针对含Kappa (Vκ) 轻链的人源（IgM）抗体的抗体结合特异性：以附着于NCAM的多唾液酸（PSA）为例的研究

摘要

我们提出了一种用于鉴定含有人和小鼠IgM抗体抗原的蛋白质组分的方案，这些抗体具有特异性的κ（Vκ）轻链。该方案不仅限于IgM类抗体，也适用于在免疫沉淀过程中能够以足够高亲和力结合其抗原的所有免疫球蛋白同种型。

摘要

IgM 同种型抗体在人类临床试验、人类疾病动物模型以及常规实验室检测技术中，常被忽视其作为潜在治疗剂或检测试剂的应用价值。然而，已有多种人源 IgM 抗体在癌症模型及中枢神经系统（CNS）疾病模型（包括多发性硬化症（MS）和肌萎缩侧索硬化症（ALS））中显示出疗效证据。IgM 抗体未被充分重视的原因包括：IgM 抗体在表达、纯化和稳定性方面的技术困难，难以鉴定（非蛋白类）抗原，其结合亲和力较低，以及在糖类和脂质研究领域存在基础认知的空白。

本文以 HIgM12 为例，提供了一套通过蛋白质印迹（Western blotting）、免疫共沉淀和免疫细胞化学方法检测抗原的详细实验方案。HIgM12 靶向与神经细胞黏附分子（NCAM）结合的多聚唾液酸（PSA）。为评估 NCAM 对 HIgM12 结合的重要性，实验采用了野生型（WT）小鼠和 NCAM 基因敲除（KO）小鼠的早期出生后脑组织，其中 KO 小鼠缺失中枢神经系统（CNS）中三种主要的剪接变体 NCAM180、140 和 120。进一步对 CNS 组织和培养的 CNS 细胞进行内切唾液酸酶消化处理，使我们确定 PSA 是 HIgM12 特异性结合的表位。

引言

IgM 类型的抗体在治疗包括癌症和中枢神经系统疾病在内的多种疾病方面展现出巨大的治疗潜力^1-7。Vollmers 研究团队在癌症患者中鉴定出大量抗体，这些抗体有望作为肿瘤特异性生物标志物或活性治疗剂，能够通过诱导凋亡通路来杀伤恶性细胞^4,8,9。有趣的是，所有被鉴定出具有治疗潜力的抗体均为 IgM 类型，并属于"天然自身抗体"（NAbs）这一类别。

同样，Rodriguez 团队鉴定出能够促进多发性硬化症（MS）模型中慢性脱髓鞘脊髓病变再髓鞘化的鼠源和人源抗体。与具有抗肿瘤效应的抗体相同，所有促进再髓鞘化的抗体均为天然抗体（NAbs），且属于IgM同种型^1,6,7,10。目前大多数已鉴定的IgM抗体的精确抗原仍不明确，包括正处于MS患者I期临床试验阶段的人源再髓鞘化促进抗体rHIgM22¹¹。尽管学术界以及与工业界合作的脂质和碳水化合物研究领域专家已多次尝试¹¹，但仍未成功鉴定出rHIgM22的抗原。用于鉴定IgG抗体抗原的标准技术在IgM抗体上的失败，凸显出亟需优化针对此类抗体的鉴定方法，因为IgM抗体极有可能识别的是碳水化合物或脂质类抗原。

本文的重点是人源再生性抗体HIgM12及其抗原鉴定所用的实验方法。抗体HIgM12最初从华氏巨球蛋白血症患者中鉴定获得，可在体外促进神经突起生长in vitro^12-14，其靶标为附着于神经细胞黏附分子上的多聚唾液酸（PSA-NCAM）^15,16。HIgM12可在肌萎缩侧索硬化（ALS）小鼠模型中延长寿命¹⁷，并改善泰勒氏小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）感染小鼠的功能预后。具体而言，在慢性脱髓鞘小鼠模型中，单次低剂量腹腔注射HIgM12后八周，可促进小鼠自发的水平与垂直运动活动，并增加脊髓中小至中等直径轴突的数量¹⁸。

神经细胞黏附分子（NCAM）是一种表达于神经元、胶质细胞、骨骼肌细胞和自然杀伤细胞表面的免疫球蛋白（Ig）超家族糖蛋白^19-25。三种主要的NCAM亚型，即NCAM180、NCAM140和NCAM120，是同一初级转录本的选择性剪接变体，仅在其胞质区存在差异。在中枢神经系统（CNS）中，NCAM是主要的多聚唾液酸化分子（> 95%），带有长链、带负电荷的唾液酸同聚物。当唾液酸聚合度n > 10时称为多聚唾液酸（PSA），但也存在较短的寡聚结构，同样具有生物学意义。在中枢神经系统中表达的其他多聚唾液酸化蛋白包括SynCAM1²⁶、神经纤毛蛋白-2（NRP-2）^27,28以及一种钠离子通道亚基²⁵（综述见²⁹）。

本文所述方法可用于鉴定含特定κ（Vκ）轻链的人和小鼠免疫球蛋白的抗原，这些轻链包括人源抗体的VκI、VκIII或VκIV轻链，以及小鼠抗体的VκI轻链，而无需考虑抗体的同种型（例如 IgG、IgM、IgA、IgD或IgE）。该限制源于在IgM同种型抗体的免疫沉淀中使用了蛋白L琼脂糖。替代策略可包括使用甘露糖结合凝集素，或使用共价连接至琼脂糖珠的次级IgG抗IgM抗体，这些方法可能扩展本方法的应用范围，使其适用于更多含λ（λ）轻链的IgM抗体（见讨论部分）。健康个体血清中IgM Vκ轻链与IgM λ轻链的比例为1.5:1³⁰。

根据此处用于分离、富集和免疫学检测特定分子的色谱方法³¹，所有抗原必须至少包含一个小的蛋白质结构域。抗体的特异性结合表位可位于该蛋白质结构域内部或外部（例如，在糖蛋白、脂蛋白中）。为鉴定HIgM12的特异性抗原并缩小潜在候选分子范围，所采用的初步生化步骤是本方法中最关键的环节。文中以胶质细胞为例描述了细胞类型特异性的制备方法及基于细胞形态学的鉴定特征，但该方法可推广应用于中枢神经系统内或外的其他细胞类型。

迫切需要开发新的或改进的技术，以适用于越来越多具有治疗潜力的IgM抗体，特别是在那些抗体靶点为碳水化合物或脂质结构的人类疾病（占IgM抗原的大多数情况）中。

方案

动物实验方案和操作均遵循美国国立卫生研究院指南，并经梅奥诊所机构动物护理和使用委员会批准（梅奥IACUC方案编号 #A51912）。

1. 中枢神经系统组织的一般制备

1. 通过杂合子交配获得C57/Bl6背景的NCAM缺陷型（KO）小鼠（由美国俄亥俄州克利夫兰市凯斯西储大学Lynn Landmesser博士惠赠）、杂合型NCAM小鼠以及野生型（WT）同窝小鼠（C57/Bl6）。NCAM基因敲除小鼠的基因分型方法此前已有报道^32-34，此处不再详述。

注意：步骤 1.2 - 1.6 为可选步骤。

2. 手术前，通过腹腔注射（使用27号针头和1 ml注射器）给予戊巴比妥钠溶液（储备液：25 mg/ml；出生后早期和成年阶段分别使用50/100 µl）。
3. 等待2分钟，或直至动物达到外科麻醉水平。在每台手术过程中，根据需要追加麻醉剂以维持外科麻醉深度。采用脚趾夹捏反应法判断麻醉深度。动物必须无反应后方可继续操作。
4. 在肋骨下方的皮肤和腹壁处做一长度为0.5–1 cm的侧向切口。小心将肝脏与膈肌分离。使用弯头钝头剪刀在膈肌上做一小切口。沿整个肋骨长度继续剪开膈肌，以暴露胸膜腔。
5. 将弯头钝头剪刀置于肋骨一侧，小心推开肺组织，沿肋骨剪至锁骨。在对侧进行类似切口。抬起胸骨，小心修剪其与心脏之间相连的任何组织。
6. 使用虹膜剪在动物右心房做一切口，尽可能扩大流出通道。使用配备27号针头的10 ml注射器，缓慢向左心室注入10 ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）（淡红色；流速：1 ml/min）。灌注过程中切勿增加压力或PBS流速，以免造成组织损伤。
7. 使用手术剪将新生小鼠断头处死。
8. 用镊子夹住眼眶，将小剪刀插入脊柱，取出脑组织。在耳平面对颅骨向前剪开。剥离颅骨，轻柔地将脑组织放入盛有10 ml冰上预冷的解剖液的60 mm培养皿中（表1）。将每个脑组织放入1.5 ml微量离心管中，并立即置于干冰（-79 ºC）中保存。
9. 在冰上使用洁净的剃须刀片从冷冻脑组织上切下小脑和脑干。操作应迅速，避免组织解冻。
10. 称量冷冻的大脑皮层，放入冰上的15 ml离心管中，并加入预冷的裂解缓冲液（见表1），使最终浓度为每µl裂解缓冲液含150 µg脑组织。对剩余的大脑皮层重复此步骤。在步骤1.9至1.11期间，始终将脑组织保持在冰上。
11. 通过1 ml移液器枪头反复吹打（10次）进行裂解，随后使用配备27号针头的5 ml注射器反复吹打（10次），以在裂解缓冲液中匀浆脑组织。将脑裂解物在冰上额外孵育30分钟，以确保组织完全裂解。
12. 通过连续离心（在4 °C下，19,000 × g离心10分钟，共四轮）去除去污剂不溶性物质和脑脂质。每次离心后弃去含有白色髓鞘和细胞碎片的沉淀，保留上清液。将脑裂解物分装后于-80 ºC保存。

2. 使用人源IgM（HIgM12及同型对照IgM）进行免疫沉淀 "下拉" 来自野生型和NCAM基因敲除小鼠脑组织裂解液的处理剂

1. Protein L 琼脂糖珠的制备^9,35,36
   1. 配制含 BSA 的 200 ml 免疫沉淀缓冲液（见表 1）。另配制 200 ml 相同成分但不含 BSA 的免疫沉淀缓冲液。
   2. 每次免疫沉淀反应，使用 200 µl 移液器将 100 µl Protein L 琼脂糖浆液转移至 1.5 ml 微量离心管中。切勿涡旋 Protein L 琼脂糖珠！向每管中加入 1 ml 免疫沉淀缓冲液（见表 1）。通过手动倒置混合 Protein L 琼脂糖与免疫沉淀缓冲液（5 次）。
   3. 在台式离心机中以 1,000 × g 离心 2 分钟（25 ºC）洗涤 Protein L 琼脂糖珠 4 次。使用 200 µl 移液器小心吸除上清液，避免扰动琼脂糖沉淀。重复步骤 2.1.2 至 2.1.3 三次。
   4. 将 Protein L 琼脂糖珠加入 1 ml 新鲜免疫沉淀缓冲液中，于 4 ºC 在滚轴混合仪上孵育过夜以达到平衡。
2. 抗体-抗原-Protein L 琼脂糖复合物的形成及 Western 印迹中抗原的检测
   1. 在 1.5 ml 微量离心管中，将约 30 mg 裂解的脑组织（约 200 µl 裂解液）与 20 µg IgM 抗体（HIgM12）溶于 1 ml 冰冷的免疫沉淀缓冲液中，于 4 ºC 在滚轴混合仪上孵育过夜。
   2. 将步骤 2.1.4 中的 Protein L 琼脂糖珠在台式离心机中以 1,000 × g 离心 2 分钟（4 ºC），使用 200 µl 移液器小心吸除上清液，避免扰动琼脂糖沉淀。使用 1 ml 移液器将经冷却的抗体-脑组织裂解液（来自步骤 2.2.1）加入 Protein L 琼脂糖珠中。
   3. 将抗体-抗原-Protein L 琼脂糖悬浮液于 4 ºC 在滚轴混合仪上孵育 2 小时。以 1,000 × g 离心 2 分钟（4 ºC）洗涤结合在琼脂糖 L 上的抗体-抗原复合物。小心吸除上清液，避免扰动沉淀，然后加入 1 ml 含 0.2% BSA 的冰冷免疫沉淀缓冲液。
   4. 使用含 0.2% BSA 的冰冷免疫沉淀缓冲液再洗涤一次，随后使用不含 BSA 的冰冷免疫沉淀缓冲液再洗涤两次。
   5. 以 1,000 × g 离心 2 分钟（4 ºC）沉淀结合在琼脂糖 L 上的抗体-抗原复合物。首先使用 200 µl 移液器完全吸除上清液，直至沉淀上方剩余约 50 µl 溶液，再使用 10 µl 移液器吸除残余液体。将样品置于冰上保存。
   6. 每 1.5 ml 微量离心管中加入 40 µl 免疫沉淀洗脱缓冲液（见表 1），用手指轻弹管壁 6 次，于 95 ºC 加热 5 分钟。将样品置于冰上 2 分钟，然后以 13,000 × g 离心 30 秒（4 ºC）。
   7. 使用 10 µl 移液器将上清液（约 35 µl 总体积）转移至新的 1.5 ml 微量离心管中，避免扰动沉淀。通过将少量洗脱样品沿管壁冲洗，确认 Protein L 琼脂糖珠是否残留。
      注意："颗粒状" Protein L 琼脂糖珠若存在则清晰可见。
   8. 若检测到 Protein L 琼脂糖珠，再次以 13,000 × g 离心 30 秒，将上清液转移至洁净管中。重复此步骤直至无法检测到琼脂糖珠。
   9. 每孔上样 10–20 µl 洗脱样品，使用 Tris/Glycine/SDS 缓冲体系在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳（见表 1）。
      注意：检测 PSA-NCAM 或 NCAM 亚型时，使用 7.5% 或 4–20% 梯度凝胶，每孔上样体积为 50 µl（凝胶尺寸（宽 × 长 × 厚）：8.6 × 6.7 × 0.1 cm）。
   10. 在室温下以 100 V（1.74 V/cm²）电泳约 1 小时。此步骤无需额外冷却^37,38。
   11. 在低温室中使用冷转移缓冲液（5–10 ºC）以 100 V（1.74 V/cm²）将蛋白质转移至 PVDF（聚偏二氟乙烯）膜（孔径 0.45 µm）2.5 小时（见表 1）。
   12. 在室温下，使用含 10%（w/v）脱脂奶粉的 PBS-T 封闭膜 1 小时，用 PBS-T 洗涤两次，每次 10 分钟，随后在含 5% BSA 的 PBS-T 中加入一抗，于低温室中在摇床上孵育过夜。
   13. 次日早晨，先在室温下用大量 PBS-T 快速短暂洗涤一次膜（包括盖子和容器），然后在摇床上以 80 rpm 用 PBS-T 洗涤 3 次，每次 10 分钟（所有洗涤步骤均在 25 ºC 进行）。
   14. 在含 5% 脱脂奶粉的 PBS-T 中加入二抗（辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗人 IgM 抗体（用于 HIgM12），稀释比例 1:30,000），于室温在摇床上（70 rpm）孵育 1 小时。
   15. 在室温下用大量 PBS-T 快速短暂洗涤一次膜（包括盖子和容器），然后在摇床上以 80 rpm 用 PBS-T 洗涤 3 次，每次 10 分钟（所有洗涤步骤均在 25 ºC 进行），充分洗涤。
   16. 在 25 ºC 下，将 1 ml 冷却的增强型化学发光 HRP 底物组分 A（增强型鲁米诺试剂）与 1 ml 组分 B（氧化试剂）（每张小型印迹）混合均匀。
   17. 使用塑料镊子将膜转移至纸巾上以去除多余液体（仅夹持边缘）。用纸巾擦干容器，将膜放回容器中（每张膜一个容器）。立即向每张膜加入 2 ml 预混的增强型化学发光 HRP 底物（A+B 混合液）（步骤 2.2.16），于 25 ºC 在摇床上（90 rpm）孵育 2 分钟。确保化学发光试剂均匀润湿膜表面。
   18. 将膜转移至透明塑料夹层袋中，用纸巾去除多余液体和气泡。将膜放入胶片暗盒中，并用胶带将塑料袋固定于暗盒内。关闭暗盒。
   19. 将暗盒、胶片、计时器和剪刀带入暗室。剪去每张胶片的右上角以作方向标记，使用不同曝光时间（10 秒、1 分钟、10 分钟）曝光多张胶片，并在胶片显影仪中显影。

3. 多聚唾液酸附着于NCAM后的内切神经氨酸酶-NF消化 ³⁹

1. 使用神经氨酸酶-NF（ENDO-NF）在冰上消化来自出生后第7天（P7）野生型小鼠和P7 NCAM基因敲除小鼠的裂解脑组织（来自步骤1.12的样品），持续2小时，具体操作如表2³⁹所示。
2. 向步骤3.1中编号为1至6的每根离心管中加入5 µl的4x Laemmli上样缓冲液（表2）。
3. 将样品上样至4–20%的梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶，并重复步骤2.2.10至2.2.19。使用HIgM12（1 µg/ml）、市售抗PSA单克隆抗体（克隆号2-2B）（1 µg/ml）以及β-actin抗体（作为上样对照）（1 µg/ml），在含5% BSA的PBS-T溶液中孵育膜。

4. 大鼠和小鼠中枢神经系统培养物的制备

1. 玻璃盖玻片的制备
   1. 在通风橱中，使用玻璃容器将25 mm的玻璃盖玻片在1 M HCl中于50 - 60 ºC酸洗4 - 16小时。期间偶尔轻轻晃动以搅动盖玻片。
   2. 用蒸馏水彻底清洗玻璃盖玻片（3次）。确保清洗叠放盖玻片之间的酸液。
   3. 在细胞培养罩内用100%乙醇冲洗盖玻片，并在Parafilm上晾干。使用前一日，将盖玻片置于带盖玻璃容器中，在烘箱内100 °C加热24小时。
   4. 将玻璃盖玻片放入6孔板中，加入3 ml浓度为40 µg/ml的多聚-D-赖氨酸 sterile water 溶液，37 ºC孵育1小时。
   5. 用无菌水洗涤两次，在细胞培养罩内彻底干燥，并用紫外光照射20分钟。
2. 中枢神经系统细胞培养用塑料器皿的制备
   1. 用60 mm细胞培养皿或75 cm²培养瓶进行包被² 分别在37 ºC下，用3 ml或10 ml无菌水中含40 µg/ml多聚-D-赖氨酸处理组织培养瓶1小时。
   2. 用清水洗涤两次，在细胞培养罩内彻底干燥，并用紫外光照射20分钟。
3. 大鼠混合胶质细胞分离 ⁴⁰
   1. 在符合IACUC标准的啮齿类动物安乐死舱内，使用CO对新生大鼠进行麻醉₂ 气体供应（完全自动化）。采用脚趾夹捏反应法判断动物是否失去反应。断头处死新生Sprague Dawley大鼠（P0P1期）（每次6–10只仔鼠）。
   2. 用镊子夹住眼眶，将小剪刀插入脊柱，取出脑组织。在耳平面对颅骨向前剪开。剥开颅骨，将脑组织轻轻放入盛有10 ml冰上预冷的解剖液的60 mm培养皿中（见 表1).
   3. 对剩余的幼鼠（6 - 10 只）重复上述操作。在步骤 4.3.2 - 4.3.7 中将组织置于冰上保存。
   4. 沿中线将大脑分为两个大脑半球，随后用杜蒙镊子切除嗅球、大脑皮层下方的基底神经节以及海马体。将分离出的大脑皮层置于含有解剖液、置于冰上的洁净培养皿中。
   5. 取一个大脑皮层组织，在解剖显微镜下用细尖镊子去除脑膜。
   6. 用剩余的脑皮层重复上述操作。将所有去脑膜的脑皮层置于一个干净的、盛有冰的培养皿中。
   7. 将所有幼鼠的大脑半球合并于一个60 mm的培养皿中，用无菌剃刀片将脑组织切成约1 mm大小的碎块。
   8. 使用10 ml移液管将剪碎的脑组织转移至无菌未包被的500 ml玻璃烧瓶中，每只大鼠脑组织加入10 ml冰冻解剖液。每只大鼠脑组织用9 ml HBSS（Hank's平衡盐溶液）稀释1 ml胰蛋白酶溶液（5 mg/ml胰蛋白酶），在加入过程中轻轻摇动烧瓶。加入终体积2%的DNase I溶液（1 mg/ml）和终体积2%的MgSO₄₄ 溶液（3.82% MgSO₄）₄ 向脑组织悬液中加入 HBSS（w/v）并轻轻混匀。
   9. 在37 ºC下，于旋转摇床中轻轻振荡消化组织30分钟。此步骤中需确保组织块保持悬浮状态，不沉降至底部。必要时可提高旋转速度。
   10. 加入胎牛血清（FBS），使其终浓度为10%（v/v），通过轻轻旋转培养瓶10次（每次10秒）混匀。将组织悬液置于冰水混合物中冷却15分钟。每隔1分钟轻柔旋转培养瓶5次，重复5次。
   11. 使用25 ml或50 ml移液管将组织悬液轻柔转移至无菌50 ml离心管中，在200 × g、4 ºC条件下离心5分钟。
   12. 弃去上清液，将消化后的中枢神经系统组织在15 ml冰冻解剖液中轻轻重悬，解剖液中添加5 ml胎牛血清和0.4 ml MgSO₄₄ 溶液（3.82% MgSO₄）₄ 在HBSS中）和1.6 ml DNase I（1 mg/ml）。
   13. 将组织悬液均分至两个无菌的15 ml离心管中（每管约10 ml），用10 ml移液器缓慢吹打10次，直至悬液变得浑浊/乳白色。处理下一管时，将细胞悬液置于冰上保存。静置3分钟，使未完全消化的中枢神经系统组织沉淀至管底。将上清液转移至干净的50 ml离心管中，注意不要扰动沉淀部分。
   14. 可选地，将浑浊的上清液通过40微米细胞筛，收集单细胞悬液至预冷的无菌50 ml离心管中。
   15. 200 × g、4 ºC 离心 5 分钟。
   16. 使用10 ml移液管轻轻吸除上清液，直至细胞沉淀上方仅剩约2 ml解离液。
   17. 用手指轻弹装有细胞沉淀的50 ml离心管（约10次）。缓慢加入5 ml预热的培养基（见 表1) 加入细胞悬液中，同时轻轻用手旋转混匀试管。
   18. 可选：在冰上用新鲜的DNase I溶液和MgSO₄重复步骤4.3.12，额外孵育10分钟。₄若出现可见的组织团块或DNA凝块，请重悬于溶液中。每间隔1分钟手动轻轻旋转混匀5次。
   19. 在6孔板中，将40,000个细胞接种于25 mm圆形盖玻片上，加入400 µl培养基形成液滴，置于细胞培养箱（5% CO₂）中孵育30分钟使细胞贴壁。₂，37 ºC。
   20. 对于已汇合的（铺板后24–48小时）60 mm细胞培养皿和75 cm²培养瓶² 组织培养瓶，接种500,000个细胞（60 mm培养皿）或200万个细胞（75 cm²）² 瓶
   21. 轻轻加入 2 ml（每孔，6 孔板中 25 mm 玻璃盖玻片）、3 ml（60 mm 培养皿）或 10 ml（75 cm² 培养瓶）预热的 1× PBS。² 向每个孔中加入温热的培养基。将细胞培养过夜，次日早晨完全更换培养基，之后每隔一天更换一次培养基（第3天、第5天、第7天， 等等。).
       注意：大鼠混合胶质细胞培养物在接种后24–48小时即可用于免疫细胞化学或生物化学实验。
4. 小鼠混合胶质细胞培养
   1. 与第4.3.1至4.3.6节所述新生大鼠脑组织解剖方法相同，对背景为C57/Bl6的P0期野生型（WT）和NCAM基因敲除（KO）小鼠进行断头，取出脑组织并置于冰上预冷的解剖液中（见 表1). 始终将组织置于冰上。
   2. 沿中线将大脑分为两个大脑半球，随后使用Dumont镊子切除嗅球、大脑皮层下方的基底神经节以及海马体。将分离出的大脑皮层置于含有冰上HBSS的洁净培养皿中。
   3. 取一个大脑皮层组织，置于解剖显微镜下，用尖头镊子去除脑膜。对剩余的皮层组织重复此操作。将所有去除了脑膜的皮层组织放入一个洁净的、置于冰上的培养皿中。
   4. 将每只小鼠的皮层半球用1 ml移液器转移至各自独立的无菌15 ml离心管中。向每份脑组织中加入1.2 ml冰上预冷的解剖液，使用1 ml移液器枪头将组织上下吹打2次，进行机械性解离。
   5. 加入150 µl木瓜蛋白酶溶液（10 mg/ml，PBS配制）、100 µl DNase I溶液（1 mg/ml，HBSS配制）和50 µl MgSO₄₄ (以HBSS中3.82%的浓度)加入每份脑组织，通过轻弹管壁混匀。
   6. 将脑组织悬液在37 ºC水浴中孵育30分钟，每隔2分钟用手指轻弹混匀一次。每管加入1 ml FBS，混匀后将组织悬液置于冰上冷却10分钟。
   7. 在 4 ºC 条件下以 200 × g 离心 4 分钟，沉淀脑组织，然后将组织沉淀重悬于 1 ml 冰冷的解剖缓冲液中，该缓冲液中添加有 70 µl DNase I 溶液（1 mg/ml 溶于 HBSS）和 30 µl MgSO₄₄ 溶液（HBSS 中 3.82%）
   8. 使用经FBS包被的1 ml移液枪头轻轻吹打脑组织（约5次），直至上清液变浑浊。将上清液经40微米细胞滤网过滤后，转移至预冷的洁净离心管中，置于冰上。
   9. 将混合胶质细胞以200 × g离心5分钟，4 ºC。吸除上清液，保留约100 µl培养基覆盖在细胞沉淀上。用手指轻弹管底重悬细胞沉淀（约5次），加入1 ml预热的小鼠生长培养基（参见 表1).
   10. 必要时，可轻轻吹打细胞悬液（上下吹打5次），以溶解可见的细胞团块及裂解细胞/沉淀的DNA。
   11. 将小鼠混合胶质细胞接种于PDL包被的玻璃盖玻片或60 mm培养皿中，具体操作见步骤4.3.19 - 4.3.21。次日早晨用预热的小鼠生长培养基洗涤细胞，之后每隔一天洗涤一次。接种后48 - 72小时，小鼠混合胶质细胞即可用于免疫细胞化学实验。
5. 大鼠小胶质细胞分离
   1. 在75 cm²培养瓶中培养大鼠混合胶质细胞² 生长培养基中的组织培养瓶（参见 表1）培养10天。将混合胶质细胞培养物置于细胞培养箱（5% CO₂）内的旋转摇床中，振荡去除小胶质细胞团块。₂，37 ºC）下以140 rpm振荡培养1小时。
   2. 从混合胶质细胞培养物中移除含有小胶质细胞的上清液，经40微米细胞滤网过滤，将细胞悬液收集于无菌50 ml离心管中。
      注意：小胶质细胞培养通常 > 此步骤后纯度达95%，仅含少量污染性少突胶质前体细胞和极少数星形胶质细胞。
   3. 可选步骤：为后续进行小胶质细胞振荡分离，更换混合胶质细胞培养物的生长培养基。通常从混合胶质细胞培养物中多次进行小胶质细胞振荡分离（每周一次）。
   4. 可选步骤：若需获得高于95%的纯度，可将含小胶质细胞的上清液（步骤4.5.2）每10 ml接种至100 mm培养皿中，置于细胞培养箱内37 ºC孵育30 min。此过程中仅有小胶质细胞贴附于培养皿表面，而星形胶质细胞和少突胶质前体细胞（OPCs）仍保留在上清液中。
   5. 在细胞培养操作台中，将培养皿顺时针和逆时针方向轻轻摇晃（每个方向各5次）。彻底吸除细胞培养基，更换为10 ml新鲜生长培养基。所得的小胶质细胞培养物为 > 98% 纯度。
   6. 在添加1% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养小胶质细胞，最长可培养7天。
6. 大鼠少突胶质前体细胞/少突胶质细胞分离
   1. 首先从培养10天的75 cm²混合胶质细胞培养物中振荡去除小胶质细胞，以获得高度富集的少突胶质前体细胞（OPC）培养物² 细胞培养箱中的旋转摇床上的培养瓶（5% CO₂）₂，37 ºC）下以140 rpm振荡培养1小时。弃去仅含小胶质细胞的上清液，或用于小胶质细胞特异性实验（见步骤5.5）。
   2. 将含有小胶质细胞的上清液替换为10 ml生长培养基，在旋转摇床（200 rpm）上以5% CO₂条件继续振荡混合胶质细胞培养18小时₂，37 ºC。
   3. 从混合胶质细胞培养物中收集含有小胶质细胞和少突胶质前体细胞的上清液，经40微米细胞滤网过滤，将细胞悬液收集至无菌50 ml离心管中。
   4. 可选步骤：为后续少突胶质前体细胞振脱，更换混合胶质细胞培养物的生长培养基。
      注意：少突胶质前体细胞（OPCs）在星形胶质细胞饲养层上可继续增殖，并可每周一次再次振脱收集第二、第三次，但产量较低。
   5. 将含有小胶质细胞和少突胶质前体细胞（OPC）的上清液10 ml接种至100 mm培养皿中，置于37 ºC细胞培养箱中孵育30 min。小胶质细胞将贴附于培养皿表面，而少突胶质前体细胞和星形胶质细胞则保留在上清液中。
   6. 在细胞培养操作台中，轻轻顺时针和逆时针摇动培养皿（各5次）。每次仅从细胞培养箱中取出少量培养皿（在较冷的培养基中剧烈摇动时，小胶质细胞会开始从培养皿上脱落）。
   7. 收集含OPC的上清液，并转移至50 ml离心管中合并。可选步骤：向培养皿中添加培养基，用于小胶质细胞特异性实验。
   8. 可选步骤：为进一步提高少突胶质前体细胞（OPC）培养物的纯度，可使用新的培养皿重复步骤 5.6.5 和 5.6.6 一次，以减少 OPC 制备物中小胶质细胞的数量。
   9. 在4 ºC、250 × g条件下，将含有富集OPC的上清液于离心机中离心5分钟。小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。在沉淀上方保留3 ml上清液，开始通过手指轻弹管壁的方式重悬OPCs（10次）。
   10. 使用10 ml移液器轻轻吹打OPC细胞团块（5-10次）。
   11. 计数细胞，并在6孔板中每张25 mm玻片（PDL包被）上用400 µl生长培养基悬液接种50,000个少突胶质前体细胞（OPC），置于细胞培养孵箱（5% CO₂）中孵育30分钟，使细胞贴壁₂，37 ºC）。轻轻加入2 ml预热的增殖培养基（参见 表1) 加入每个孔中。对于PDL包被的60 mm细胞培养皿，将1–1.5×10⁶个OPC接种于3 ml增殖培养基中。
   12. 在少突胶质前体细胞（OPCs）接种后3小时，小心地将含FBS的增殖培养基更换为新鲜的增殖培养基（确保OPCs已充分贴壁，且在换液过程中未发生脱落）。每隔两天更换一次培养基。
       注意：采用本方案制备的大鼠OPC培养物纯度通常为90%，主要污染细胞类型为小胶质细胞，其次为星形胶质细胞。

5. 在原代胶质细胞中使用 HIgM12 进行免疫细胞化学

1. 使用 HIgM12、抗 PSA 单克隆抗体及细胞类型特异性标志物对来自野生型和 NCAM 基因敲除小鼠的原代胶质细胞进行三重免疫荧光标记
   1. 在活细胞条件下，将生长于多聚赖氨酸包被的 25 mm 玻璃盖玻片上的野生型（WT）和 NCAM 基因敲除（KO）小鼠混合胶质细胞培养物（汇合度约 60%），用 HIgM12（10 µg/ml）和抗 PSA 单克隆抗体（克隆号 2-2B）（10 µg/ml）在含 10% 胎牛血清（FBS）的 PBS 中，4 ºC 孵育 30 分钟进行标记。
   2. 用含 10% FBS 的冰浴 PBS 洗涤细胞三次，每次 20 秒，随后在 pH 7.4 的 PBS 中加入 4% 多聚甲醛，于 25 ºC 固定 15 分钟。
   3. 用含 10% FBS 的 PBS 洗涤固定后的细胞两次，每次 1 分钟，然后在 pH 7.4 的 PBS 中加入 0.1% Triton-X100，于 25 ºC 透化处理 2 分钟。再次用 PBS 洗涤两次，每次 1 分钟，随后在含 10% FBS 的 PBS 中加入胶质细胞特异性标志物 GFAP（星形胶质细胞）或 IBA-1（小胶质细胞）（1 µg/ml），于 4 ºC 冷室中避光孵育过夜。
   4. 按照标准免疫荧光流程进行后续操作，包括使用含 DAPI 的封片介质³¹。
      注意：强烈推荐使用荧光标记的 Fab₂ 片段作为人源（HIgM12）和鼠源（抗 PSA 单克隆抗体，克隆号 2-2B）IgM 的二抗。
   5. 以 60X 或 100X 放大倍数采集荧光图像。所有图像应使用相同的仪器参数设置，并以相同方式处理。
2. 使用 HIgM12 作为一抗对经 ENDO-NF 处理的野生型胶质细胞进行免疫荧光标记
   1. 将野生型小鼠混合胶质细胞接种于多聚赖氨酸包被的 25 mm 玻璃盖玻片上，在 Neurobasal A 培养基中添加 10% FBS 和 B27 补充剂（1:50）培养 3 天。向 1 ml 培养基中加入 ENDO-NF（30 µg/ml），在细胞培养箱（37 °C，5% CO₂）中孵育过夜。
   2. 按照步骤 5.1.1 至 5.1.5 所述方法，在低温条件下对细胞进行活标记（使用 HIgM12），并在固定和透化后标记星形胶质细胞内标志物 GFAP。以 60X 或 100X 放大倍数采集荧光图像。所有图像应使用相同的仪器参数设置，并以相同方式处理。

结果

本部分展示了通过研究中枢神经系统中人IgM特异性PSA抗原可获得的结果示例。展示了在生化实验条件下及荧光免疫细胞化学中使用含特异性Vκ轻链的人IgM抗体的方法。

HIgM12 可从脑组织裂解液中免疫沉淀其抗原，并在蛋白质印迹中作为检测试剂（一抗）。同型对照抗体和琼脂糖 L 珠均未免疫沉淀出类似抗原，表明该免疫沉淀具有特异性图1）。使用野生型（WT）和NCAM基因敲除（KO）小鼠的中枢神经系统（CNS）裂解物进行的Western印迹实验表明，HIgM12特异性结合含有PSA的NCAM（图2A). 利用ENDO-NF对野生型小鼠中枢神经系统组织进行酶消化，鉴定出NCAM上的PSA是HIgM12的特异性结合表位图2B). 采用本文所述方法，可获得高纯度的 IBA-1 阳性大鼠小胶质细胞培养物（图3）。市售的抗PSA抗体（克隆2-2B）通过荧光显微镜检测，在固定并通透处理的IBA-1阳性小胶质细胞中，无法标记细胞表面或细胞内的PSA蛋白池。该结果与既往文献报道一致，文献指出小胶质细胞不表达PSA-NCAM于细胞表面。 ^16,41 HIgM12 不与纯化的大鼠小胶质细胞表面抗原结合。有趣的是，HIgM12 对经固定和透化处理的小胶质细胞进行标记时，呈现出非特异性细胞器限制的胞内近核周分布模式图3结果与使用抗PSA IgG抗体（克隆735）所获得的结果相反 ²⁶，该靶点作用于小胶质细胞高尔基体水平的PSA-SynCAM ⁴¹.

与小胶质细胞不同，在活细胞条件下，HIgM12 和 A2B5 可靶向高度富集的大鼠 OPC 培养物中的细胞表面抗原（图4OPC 培养物中含有约 5% 的污染性小胶质细胞。 图5 在GFAP阳性星形胶质细胞中，HIgM12与抗PSA单克隆抗体（克隆号2-2B）显示出几乎相同的细胞表面染色模式（图 5A）。使用HIgM12对经ENDO-NF消化的野生型星形胶质细胞与缓冲液对照处理的野生型星形胶质细胞进行免疫荧光标记，结果显示星形胶质细胞表面存在PSA图5B)。PSA阳性星形胶质细胞的存在 体内 仍需进一步验证。

图 1：HIgM12 在免疫沉淀中作为“拉下”试剂。 使用 HIgM12、人源同型对照 HIgM126 或仅琼脂糖 L 珠作为“拉下”试剂，从三个月龄小鼠的全脑裂解液中进行免疫沉淀。洗脱的蛋白质通过 Western 印迹分析，膜用 HIgM12 探针进行检测。从 HIgM12 包被珠上洗脱的蛋白质分子量范围为 160–200 kDa，此外还有 IgM 的重链（~65–73 kDa）。该图改编自 J. Neurochem.¹⁵。 请点击此处查看此图的放大版本。

图2：HIgM12 靶向 NCAM 上的多聚唾液酸（PSA）部分。A. 分别提取出生后第7天（P7）、第13天（P13）、第16天（P16）和第27天（P27）的 NCAM 全基因敲除小鼠及其杂合子同窝对照小鼠的脑组织匀浆，进行 Western 印迹分析，使用 HIgM12、PSA 抗体以及 β-actin（作为上样对照）对膜进行探查。B. 将 10 µg 成年野生型（WT）小鼠脑裂解液（溶于含 1% NP40 的 PBS 中，pH 6.5）分别在 37 ºC 下与内切神经氨酸酶 N（ENDO-N）、具有 α2-3 多聚唾液酸聚合物特异性的（外）神经氨酸酶（Sialidase）或 PBS 缓冲液孵育过夜，每组设置重复样本，进行 Western 印迹分析，并用 HIgM12、PSA 和 β-actin 抗体探查（β-actin 作为上样对照）。该图改编自 J. Neurochem.¹⁵。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：大鼠小胶质细胞缺乏PSA的现象与HIgM12标记缺失一致。 将大鼠小胶质细胞在聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上培养48小时，随后在冰上对活细胞进行HIgM12标记，或在固定后使用HIgM12或抗PSA单克隆抗体（克隆号2-2B）标记。细胞经三重标记：小胶质细胞标志物IBA-1（绿色）、HIgM12/PSA（红色）以及DAPI（蓝色）。图像显示，HIgM12在大鼠原代小胶质细胞表面无结合信号（上排），抗PSA抗体（克隆号2-2B）在细胞表面及胞内储存部位均无结合信号（下排）。根据双极形态及IBA-1染色缺失，下排中少量PSA阳性细胞被推测为少突胶质前体细胞（OPC）。在固定细胞中，HIgM12染色呈现点状、围绕核周的分布模式，不局限于特定细胞器，被认为是非特异性结合（中排）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4： HIgM12 靶向大鼠 OPCs 细胞表面的 PSA-NCAM。 将大鼠 OPCs 和小胶质细胞在聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，于增殖培养基中培养 4 天，并在冰上对活细胞进行三重标记：HIgM12 或 A2B5（绿色）、巨噬细胞/单核细胞内标记物 CD68（克隆 ED-1）（红色）以及 DAPI（蓝色）。图像显示主要表达 OPC 标记物 A2B5（上排）和 HIgM12（下排）的细胞群体，仅有少量 CD68 阳性的小胶质细胞（约 5%）。添加相差显微图像和 DAPI 图像以显示各细胞群体的完整性及细胞数量。请点击此处查看该图的放大版本。

图5： HIgM12与抗PSA单克隆抗体在小鼠混合胶质细胞中共标记一类星形胶质细胞亚群。A. 来自野生型（WT）和NCAM全基因敲除（KO）小鼠的混合胶质细胞，包含星形胶质细胞、少突胶质细胞系细胞和小胶质细胞，培养3天后，在冰上进行活细胞标记，使用HIgM12（绿色）、抗PSA单克隆抗体（克隆号2-2B）（红色），随后标记星形胶质细胞标志物GFAP（紫色）和DAPI（蓝色）。HIgM12与抗PSA抗体在GFAP阳性的野生型星形胶质细胞上显示出几乎完全一致的染色模式，但在NCAM基因敲除小鼠的培养星形胶质细胞上无结合信号。本图改编自J. Neurochem.¹⁵。 B. 混合胶质细胞培养条件同A部分所述，并在夜间用神经氨酸酶-NF（endoneuraminidase-NF，由Dr. Martina Muehlenhoff惠赠）或PBS对照处理。细胞在冰上进行活细胞标记，使用HIgM12（绿色），随后染色检测胞内标志物GFAP（红色）和DAPI（蓝色）。HIgM12可靶向PBS对照处理的混合胶质细胞培养物中的细胞表面抗原，但在经神经氨酸酶-NF处理的混合胶质细胞中无结合。本图改编自JNSCI¹⁶。 请点击此处查看该图的放大版本。

所有图像均使用相同的仪器设置在 60 倍放大倍数下拍摄，并以相同方式处理。

表1：缓冲液与溶液配方。 请点击此处下载该表格。

	中枢神经系统组织	ENDO-NF/PBS	裂解缓冲液	总体积
1. WT 小鼠	67 µg (0.45 µl)	2 µl (12 µg) ENDO-NF	7.55 µl	10 µl
2. WT 小鼠	67 µg (0.45 µl)	2 µl PBS	7.55 µl	10 µl
3. WT 小鼠	67 µg (0.45 µl)	无 PBS 或 ENDO-NF	9.55 µl	10 µl
4. NCAM KO 小鼠	67 µg (0.45 µl)	2 µl (12 µg) ENDO-NF	7.55 µl	10 µl
5. NCAM KO 小鼠	67 µg (0.45 µl)	2 µl PBS	7.55 µl	10 µl
6. NCAM KO 小鼠	67 µg (0.45 µl)	无 PBS 或 ENDO-NF	9.55 µl	10 µl

表2：P7野生型小鼠和NCAM基因敲除小鼠中枢神经系统组织的ENDO-NF消化。

讨论

人天然IgM自身抗体是免疫治疗的理想候选分子，已显示出治疗多种疾病（包括癌症和中枢神经系统疾病）的治疗潜力^1-7。这些抗体的优势在于不会引发免疫反应，从而避免中和抗体的产生，而中和抗体的生成会显著降低有效治疗剂量和疗效。尤为重要的是，所有具有治疗潜力的抗体均为IgM同种型，并属于天然抗体（NAb）库^{3-5,8,9,37,40,42-45}。IgM抗体在潜在临床应用中的主要障碍在于其抗原的鉴定，而许多情况下这些抗原仍不明确。通常用于IgG抗体的标准化技术往往不适用于鉴定IgM的抗原。

本方案描述了PSA-NCAM作为再生性人源IgM抗体HIgM12抗原的鉴定过程，该抗体在多发性硬化症（MS）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）的动物模型中具有疗效^15-18。所采用的方法主要适用于所有具有特异性Vκ轻链VκI、VκIII和VκIV的人源抗体，以及具有VκI轻链的小鼠抗体，而与抗体的同种型无关。

本方案中最关键的步骤是IgM抗体在亲和层析中的应用。更具体地说，需要成功的抗体作为下拉试剂，在免疫沉淀中从复杂的组织或细胞培养裂解液中分离或富集抗原。富集的抗原组分可与同型对照抗体的免疫沉淀产物进行比较，并通过质谱分析其差异。该步骤的一个基本要求或限制是必须存在正确的抗体Vκ轻链及宿主（人、小鼠），以使抗体能够结合蛋白L琼脂糖。使用与琼脂糖偶联的甘露糖结合蛋白（也称为甘露糖结合凝集素）替代蛋白L琼脂糖，可能是免疫沉淀不含特定Vκ轻链的IgM抗体的一种潜在替代方法。然而，正如Arnold et al.³⁵ 所述，抗原结合型IgM抗体无法与甘露糖结合蛋白结合，因为当IgM与其抗原结合后，目标糖链似乎变得不可接近。基于这些发现，甘露糖结合蛋白不能用作免疫沉淀负载抗原的IgM分子的结合基质³⁵。其他可能的替代方法包括使用琼脂糖偶联的二抗抗IgM IgG抗体^46,47，或使用表面活化的磁珠⁴⁸。针对IgM的IgG抗体可通过化学交联固定于琼脂糖A或琼脂糖G上，以减少目标抗原共洗脱的抗体量。由于大多数免疫沉淀实验旨在分离或耗竭IgM，而并不关注其抗原，因此很难对不同IgM免疫沉淀方法在成功鉴定抗原方面的表现进行恰当比较。此外，使用IgM进行的免疫沉淀主要用于通过抗体与纯化抗原的孵育来确认已知或预期的单一抗原⁴⁹。针对人IgM的琼脂糖偶联IgG抗体的一个缺点是，与起始材料相比，免疫沉淀获得的血清IgM分子产率极低（10–15%）⁵⁰。相比之下，表面活化的磁珠已成功应用于包括IgM在内的不同同型抗体，用于免疫沉淀与瘙痒病相关的纤维⁴⁸。该方法不受特定κ（Vκ）或λ（λ）链或特定宿主的限制，可显著拓宽可用于免疫沉淀的IgM抗体范围。

实验方案中的另一个重要步骤是抗体作为检测抗体（一抗）在Western印迹或其他筛选平台中发挥作用的能力。成功的抗体必须能够以足够高的亲和力靶向其抗原，从而在存在非离子型或可能为离子型去污剂的条件下仍能实现抗原结合。高亲和力抗体在经过亲和成熟过程的IgG抗体中较为常见，但在IgM同种型抗体中则较少见，这也是在生化研究背景下 commercially available 的IgM检测抗体相对较少的原因之一。高亲和力结合是分子抗原免疫共沉淀（immunoprecipitation, IP）和Western印迹的必要条件。降低IP缓冲液和裂解缓冲液中的去污剂浓度或完全不使用去污剂，可使低亲和力抗体通过其Fab区实现对抗原的识别与结合。相比之下，在不同浓度去污剂条件下，各类同种型对照抗体通过其Fc区与蛋白L琼脂糖结合的能力并未受到显著影响。然而，裂解缓冲液和IP缓冲液中去污剂浓度过低会阻碍细胞膜的破裂，进而影响特定分子的释放与分离。同样地，Western印迹洗涤缓冲液中若去污剂浓度偏低，例如， PBS-T 允许低亲和力抗体与抗原结合，但同时会增加非特异性结合，因此不可取。

抗原蛋白核心的存在是本方法的另一个必要条件。在蛋白质印迹中，可检测到具有翻译后修饰（例如，糖蛋白、脂蛋白）以及未经修饰的蛋白质，但无法检测单独的脂质或碳水化合物。无论是否存在去垢剂，均无法从组织或细胞裂解液中对脂质（例如，鞘脂类）进行免疫沉淀。由于去垢剂与脂质的理化性质极为相似，难以实现脂质与抗体之间的特异性结合；然而，去垢剂对于破坏细胞膜以实现特定分子的选择性分离又是必需的。据我们所知，迄今为止尚未有仅由碳水化合物组成且不含蛋白核心的免疫沉淀实验被报道。这一问题尤为重要，因为IgM抗体常靶向碳水化合物和糖脂，而这些分子并不一定与蛋白质单元相连。在缺乏蛋白核心的情况下，需采用其他层析技术来分离并进行脂质和碳水化合物的免疫学鉴定。例如，可通过细胞脂质的薄层层析（TLC），随后在TLC板上使用抗体进行检测（免疫-TLC）来实现这一目的^51,52。

已有研究描述了其他抗PSA抗体，并将其结果与HIgM12以及市售的抗PSA IgM（克隆号2-2B）进行了比较。在PSA研究领域最常用的抗体是一种IgG抗体（克隆号735），可作为小鼠单克隆抗体或兔多克隆抗体获得 ⁵³该抗PSA IgG抗体可检测不同中枢神经系统细胞类型（包括小胶质细胞）上SynCAM和NCAM中的PSA ⁴¹与抗PSA IgG抗体不同，人IgM抗体HIgM12、HIgM42以及抗PSA小鼠IgM（克隆2-2B）在小鼠胚胎期及出生后早期的各个阶段均无法识别SynCAM上的PSA（但在NCAM上可以），而未多聚唾液酸化的SynCAM则易于检测 ¹⁵所使用的IgM抗体也无法检测到小胶质细胞上的PSA图3和图4）。抗体亚型之间差异的可能解释是，PSA-SynCAM 的水平相较于 PSA-NCAM 较低，同时 IgM 抗体的结合亲和力可能低于抗 PSA IgG。为了验证这一假设，我们在胚胎期 E17 的 NCAM 基因敲除动物中进行了免疫沉淀实验，此时存在大量 SynCAM，并使用 HIgM12 作为抗体 "下拉试剂"¹⁵在E17野生型同窝对照中，HIgM12免疫沉淀PSA-NCAM的程度表现出相似的强度 "下拉" 通过使用洗脱抗原进行后续Western blot并采用密度测定法检测PSA-NCAM与IgM重链的比较，结果显示HIgM12对其靶标PSA至少具有足够的亲和力。与野生型同窝对照不同，HIgM12在NCAM基因敲除动物中未能检测到附着于SynCAM的PSA。使用人源抗PSA IgM（HIgM42）进行免疫沉淀实验也获得了相同的结果。HIgM12、HIgM42以及小鼠抗PSA IgM（克隆2-2B）在野生型和NCAM基因敲除动物胚胎期及出生后发育阶段的Western blot中，均无法识别与SynCAM结合的PSA。鉴于HIgM12仅需极低浓度（0.1 µg/ml）即可在使用少量中枢神经系统组织（每孔0.1 µg CNS组织）的Western blot中特异性检测到与NCAM结合的PSA ¹⁵ 似乎不太可能仅因亲和力低，就导致在三种不同方法中均完全无法通过 HIgM12 检测到 PSA-SynCAM。

我们得出结论：抗PSA IgM抗体与常被报道的抗PSA IgG抗体（克隆735）之间存在显著差异。目前尚不清楚为何过去未更频繁地使用 commercially available 抗PSA IgM抗体来验证抗PSA IgG抗体735所获得的结果。这一点尤其值得关注，因为HIgM12已在多种疾病模型中证明具有疗效。尽管其他抗PSA IgM抗体可能具有类似的治疗效果，但抗PSA IgG抗体（克隆735）在多发性硬化（MS）和肌萎缩侧索硬化（ALS）模型中是否具有相似的治疗效果，仍有待明确。

简而言之，本文所述方法主要用于鉴定再生性人源抗体HIgM12的抗原，以支持多发性硬化症（MS）以及可能的其他神经退行性疾病潜在临床试验的开展。对于具有生物学活性的抗体而言，鉴定其抗原是理解其作用机制的关键步骤。这一点在当前大量单克隆抗体正在进行人体安全性与有效性试验的背景下尤为重要。尽管迄今为止进入临床试验的IgM类抗体数量较少，但近年来杂交瘤技术的进步，以及越来越多研究揭示了此类抗体具有治疗潜力^{1-10,37,40,42-45}，迫切需要发展适用于鉴定非蛋白IgM抗原的新方法或改进方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Fisher Scientific	MT-10-013-CVRF	高糖，含谷氨酰胺，含丙酮酸钠，500 ml
DMEM/F-12, HEPES	Life Technologies	11330-032	500 ml，L-谷氨酰胺，丙酮酸钠，高糖
青霉素-链霉素	Life Technologies	15140-122	10,000 U/ml，100 ml
N-2 补充剂 (100x)	Life Technologies	17502-048	5 ml
B-27 补充剂 (50x)	Life Technologies	17504-044	无血清，10 ml
胎牛血清 - Optima	Atlanta Biologicals	S12450	500 ml
无菌冲洗用水	Baxter Healthcare	#2F7114	USP-1,000 ml，12/箱
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma	P7886-50MG	D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys · xHBr，分子量 30,000–70,000 g/mol，50 mg
牛血清白蛋白 V 组分	Sigma	A-3294-100G	热休克组分，无蛋白酶，pH 7，  纯度 98%，100 g
D-(+)-葡萄糖	Sigma	G5767-500G	C6H12O6，分子量：180.16 g/mol，ACS 试剂，500 g
牛胰蛋白酶	Sigma	T9935-100mg	基本无盐，冻干粉末，9,000 BAEE 单位/mg 蛋白质
牛胰脱氧核糖核酸酶 I	Sigma	D5025-150KU	IV 型，冻干粉末，2,000 Kunitz 单位/mg 蛋白质
重组大鼠碱性 FGF 蛋白	R&D systems	3339-FB-025	以 BSA 为载体蛋白，25 µg，冻干，> 95%，16.2 kDa
重组大鼠 PDGF-AA 蛋白	R&D systems	1055-AA-50	无载体，50 µg，冻干，> 97%，E. coli来源，12.5 kDa
Neurobasal-A	Life Technologies	10888-022	500 ml，不含谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸
多聚甲醛	Sigma	P6148-1KG	结晶状，1 kg，试剂级，分子量 30.03 g/mol（以单体计）
三(羟甲基)氨基甲烷 (Tris 碱)	Biorad	#1610719	1 kg，99.8% 纯度，粉末
十二烷基硫酸钠 (SDS)	Biorad	#1610302	1 kg，粉末
甘氨酸	Fisher Scientific	BP-381-5	C2H5NO2，分子量：75.07 g/mol，白色结晶粉末，5 kg
氯化钠	Sigma	S7653-5KG	NaCl，分子量：58.44 g/mol，5 kg
磷酸二氢钠	Sigma	S0751-500G	NaH2PO4，分子量：119.98 g/mol，500 g
1x 磷酸盐缓冲液 (PBS)	Cellgro	MT-21-040-CV	不含钙和镁，6 × 500 ml
Falcon 60 mm TC 处理细胞培养皿	Corning Life Sciences	#353002	60 mm 细胞培养皿，TC 处理聚苯乙烯，20/包，无菌
Falcon 60 mm × 15 mm 培养皿	Corning Life Sciences	#351007	非 TC 处理细菌培养皿，20/包
6 孔细胞培养板	Corning Costar	CLS3516	6 孔，平底（单独包装），γ 射线灭菌，生长面积 9.5 cm²
75 cm² 组织培养瓶	Corning Life Sciences	430720U	75 cm² 倾斜颈 U 形细胞培养瓶，带塞密封盖
Pierce™ Protein L Plus 琼脂糖	ThermoFisher Scientific	#20520	2 ml，交联 6% 珠状琼脂糖 (CL-6B)，结合能力：10–20 mg IgG
4–20% Mini-PROTEAN TGX 预制胶	Biorad	456-1094	10 孔，50 µl，适用于 Mini-PROTEAN 电泳槽
Immobilon-P 膜	Millipore	IPVH00010	PVDF，0.45 µm，26.5 cm × 3.75 m 卷装
抗多聚唾液酸-NCAM 抗体，克隆	Millipore	MAB5324	50 微升，宿主：小鼠，单克隆 IgM
4x Laemmli 上样缓冲液	Biorad	#1610747	10 ml，4x 预混蛋白样品缓冲液
2-巯基乙醇	Biorad	#1610710	25 ml，98% 纯度，14.2 M
内切神经氨酸酶-N (Endo-N)	ABC Scientific	ABC0020	50 微升，200 µg/ml，3,500 U/mg
25 mm 玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-545-102	圆形，No. 1；厚度：0.13–0.17 mm；尺寸：25 mm
HEPES 缓冲液	ThermoFisher Scientific	15630-080	100 ml，1 M
1x Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)	Cellgro	MT-21-022-CV	500 ml，不含钙、镁、酚红
木瓜蛋白酶	Worthington Biochemical Cooperation	LS003119	冻干粉末，100 mg
硫酸镁	Sigma	M-2643-500G	粉末，500 g
L-谷氨酰胺	Gibco	#25030-081	100 ml，200 mM