本文介绍了一种利用染料化学法和液滴数字PCR技术对无细胞microRNA进行高灵敏度和高准确度定量的检测方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
循环游离微小RNA（miRNA）由细胞释放进入血液。循环中特定微小RNA的含量与疾病状态相关，具有作为疾病生物标志物的潜力。近期已开发出一种基于染料化学和微滴数字PCR技术的高灵敏度、高准确性方法，用于定量检测循环微小RNA。具体而言，在兼容的微滴数字PCR系统中，使用基于锁核酸（LNA）的miRNA特异性引物和绿色荧光DNA结合染料，可实现对特定miRNA的绝对定量。本文描述了该技术在血浆和血清等生物液体中检测miRNA含量的可行性和有效性。
引言
微小RNA（miRNA）可由生物体几乎所有细胞通过主动释放或坏死及凋亡过程释放进入血液循环。游离miRNA已在血液中被检测到，它们以游离稳定分子形式存在，或与脂蛋白结合，或包裹于外泌体和微囊泡内1-3。人们认为这些miRNA在细胞间通讯中发挥作用4，并且在癌症、心脏疾病或自身免疫性疾病存在时其含量会发生变化5-7。对miRNA进行准确且可重复的定量是将其评估为疾病生物标志物的基础。然而，由于其他文献中已描述的多种原因8,9，在血清或血浆以及其他体液中对miRNA进行定量可能极具挑战性10,11。我们近期开发了一种基于miRNA特异性锁核酸（LNA）引物和DNA结合染料的液滴数字PCR（ddPCR）技术，用于循环miRNA的绝对定量12。该方法已应用于miRNA乳腺癌生物标志物的验证13,14。
在每个反向转录的miRNA分子被分配到纳升级液滴中后，即可对每个样本中每种miRNA的拷贝数进行计数，其基本原理是统计呈绿色、即具有阳性信号的荧光液滴数量。一旦发生PCR扩增反应，即可获得一个阳性计数，无需建立标准曲线，也无需在目标物定量计算中考虑PCR扩增效率，而定量逆转录PCR（RT-qPCR）则必须进行这些步骤。此外，已有研究表明，数字滴定PCR（ddPCR）在循环miRNA定量方面比RT-qPCR具有更高的灵敏度和准确性15。本文将详细介绍该方法的具体实验流程，讨论其中最关键的步骤，并特别针对血清和血浆等临床样本进行说明。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
血浆或血清中微小RNA的分离
注意：血浆和血清的制备是循环miRNA定量中的关键步骤。目前尚无首选的血浆和血清制备方法。唯一需要考虑的重要因素是，同一实验中的所有样本必须使用完全相同的操作流程进行处理。起始样本量为200 µl血清或血浆。可使用市售试剂盒从血清或血浆中提取总RNA。
1. 总RNA（包括miRNA）提取方案
- 将血清/血浆样本在冰上解冻。
- 向 200 µl 血清/血浆中加入 1 ml 裂解试剂（例如，QIAzol）。
- 涡旋混匀，并将含有匀浆的离心管置于室温下静置 5 分钟。
- 加入 3 µl 来自 C. elegans 的合成 miRNA cel-miR-39-3p（4.16 nM 溶液）。
- 加入 200 µl 氯仿，剧烈振荡 15 秒。将离心管置于室温下静置 2 分钟。
- 在 4 °C 条件下以 12,000 x g 离心 15 分钟，使相分离：上层水相含有 RNA。
- 将水相（约 700 µl）转移至新离心管中，避免转移任何白色中间层物质。
- 加入 1 ml 100% 乙醇，通过倒置混匀。
- 用移液器吸取 700 µl 样品至置于 2 ml 收集管上的小型离心柱中。盖紧管盖，在 12,000 x g 条件下离心 15 秒。弃去穿流液。
- 使用剩余样品重复此步骤。
- 向小型离心柱中加入 700 µl RWT 缓冲液，盖紧管盖，在 12,000 x g 条件下离心 15 秒以洗涤离心柱。弃去穿流液。
- 向小型离心柱中加入 500 µl RPE 缓冲液。盖紧管盖，在 12,000 rpm 条件下离心 15 秒。弃去穿流液。再次重复此步骤。
- 将小型离心柱在最大转速下离心 2 分钟，以去除离心柱膜上残留的乙醇。
- 将小型离心柱转移至新的 1.5 ml 收集管中，并在离心柱膜上加入 35 µl 无 RNase 水。
- 在 12,000 x g 条件下离心 1 分钟，以洗脱 RNA。
- 将 RNA 储存于 -80 °C。
注意：由于无法准确测定 RNA 浓度，应使用固定的体积作为上样量的衡量标准。
2. 微小RNA逆转录
- 解冻逆转录（RT）试剂混合物的组分：5倍反应缓冲液、无核酸酶水。轻轻颠倒混匀各管，置于冰上。使用前立即从冷冻箱中取出酶混合液，置于冰上。将所有试剂短暂离心。
- 在冰上配制RT试剂混合液，具体步骤如下所述 表1准备至少超出10%的混合液。
- 用移液器吹打混匀反应液，然后离心沉淀。
- 在 42 ˚C 下孵育 60 分钟。
- 95 ˚C 加热 5 分钟以灭活逆转录酶。
- 立即冷却至 4 °C。
- 将 cDNA 储存于 -20 °C。
3. cDNA 稀释
- 根据计划进行的数字微滴PCR（ddPCR）反应所需量，用无核酸酶水稀释cDNA模板。根据靶标miRNA的丰度，将cDNA反应液在水中稀释1:50至1:500倍。将稀释后的cDNA储存于-20 °C。稀释后的cDNA在-20 °C下至少可稳定保存3个月。
4. 液滴生成与PCR
注意：应每次对8个样品进行液滴生成。由于该技术具有高度可重复性12,15，无需设置技术重复样本。每个反应板以及每种不同的数字微滴PCR（ddPCR）条件均应设置无模板对照（NTC）样本。
- 在室温下解冻并平衡主混合液（例如，EvaGreen 主混合液）、microRNA 引物组和 cDNA。
- 通过反复倒置管子数次彻底混匀主混合液。离心收集所有试剂。
- 按照表 2所述配制 ddPCR 混合液。当进行多个 ddPCR 反应时，应配制 ddPCR 混合液的工作液，并额外多准备至少 10% 的量。
- 混合液配制完成后，充分混匀并短暂离心。
- 将 12 µl ddPCR 混合液分装至 96 孔 PCR 板或 PCR 管中。
- 向每根管或每个孔中加入 8 µl 稀释后的 cDNA 模板。
- 将微滴生成器卡盒插入卡盒架中。
- 小心地将每份已制备样品 20 µl 转移至微滴生成器卡盒的样品孔（中间一排），避免孔底产生气泡。
- 向每个油相孔（底部一排）加入 70 µl 微滴生成器油。
- 将密封垫圈钩在卡盒架上，并将整体插入微滴生成器中。
- 关闭盖子，按照制造商的操作说明启动微滴生成。微滴生成完成后，打开盖子，取下一次性密封垫圈。此时卡盒顶部各孔中含有生成的微滴。
- 缓慢而平稳地用移液器吸取顶部八个孔中的内容物（即微滴），共 40 µl，转移至 96 孔 PCR 板的同一列中。
- 转移微滴后立即用铝箔密封 PCR 板，防止蒸发。应使用可穿刺的铝箔封板膜，确保与微滴读取仪中的针头兼容。
- 封板后 30 分钟内开始热循环（PCR）。
- 按照表 3设定的程序进行扩增循环。
5. 液滴读取
- 打开液滴读取仪电源。
- 将反应板从热循环仪转移至液滴读取仪。
- 将含有扩增后液滴的96孔PCR板放入板架底座中。
- 将板架上盖盖在PCR板上，用力按下两侧释放按钮，以固定PCR板。
- 从系统计算机启动软件。
- 点击“Setup”以设定实验（绝对定量），然后点击“Run”开始读取液滴。
- 液滴读取完成后，点击 "“Analyze”" 按钮以打开并分析数据。
- 在分析软件中使用二维振幅图，利用套索工具选择阳性液滴（图1B）。
- 通过“Events”标签页检查阳性液滴和总液滴数量。在无探针的ddPCR中，通常可获得18,000至21,000个液滴。
- 选定阳性液滴后，通过“Concentration”标签页中的导出.csv选项导出miRNA浓度值。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
可通过绿色荧光DNA结合染料和微滴数字PCR技术测定每毫升血浆或血清中特定miRNA的绝对含量。图1展示了阳性微滴筛选过程，该过程由分析软件计算扩增反应中miRNA的最终浓度（拷贝数/µl）。不同miRNA在血液中的含量差异较大，某些miRNA的丰度显著高于其他种类。在ddPCR反应中使用1:50稀释的cDNA，可获得足够数量的阳性和阴性微滴。若出现阳性微滴饱和（例如，无剩余阴性微滴），则可能需要对cDNA样本进行进一步稀释。
每对LNA引物均需进行优化，以确保在液滴数字PCR系统中正常工作。miR-181a-5p的优化过程如图2所示。具体而言，通过调整引物用量（通常为每ddPCR反应0.25–1 µl）和退火温度（通常为56–60 °C），可筛选出能够实现阳性和阴性液滴更好分离的组合条件。对于miR-181a-5p，退火温度为60 °C，且引物用量为0.5 µl或1...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
循环miRNA在血液中的浓度极低，从血浆和血清样本中提取的RNA量也很少。因此，使用其他技术（如微阵列和RNA测序）对其进行定量非常困难。此外，目前在数据归一化方面普遍缺乏共识，且血液中是否存在内源性"参考"miRNA仍不明确。在此背景下，像微滴数字PCR这样能够精确计数每毫升 血清或血浆中miRNA拷贝数（即使拷贝数极低）的高灵敏度技术显得极具吸引力。我们将该技术与一种通用cDNA系统相结合，可在单个反应中对所有循环miRNA进行逆转录，从而节省时间，更重要的是节约了RNA样本。在我们的方法中，特异性源于LNA引物的使用，与其他方案相比，LNA引物在miRNA定量中表现优异16。
微滴数字PCR是一种终点检测方法，可用来计算目标基因的绝对浓度。与定量PCR不同，扩增效率不足不会影响最终的微滴数字PCR定量结果。因此，考虑到血液样本等样本中可能存在的PCR抑制物含量，微滴数字PCR为循环核酸的检测提供了一种可靠的工具。
由于其高灵敏度，该技术即使在起始材料有限的情况下，也能对丰度...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
由意大利癌症研究协会（AIRC）为 MF（项目编号 MFAG 11676）和 MN（特别项目“分子临床肿瘤学——5 per mille”编号 9980，2010/15）提供的资助，以及意大利教育、大学与研究部 FIRB 2011 项目（项目编号 RBAPIIBYNP）为 MN 提供的资助支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| miRNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 217004 | 用于从血清/血浆中提取总RNA（包括miRNA）的离心柱 |
| 100 nmole RNA寡核苷酸Cel-miR-39-3p | Integrated DNA Technologies | Custom | 序列：UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG |
| 通用cDNA合成试剂盒II，8-64次反应 | Exiqon | 203301 | 用于microRNA逆转录的试剂盒 |
| MicroRNA LNA PCR引物组 | Exiqon | 204000-206xxx 和 2100000-21xxxxx | 用于液滴内miRNA扩增的引物 |
| QX200液滴生成仪 | BioRad | 186-4002 | 用于液滴读取的仪器 |
| QX200液滴读取仪 | BioRad | 186-4003 | 用于液滴生成的仪器 |
| QuantaSoft软件 | BioRad | 186-3007 | 用于数据采集与分析的软件 |
| PX1 PCR板封膜机 | BioRad | 181-4000 | 板封仪 |
| DG8液滴生成仪 cartridge 和垫圈 | BioRad | 186-4008 | 用于混合样品与油相以生成液滴的 cartridge |
| QX200 ddPCR EvaGreen预混液 | BioRad | 186-4033/36 | PCR预混液 |
| 适用于EvaGreen染料的QX200液滴生成油 | BioRad | 186-4005 | 用于液滴生成的油相 |
参考文献
- Arroyo, J. D., et al. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5003-5008 (2011).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).
- Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
- Braicu, C., et al. Exosomes as divine messengers: are they the Hermes of modern molecular oncology. Cell Death Differ. 22, 34-45 (2015).
- Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circ Res. 110, 483-495 (2012).
- Guay, C., Regazzi, R. Circulating microRNAs as novel biomarkers for diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol. 9, 513-521 (2013).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 11, 145-156 (2014).
- Moldovan, L., et al. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J Cell Mol Med. 18, 371-390 (2014).
- Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in Using Circulating miRNAs as Cancer Biomarkers. Biomed Res Int. 2015, 731479(2015).
- Jarry, J., Schadendorf, D., Greenwood, C., Spatz, A., van Kempen, L. C. The validity of circulating microRNAs in oncology: five years of challenges and contradictions. Mol Oncol. 8, 819-829 (2014).
- Witwer, K. W. Circulating MicroRNA Biomarker Studies: Pitfalls and Potential Solutions. Clin Chem. 61, 56-63 (2015).
- Miotto, E., et al. Quantification of Circulating miRNAs by Droplet Digital PCR: Comparison of EvaGreen- and TaqMan-Based Chemistries. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23, 2638-2642 (2014).
- Ferracin, M., et al. Absolute quantification of cell-free microRNAs in cancer patients. Oncotarget. , (2015).
- Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomarker Research. , (2015).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nat Methods. 10, 1003-1005 (2013).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11, 809-815 (2014).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
