL250 µL
16
17
18
19
202000 µL1000 µL500 µL250 µL
21
22
23
24
25转移2000 µL1000 µL500 µL
26
27
28
29
30转移2,000 µL1,000 µL
31
32
33
34
35转移2,000 µL
36
37
38
39
40转移
时间零点是指脑片转移至初始恢复室的时刻

表2：根据小鼠年龄推荐的逐步钠离子（Na+）加标操作时间表。

讨论

Na+ 内参标准物提升吉欧姆封接形成效率与膜片钳记录成功率
NMDG保护性复苏法的初始版本是专门为成年和衰老动物设计的2,5一些早期采用者还尝试将该方法应用于幼年动物脑切片即，小鼠 <30天）。然而，有研究指出，尽管在此年龄段使用NMDG保护性复苏方法可实现通过视觉确认的优异神经元保存效果，但吉欧姆密封（gigaohm seal）的形成常出现停滞，导致膜片钳记录尝试失败。一种假设认为，与成年脑片相比，NMDG阳离子更容易滞留在幼年脑片中，从而阻碍密封形成；然而，当幼年脑片完全浸没于NMDG aCSF时，仍可顺利形成吉欧姆密封（数据未显示），这表明NMDG aCSF 本身 不会阻碍吉欧姆封接的形成。

在初始脑片恢复步骤结束时，溶液中 Na+ 从低浓度快速转变为高浓度，会导致神经元膜损伤并干扰封接形成过程。这一点是显而易见的，因为 Na+ 浓度从低到高、温度从冷到暖，以及 Ca2+ 与 Mg2+ 比值的显著升高，共同引发自发性突触活动的强烈反弹。脑片制备过程中的这种抑制性反弹阶段，可能类似于缺血损伤后发生的再灌注损伤。因此，为了进一步减轻初始恢复阶段的神经元膜损伤，现已引入一种逐步 Na+ 递增方案，即在 NMDG 保护性恢复孵育腔中，Na+ 浓度通过精确的时间控制被缓慢且可重复地逐步升高。与原始的保护性恢复方案类似，将 Na+ 浓度升高在时间上与温度及 Ca2+/Mg2+ 比值的升高相分离具有优势。此外，Na+ 递增方案在早期时间点引起细胞外 Na+ 浓度的小幅递增，而在后期时间点实现大幅升高，从而使脑组织有更充分的机会适应逐渐升高的 Na+ 水平。该方案可替代由灌流泵或重力滴注系统控制的逐步溶液交换方法，后者会导致 Na+ 水平持续上升，且需同时监控流入与流出，以避免切片腔溢出。值得注意的是，在此 Na+ 递增方案中，切片腔内溶液的渗透压在数分钟内逐步升高，随后切片被重新置于正常渗透压溶液中，但这一过程并未对切片健康状态或膜片钳记录的成功率产生不利影响。既往已有研究在中脑切片制备中使用高渗透压切割液，以更好地保护多巴胺能神经元用于膜片钳记录57,58，这表明在某些情况下，这种短暂的高渗状态可能具有积极作用。

通过采用优化的实验流程，结合NMDG保护性复苏法与逐步Na+ spike-in 步骤使得该脑片技术的应用范围扩展至涵盖幼年到成年成熟期的动物。此更新后的方案现可适用于广泛年龄段的动物，仅需使用一种最优的 NMDG aCSF 配方和操作流程。如有必要，可调整 Na+ spike-in 操作可根据动物年龄采用逐渐延长延迟时间或减缓时间进程的方式，以提高老年动物脑切片的存活率，我们已提供了按动物年龄推荐的 spike-in 时间方案的基本指南（见 表2）。尽管我们已提供了一个适用于多种应用的基本框架，但仍可探索一些额外的高级步骤，以进一步提高成年和衰老动物脑切片的存活率和存续时间。例如，谷胱甘肽恢复策略在这一方面尤为有效，具体实施方法可参见其他文献报道。2,6.

提高具有挑战性实验的通量
通过膜片钳记录分析突触连接性是一项要求极高的应用，需要对神经元的结构和功能均实现良好保存，才能获得较高的实验成功率。随着需同时记录的神经元数量呈线性增加，技术难度呈超线性上升。该实验存在多种失败模式，其中最常见的失败原因之一是无法在目标细胞中的一个或多个细胞上形成足够稳定的吉欧姆密封。当需要同时记录三个或更多神经元时，这一问题会显著减缓实验进展。与采用优化的NMDG保护性复苏方法可加快吉欧姆密封形成时间的研究结果一致，无论是成年转基因小鼠脑切片还是成年癫痫患者神经外科脑切片，其多神经元膜片钳记录实验的成功率和通量均得到显著提升。这种效率的提高几乎可以肯定归因于该方案下吉欧姆密封形成更快速、更可靠，同时脑切片中神经元的保存状态也得到改善。尽管本方案明确聚焦于膜片钳记录应用的优势，但对于其他脑切片活性至关重要的高难度实验应用，预计也将获得类似的改进效果。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由艾伦脑科学研究所资助。作者谨此感谢艾伦研究所的创始人保罗·G·艾伦（Paul G. Allen）和乔迪·艾伦（Jody Allen）的远见卓识、鼓励与支持。我们还要感谢艾伦研究所的技术支持人员在动物护理、饲养和基因分型方面所做的工作。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Compresstome VF-200Precisionary InstrumentsVF-200振动式组织切片机（推荐）
N-甲基-D-葡萄糖胺Sigma AldrichM2004aCSF组分
氯化钠Sigma AldrichS3014aCSF组分
氯化钾Sigma AldrichP5405aCSF组分
一水合磷酸二氢钠Sigma Aldrich71505aCSF组分
碳酸氢钠Sigma AldrichS5761aCSF组分
HEPESSigma AldrichH4034aCSF组分
葡萄糖Sigma AldrichG7021aCSF组分
抗坏血酸钠Sigma AldrichA4034aCSF组分
硫脲Sigma AldrichT8656aCSF组分
丙酮酸钠Sigma AldrichP5280aCSF组分
二水合氯化钙Sigma AldrichC7902aCSF组分
七水合硫酸镁Sigma AldrichM1880aCSF组分
2,2,2-三溴乙醇 Sigma AldrichT48402麻醉剂组分1
2-甲基-2-丁醇 Sigma Aldrich240486麻醉剂组分2
弯头钝头镊Fine Science Tools11065-07脑组织解剖工具
精细解剖剪（超锐）Fine Science Tools14058-09脑组织解剖工具
大型重型剪刀（7英寸）Fine Science Tools14000-18脑组织解剖工具
金属刮勺Sigma AldrichZ511455-1PAK脑组织解剖工具
剃须刀片VWR89031-954脑组织解剖工具
Brain Slice Keeper-4Automate ScientificS-BSK4脑片保存室
尼龙网 Warner Instruments64-0198用于构建小型脑片回收室
Pyrex玻璃烧杯（250 mL）VWR89090-434用于构建小型脑片回收室
35 mm塑料培养皿，圆形VWR100488-376用于构建小型脑片回收室
气体扩散石（10 µm）Sigma Aldrich59277用于持续通入碳合气（产生细小气泡）
琼脂糖I-B型Sigma AldrichA0576用于包埋脑组织样本
微量加样尖头Eppendorf22491229用于填充膜片钳电极
硅胶（Sylgard）VWR102092-312用于制作定制解剖平台
盐酸 Sigma AldrichH1758-100ML用于调节培养基pH值
氢氧化钠 Sigma Aldrich221465-25G用于调节培养基pH值
氢氧化钾Sigma Aldrich221473用于调节培养基pH值
3 mL刻度塑料移液管VWR89497-676用于转移脑片
氧化锆陶瓷注射刀片Cadence Specialty BladesEF-INZ10http://cadenceinc.com/
KG-33硼硅酸盐玻璃毛细管（带丝）King Glass Companycustom quote内径：0.87 mm，外径：1.50 mm
生物胞素Sigma AldrichB4261细胞内电极液组分
磷酸肌酸二钠Sigma AldrichP7936细胞内电极液组分
葡萄糖酸钾Sigma AldrichG4500-100G细胞内电极液组分
EGTASigma AldrichE3889细胞内电极液组分
Mg-ATPSigma AldrichA9187细胞内电极液组分
Na2-GTPSigma Aldrich51120细胞内电极液组分
蔗糖Sigma AldrichS0389细胞内电极液组分
加热恒温水浴（2.5 L）VWR13491-060其他
滤纸圆片VWR28456-022其他
氰基丙烯酸酯胶AmazonB000BQRBO6其他
玻璃培养皿VWR89000-326其他
10X磷酸盐缓冲液Sigma AldrichP5493其他
30 mL注射器VWRBD302832其他
1 mL注射器VWRBD-309628其他
25 5/8号针头VWR89219-292其他
恒温混匀仪（配1.5 mL离心管模块）VWR89232-908用于保持琼脂糖处于熔融状态 

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