Method Article

多峰成像和光谱学纤维束显微内窥镜纲要非侵入性，在体内组织分析

DOI:

10.3791/54564

⸱

October 17th, 2016

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

In This Article

Summary

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描述了多模态显微内窥镜的组装和使用，它可以将浅表组织图像数据与组织生理参数（包括血红蛋白浓度、黑色素浓度和氧饱和度）共同配准。该技术可用于评估组织结构和灌注，并且可以根据研究者的个体需求进行优化。

Abstract

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最近纤维束显微内窥镜技术使用两种成像技术或分光技术的组合在体内组织的非侵入性的分析。结合成像和光谱学技术成一个单一的光学探针可提供组织健康的更完整的分析。在这篇文章中，两种不同的方式组合，高分辨率荧光显微内窥镜成像和漫反射光谱，成一个单一的光学探头。高分辨率荧光显微内窥镜成像是用于可视化根尖组织微结构的技术，虽然大多是定性的技术，已经证明肿瘤和非肿瘤组织之间的有效实时分化。漫反射光谱是一种技术，它可以提取组织的生理参数，包括当地的血红蛋白浓度，黑色素浓度和血氧饱和度。本文介绍的规格řequired构建光纤探头，如何建立仪器仪表，然后演示了在体内对人体皮肤的技术。这项工作表明该组织的微架构，特别是心尖皮肤角质，可以和其相关的生理参数共同注册。这里介绍的仪器和纤维束探针可以被优化为在各种器官系统的使用任一手持或内窥镜兼容设备。另外的临床研究来测试此技术对于不同的上皮疾病状态的可行性。

Introduction

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纤维束显微内窥镜技术通常使用两种成像技术或分光技术的组合分析体内组织中 1-3一种这样的成像技术，高分辨率荧光显微内窥镜，可以形象根尖组织微架构具有亚细胞分辨率的小，微尺度场的图，利用局部造影剂如原黄素，荧光素，或羟基芘磺酸油墨。1,3-11该成像模态已示于定性实时低区分患病的和健康上皮组织有前途的临床表现间观察员变异8偶尔，调查人员将使用高分辨率荧光显微镜的数据中提取定量的功能，如细胞与核的大小或腺区，但这仍然瞄准往可视化的组织形态的主要定性技术。1,3,8- 10在另一方面，光谱技术等作为漫反射光谱，正朝着提供功能组织信息并显示在多个器官定量识别病变癌变看好的临床表现有针对性的。2,12-15

因此，有必要对掺入两种类型的模式，从而可能进一步降低观察者间变异性，维持组织微架构的实时可视化，并提供组织健康的一个更完整的分析的装置。为了实现这个目标，在基于探针的多峰仪器构建结合在一个单一的光纤探针两种模式:高分辨率荧光显微内窥镜和分漫反射光谱11此方法共寄存器定性心尖的高清晰度图像组织形态（结构特性）与来自两个不同的组织深度定量光谱信息（功能性），包括局部血红蛋白浓度（[血红蛋白]），黑色素浓度（[梅尔]）和氧饱和度（SAO 2）。11,12,16这个特定副漫反射光谱....

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Protocol

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在阿肯色大学从人类受试者的研究项目，获得了本次研究的方方面面机构审查委员会的批准（IRB＃15-09-149）。所描述的方法是在按照批准的指导方针进行，并从所有参与者获得知情同意书。

1.高分辨率荧光显微内窥镜成像设备的组装

注意:对于高分辨率荧光显微内窥镜形态的组件的概述的步骤可以在图2中被可视化。

  1. 将一个470 nm的分色镜内30毫米笼式立方体。
    1. 获得30毫米笼式立方体和删除二向色滤光片安装。
    2. 放置一个470nm的分色镜的分色滤光器装入。
    3. 重新插入并确保二向色滤光片装回笼子里面的立方体。
  2. 安装笼式支杆至30毫米笼式立方体。
    1. 安全4节1.5英寸的笼式支杆的笼式立方体的前面。
    2. 安全4 3.0英寸的笼式支杆的笼式立方体的右侧。
    3. 安全双2.0英寸的笼式支杆斜着笼式立方体的左侧。
  3. 构建笼板/镜头管组件。
    1. 获得一个1.0英寸的螺纹30毫米笼板，并使用所提供的螺纹应力自由卡环固定在笼板的内侧。
    2. 拧一个1.0英寸镜头管无应力卡环。
    3. 将第二个1.0英寸螺纹30毫米笼板的1.0英寸镜筒和调整标准卡环使两笼板齐平。
  4. 1....

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Results

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按照此协议，研究者将获得组织部位的在焦高分辨率图像与全视场（ 图5）。细胞的轮廓可以看出，如果沾有墨水羟基芘磺酸从一个黄色荧光笔，而单个细胞核，如果能与染料染色，如原黄素可以看出。下列光谱采集，后处理软件使用体内血红蛋白浓度（[血红蛋白]）和黑素浓度（[梅尔]）21的先验知识，以适应子漫反射光谱，并确定为[血红蛋白]，[梅尔值]，和组织氧饱和度， 如图5所示（SAO 2），后处理软件使用宽生理范围（[血红蛋白] = 0-150毫克/毫升，[梅尔] = 0-30毫克/毫升，和血氧饱和2 = 0-100％），以适合校准光谱。21

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Discussion

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多峰高分辨率成像和分漫反射光谱纤维束显微内窥镜此处报告可以被优化并用于各种应用，包括内窥镜或手持使用用于人类或动物研究中使用由调查员。因此，它提供了用于在体内根尖组织微结构可视化与来自两个不同的组织深度的血红蛋白浓度，黑色素浓度和组织氧饱和度的测量值的灵活的方法。本文介绍了用于光纤探针的说明书，所述的协议用于组装高分辨率成像系统和分漫反射成像系统，并显示出其在人体内的组织应用程序，使用羟基芘磺酸墨水作为荧光造影剂组织可视化。其它油墨，例如原黄素或荧光素，可被用来代替用适当的批准羟基芘磺酸油墨。4-7,11

">任何探针功能可能从这样的设计进行修改。对于高分辨率荧光显微内窥镜形态中，直径1毫米的图像纤维由50000个人芯纤维与4.5微米间距，导致4.5微米的恒定亚细胞的空间分辨率。想要一个不同尺寸的图象纤维，以获得更小的或更大的场的视图可以找到现成的0.14和1.40毫米。的管透镜为50毫米焦距之间直径这些图像纤维调查被选择为使得CMOS传感器捕获的全1毫米字段的视图从图像光纤。当保持物镜恒定，增加管透镜将增加放大率和采样频率，但降低场的视图的焦距

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Disclosures

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提交人声明，他们没有竞争的经济利益。

Acknowledgements

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本材料基于美国国立卫生研究院 （1R03-CA182052， 1R15-CA202662）、美国国家科学基金会研究生研究奖学金计划 （G.G.， DGE-1450079）、阿肯色州生物科学研究所和阿肯色大学博士学院奖学金支持的工作。本材料中表达的任何观点、发现、结论或建议均为作者的观点，并不一定反映公认的资助机构的观点。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
30 mm 笼式立方体，带二向色性滤光片支架Thorlabs， Inc.CM1-DCH
470 nm 二向色镜（分束器）Chroma CorporationT470lpxr
笼式组装杆，1.5 英寸，4 件装Thorlabs， Inc.ER1.5-P4
笼式组装杆，3.0 英寸，4 件装Thorlabs， Inc.ER3-P4
笼式组装杆，2.0 英寸，4 件装Thorlabs， Inc.ER2-P4
SM1 螺纹 30 mm 笼式板Thorlabs， Inc.CP02
SM1 系列无应力弹性挡圈Thorlabs， Inc.SM1PRR
SM1 镜筒，1.00" 螺纹深度Thorlabs， Inc.SM1L10
直角运动镜支架Thorlabs， Inc.KCB1
1" 紫外线增强铝镜Thorlabs， Inc.PF10-03-F01
Z 轴平移安装架Thorlabs， Inc.SM1Z
10X 奥林巴斯平场消色差物镜Thorlabs， Inc.RMS10X
XY 平移镜头卡口Thorlabs， Inc.CXY1
SMA 光纤转接板，带 SM1 螺纹Thorlabs， Inc.SM1SMA
SM1 镜筒，0.50" 螺纹深度Thorlabs， Inc.SM1L05
440/40 带通滤光片（激发）Chroma CorporationET440/40x
525/36 带通滤光片（发射）Chroma CorporationET525/36m
快速设置环氧树脂乐泰1395391
455 nm LED 灯罩套件 - 3 瓦LED 电源ALK-LH-3W-KIT
1" 消色差双合透镜，f = 50 mmThorlabs， Inc. 公司AC254-050-A
跳蚤 3 USB 单色相机Point Grey， Inc.FL3-U3-32S2M-CS
0.5" 柱架，L = 1.5"Thorlabs， Inc.PH1.5
0.5" 光学柱，L = 4.0"Thorlabs， Inc.TR4
安装底座，1" x 2.3" x 3/8"Thorlabs， Inc.BA1S
长寿命卤钨光源 （VIS-NIR）Ocean OpticsHL-2000-LL
20X 奥林巴斯平场物镜爱特蒙特光学公司PLN20X
定制铝制电机臂N/AN/A定制设计和制造
定制铝制电机臂适配器N/AN/A定制设计和制造
定制铝制电机外壳N/AN/A定制设计和制造
的步进电机 - 400 步/转SparkFun ElectronicsROB-10846多个供应商
定制铝制光纤开关N/AN/A定制设计和制造
定制铝制光纤开关面板N/AN/A 定制设计和制造
的 Arduino Uno - R3SparkFun ElectronicsDEV-11021多个供应商
电子面包板 - 自粘式 SparkFun ElectronicsPRT-12002多个供应商
EasyDriver - 步进电机驱动器Sparkfun ElectronicsROB-12779
12 V， 229 mA 电源PhihongPSM03A多个供应商
增强灵敏度 USB 光谱仪 （Vis-NIR）Ocean OpticsUSB2000+VIS-NIR-ES
;m，0.22 NA，SMA-SMA 光纤跳线Thorlabs， Inc.M37L01
定制光纤探头无数光纤成像N/A
20% Spectralon 漫反射标准Labsphere， Inc.SRS-20-010
标准黄色荧光笔Sharpie25005多个供应商，可替代黄素或荧光素
的的 550 µ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muldoon, T. J., et al. Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy. Opt Express. 15, 16413-16423 (2007).
  2. Rajaram, N., Reichenberg, J. S., Migden, M. R., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Pilot clinical study for quantitative spectral diagnosis of non-melanoma skin cancer. Lasers....

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