微RNA循环使用定量DNA结合染料化学和液滴的数字PCR

Summary

描述了一种使用基于染料的化学和液滴数字 PCR 技术进行游离 microRNA 定量的灵敏且准确的方法。

Abstract

循环微RNA（miRNA）（无细胞的），从细胞释放到血流中。在循环的特定微小RNA的量已与一种疾病状态，并具有被用作疾病的生物标志物的潜力。用于使用基于染料的化学和液滴数字PCR技术循环微RNA定量的灵敏和准确的方法最近已开发。具体而言，使用锁核酸（LNA）为基础的miRNA特异性引物用绿色荧光DNA结合染料在相容的液滴数字PCR系统能够获得特定miRNA的绝对定量。在这里，我们描述了如何执行此技术，以评估在生物流体，例如血浆和血清的miRNA量，是可行和有效的。

Introduction

MicroRNA （miRNA） 可能由生物体的所有细胞释放到血液循环中，这是主动释放或坏死和凋亡过程的结果。已在血液中检测到游离 miRNA，这些 RNA 要么是游离的稳定分子，要么是与脂蛋白相连的，要么是包膜在外泌体和微泡内的 ^1-3。它们被认为起着细胞间通讯器⁴（cell-to-cell communicator）的作用，在癌症、心脏疾病或自身免疫性疾病存在时，它们的数量会发生变化^5-7。它们的准确和可重复的定量是它们作为疾病生物标志物评估的基础。然而，由于其他地方已经描述的几个原因 ^8,9，血清或血浆以及其他体液中的 miRNA 定量可能非常具有挑战性 ^10,11。我们最近开发了一种基于 miRNA 特异性 LNA 引物和 DNA 结合染料液滴数字 PCR （ddPCR） 技术的循环 miRNA 绝对定量方法 ¹²。该方法已应用于 miRNA 乳腺癌生物标志物的验证 ^13,14。

在纳升大小的液滴中分配每个逆转录的 miRNA 分子后，可以计算每个样品中每个 miRNA 的拷贝数，基本上计算绿色荧光液滴的数量，因此计算阳性荧光液滴的数量。一旦发生 PCR 反应，即可获得阳性计数，无需建立标准曲线或在计算靶标量时考虑 PCR 效率，就像定量 RT-PCR （RT-qPCR） 那样。此外，在循环 miRNA 定量方面，ddPCR 被证明比 RT-qPCR 更灵敏、更准确 ¹⁵。 在本文中，我们介绍了该方法的详细方案，讨论了最相关的步骤，并特别考虑了血清和血浆临床样本。

Protocol

从血浆或血清中分离的microRNA

注意:血浆和血清制剂是循环的miRNA定量的相关步骤。存在用于血浆和血清制备没有优选的程序。唯一要考虑的重要的事情是，所有来自同一实验的样品必须使用完全相同的工作流程进行处理。从200μl的血清或血浆开始。总RNA可以从血清或血浆用市售试剂盒进行分离。

1，协议总RNA（miRNA的包括）隔离

1. 在冰上解冻血清/血浆样本。
2. 1毫升裂解试剂（ 如 ，Qiazol加）添加到200微升血清/血浆。
3. 涡旋混匀，含在板凳上的匀浆在室温5分钟管。
4. 从添加C的合成的miRNA CEL-MIR-39-3p的4.16纳米的解决方案的3微升线虫 。
5. 加入200μl氯仿。摇动该管剧烈持续15秒。第广场在室温替补2分钟就电子管。
6. 离心机以12,000 xg离心15分钟，在4℃，以获得相分离:上层水相含有的RNA。
7. 水相转移到一个新的管，约700微升，避免任何白色相间的材料转移。
8. 加入1ml的100％乙醇并通过倒置混合。
9. 吸管向上700微升样品放入一个微型旋转柱置于2ml的收集管。盖上盖子，离心机在12000 XG为15秒。丢弃的流量通过。
10. 重复使用剩余的样本这一步骤。
11. 加入700μlBuffer RWT到微型离心柱，盖上盖子，离心15秒12,000 XG洗列。丢弃的流量通过。
12. 吸取500微升缓冲液RPE到微型离心柱。盖上盖子，离心15秒12,000 RPM。丢弃的流量通过。再次重复此步骤。
13. 离心全速微型旋转柱2分钟以干燥离心柱从膜残留的乙醇。
14. 微型旋转柱转移至新的1.5 ml收集管和移液管35微升不含RNA酶的水在列的膜。
15. 离心1分钟以12,000 xg离心以洗脱RNA。
16. 储存在-80℃的RNA。
    注意:由于RNA浓度不能精确确定的，使用固定的卷作为输入量的量度。

2.微小RNA反转录

1. 解冻的逆转录（RT）试剂混合物成分:5×反应缓冲液，不含核酸酶的水。混合轻轻翻转冰上管和地点。在使用前，立即删除从冰箱中的酶混合物置于冰上。降速所有试剂。
2. 如表1中所述制备在冰上对RT试剂混合物。制备至少10％的超过组合。
3. 混合吹打反应，然后降速。
4. 在42℃孵育60分钟。
5. 热灭活的逆向工程＆本身酶为在95℃5分钟。
6. 立即冷却至4℃。
7. 存放在-20°C的基因。

3.稀释的cDNA

1. 稀需要在无核酸酶的水计划ddPCR反应cDNA模板的量。稀释1:50和1之间的基因反应:500水，取决于目标miRNA的丰度。储存在-20℃下的稀释的cDNA。所述稀释的cDNA被证明为在-20℃至少3个月是稳定的。

4.产生液滴和PCR

注意:液滴生成应该在8个样品在同一时间内进行。技术重复不是必需的，因为这种技术^12,15 .A无模板对照（NTC）的样品应当在每一个板中运行的高再现性，并为每个不同ddPCR条件。

1. 解冻并平衡了主结构（ 例如 ，EvaGreen预混），微小RNA引物和cDNA在室温。
2. 混合母液日oroughly通过倒转试管几次。降速所有试剂。
3. 如表2中所述制备ddPCR组合。当执行多个ddPCR反应，制备ddPCR混合工作溶液。至少准备10％的超额组合。
4. 一旦组装，调匀和降速ddPCR组合。
5. 分配12微升ddPCR的混合到96孔PCR板或PCR管。
6. 添加8微升稀释的cDNA模板的每个管/孔。
7. 将液滴生成墨盒插入支架。
8. 转移20微升每种制备的样品，以微滴发生器盒小心，同时避免空气在井的底部的气泡的样品孔（中间行）。
9. 用70微升液滴生成油填充每个油井（下排）。
10. 钩在盒保持器的垫片和插入液滴发生器。
11. 盖上盖子，开始根据液滴代制造商的公关otocol。当液滴的一代已经完成，打开盖子，取出一次性垫圈。盒的顶部孔包含液滴。
12. 吸管慢慢，平稳40微升的八个顶部孔（液滴）的内容到一个96孔PCR板中的一列。
13. 转移液滴蒸发避免后立即密封带箔的PCR板。使用可刺穿箔片密封件是与液滴读者针相容。
14. 密封板30分钟内开始热循环（PCR）。
15. 根据表3进行循环协议。

5.阅读液滴

1. 上电液滴读者。
2. 从热循环仪，以液滴读者移动板。
3. 放置含有PCR后液滴入盘保持器的底部的96孔PCR板。
4. 放置在PCR板的板保持器的顶部。用力按下两个释放卡舌到固定支架中的PCR板。
5. 开始从系统计算机软件。
   1. 单击设置来定义试​​验（绝对定量），然后单击Run启动液滴读数。
   2. 当液滴阅读完毕后，单击"分析"按钮，打开和分析数据。
   3. 使用2D振幅积在分析软件来选择阳性微滴（套索工具）（ 图1B）。
   4. 使用事件选项卡，检查阳性，总滴数。为18,000的总人数 - 21000飞沫通常与probeless ddPCR实现。
   5. 一旦正液滴被选择，导出使用来自浓度标签导出的.csv选项所述miRNA浓度值。

Results

可使用绿色荧光DNA结合染料和液滴数字PCR技术来确定每毫升的血浆或血清的特定miRNA的绝对量。 图1表示正极的液滴选择的过程中，它决定了最终的miRNA浓度（拷贝/微升）在由分析软件计算的扩增反应。血液中的每个miRNA的量是非常不同的，是一些miRNA族比其他人更丰富。使用在ddPCR反应1:50稀释的cDNA，可以得到正和负的液滴的足够数量。在正液滴饱和（ 例如 ，没有剩余的负液滴）的情况下，cDNA样本的进一步的稀释可能是必要的。

每一LNA的引物组应该被优化以液滴数字PCR系统上正常工作。对的miR-181A-5P优化过程是在图2中表示的具体而言，改变引物的量（通常在0.25的范围内-每ddPCR反应1微升）。和退火温度（通常在56的范围内- 60℃），它是可以选择的组合确定正和负的液滴之间的更好的分离。在的miR-181A-5P，60℃的退火温度和两个0...

Discussion

循环miRNA是存在于血液中的浓度极低，而且可以从血浆和血清样品中提取的RNA的量是低的。因为这个原因，它们难以与其它技术，如微阵列和RNA测序量化。此外，还有在数据归一化的一般化缺乏协议和内源性"参考"微RNA在血液中的存在。在这种情况下，一个灵敏的技术，如微滴数字PCR，能够每毫升血清或血浆，即使非常低的计数的miRNA拷贝数的，是非常有吸引力的。我们配对该技术具有普遍性的cDNA系统，反向转录在一个反应​​全部循环的miRNA从而节省时间，最重要的是，RNA的材料。在我们的方法，特异度为固有的使用LNA的引物，相对于其他的解决方案时^，16 miRNA的定量其中表现非常出色。

液滴数字PCR是终点测定法，允许靶基因的计算绝对浓度。不像定量PCR，扩增效率不足不影响最终ddPCR定量。因此，考虑到本比如血液样本中的PCR抑制剂的量，ddPCR提供用于循环核酸评估一个强大的工具。

由于其高灵敏度，该技术提供了一个足够的量化也不太丰富的miRNA，即使起始原料的量有限。另外，假设每个miRNA分子在cDNA...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	总 RNA（包括 miRNA）色谱柱，从血清/血浆中提取
100 nmole RNA 寡核苷酸 Cel-miR-39-3p	整合 DNA 技术	定制	序列：UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG
通用 cDNA 合成试剂盒 II，8-64 次反应	Exiqon	203301	试剂盒，用于 microRNA 逆转录
MicroRNA LNA PCR 引物套装	Exiqon	204000-206xxx 和 2100000-21xxxxx	液滴内 miRNA 扩增的引物
QX200 液滴发生器	BioRad	186-4002	用于液滴读取的仪器
QX200 微滴读数仪	BioRad	186-4003	用于液滴生成的仪器
QuantaSoft 软件	BioRad	186-3007	用于数据收集和分析的软件
PX1 PCR 板密封仪	BioRad	181-4000	板密封仪
DG8 液滴发生器 柱和垫圈	BioRad	186-4008	用于混合样品和油以生成液滴的液柱
QX200 ddPCR EvaGreen 超混合液	BioRad	186-4033/36	PCR 超混合液
QX200 用于 EvaGreen 染料的液滴发生油	BioRad	186-4005	用于液滴生成的油