本文描述了一种多模态显微内窥镜的组装与使用方法,该内窥镜可同时获取组织表层的图像数据以及组织生理参数,包括血红蛋白浓度、黑色素浓度和氧饱和度。该技术可用于评估组织结构与灌注情况,并可根据研究者的具体需求进行优化。
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本文描述了一种多模态显微内窥镜的组装与使用方法,该内窥镜可同时获取组织表层的图像数据以及组织生理参数,包括血红蛋白浓度、黑色素浓度和氧饱和度。该技术可用于评估组织结构与灌注情况,并可根据研究者的具体需求进行优化。
近期的光纤束微内窥镜技术可实现无创分析 体内 利用成像技术或多种光谱技术的组合来评估组织。将成像与光谱技术整合至单一光学探头,可能实现对组织健康状况更全面的分析。本文将两种截然不同的技术——高分辨率荧光显微内镜成像与漫反射光谱——整合于一个光学探头中。高分辨率荧光显微内镜成像可用于可视化观察组织表层的微观结构,尽管该技术主要为定性方法,但已证明可在新生物性与非新生物性组织之间实现有效的实时区分。漫反射光谱则是一种可提取组织生理参数的技术,包括局部血红蛋白浓度、黑色素浓度及氧饱和度。本文阐述了构建该光纤探头所需的技术规格、仪器搭建方法,并随后在组织样本上演示了该技术的应用。 体内 人类皮肤。该研究揭示了组织微结构(特别是表皮角质形成细胞)可与其相关的生理参数进行共定位分析。本文介绍的仪器及光纤束探头可优化为手持式或可与内窥镜兼容的装置,适用于多种器官系统。未来还需进一步的临床研究,以验证该技术在不同上皮疾病状态下的应用可行性。
光纤束微内窥镜技术通常采用成像技术或多种光谱技术的组合来分析体内组织。1-3 其中一种成像技术——高分辨率荧光微内窥镜技术,可利用外用对比剂(如普鲁黄、荧光素或派洛宁染料),在微小的微尺度视场内以亚细胞分辨率对组织表层微结构进行成像。1,3-11 该成像方式在实时定性区分病变与正常上皮组织方面表现出良好的临床性能,且观察者间差异较小。8 偶尔,研究人员会利用高分辨率荧光显微镜数据提取细胞和细胞核大小、腺体面积等定量特征,但该技术仍主要作为一种定性方法,用于可视化组织形态。1,3,8-10 另一方面,光谱技术(如漫反射光谱)旨在提供组织功能信息,在多个器官中定量识别癌变病灶方面也展现出良好的临床应用前景。2,12-15
因此,需要一种能够整合这两种模式的设备,以进一步降低观察者间的差异性,保持对组织微结构的实时可视化,并提供更全面的组织健康分析。为实现这一目标,研制了一种多模态基于探针的仪器,该仪器将两种模式集成于单根光纤探针中:高分辨率荧光显微内镜与亚扩散反射光谱技术11。该方法将顶端组织形态(结构特性)的定性高分辨率图像与来自两个不同组织深度的定量光谱信息(功能特性)进行共配准,包括局部血红蛋白浓度([Hb])、黑色素浓度([Mel])和氧饱和度(SaO2)11,12,16。这种特定的亚扩散反射光谱模式采用两种源-探测器间距(SDS),以采样两个独特的组织深度,从而通过检测至基底膜及下方组织间质,提供更全面的组织健康信息11。
光纤探头由一根直径为1 mm的中心成像光纤组成,包含约50,000根纤芯 4.5 µm 直径为纤芯元件,包层直径为1.1 mm,总涂层直径为1.2 mm。该图像光纤周围环绕着五根 200 µm 直径纤维,包层直径为 220 µm。每个 200 µm 多模光纤的中心间距为 864 µm 远离图像光纤的中心。每一个 200 µm 多模光纤是 25° 分开。使用最左侧的 200 µm 多模光纤作为“源”光纤,以及额外的三根 200 µm 将多模光纤作为“收集”光纤时,这种几何结构必然形成三个中心到中心的SDS 374 µm, 730 µm, 1,051 µm,以及 1,323 µm光纤尖端被封装在一个圆柱形金属外壳中,以保持各光纤之间的距离恒定。该圆柱形金属外壳的直径为3 mm。光纤探头的远端(朝向光纤探头尖端)长度为2英尺。在近端(朝向仪器设备端)处,探头分成六根独立的光纤,该部分额外长度为2英尺,总长度为4英尺。 图1 显示了光纤探头的示意图。

图 1:光纤探头设计。 该光纤探头由一根直径为 1 mm 的成像光纤和四根直径为 200 µm 的多模光纤组成。本图展示了(a)金属端帽的结构,用于固定探头尖端处光纤的几何排列,相对于最左侧的 200 µm 多模光纤,可实现 374、730 和 1,051 µm 的源-探测距离(比例尺 ≈ 1 mm);(b)光纤被约束在金属端帽内的示意图,显示了光纤纤芯、包层和涂层(比例尺 ≈ 1 mm);(c)光纤周围的保护性聚酰胺护套(比例尺 ≈ 1 mm);(d)探头完成后的远端尖端,带有金属指握结构以及包含所有光纤的单根黑色电缆(比例尺 ≈ 4 mm);以及(e)探头远端尖端的实际照片(比例尺 ≈ 4 mm)。请点击此处查看该图的放大版本。
这种多模态仪器及其相关技术是首次将这些模态集成于单个探头中,尽管目前已存在其他结合不同模态的结构/功能联合技术。例如,高光谱成像将宽场成像与血红蛋白和黑色素的定量特性相结合17,18,还有其他技术将光学相干断层扫描(OCT)与组织蛋白表达分析相结合19,仅举几例。本文报道了一种结构紧凑且易于实现的仪器装置,采用通用光纤探头,可根据不同应用需求进行优化,包括用于下消化道和食管的内窥镜检查,或作为手持探头用于口腔及体表皮肤检测11,20。
该仪器的硬件需要定制的数据采集和后处理代码,以获取漫反射光谱,并进而提取得到的体积平均组织生理参数,包括[Hb]、[Mel]和SaO₂。2定制的数据采集代码旨在实现从相机(用于高分辨率荧光显微镜)和光谱仪(用于漫反射光谱)同时采集数据。制造商的网站通常提供驱动程序,以支持与多种编程语言的集成。定制的后处理代码可导入 先验的 吸收值 体内 [Hb] 和 [Mel]21 然后利用先前开发的非线性优化拟合过程,对光谱数据进行拟合曲线的生成。22 拟合曲线通过最小化 χ2 其自身与原始光谱之间的值,并确定组织生理参数([Hb]、[Mel] 和 SaO2) 从拟合曲线中得出且具有最低的 χ2 值22 代码可进行修改,以纳入其他发色团的吸收,例如此处使用的外源性吡喃素墨水,从而确保目标生理参数不受影响。
组织健康的生理指标,如[Hb]、[Mel]和SaO2,可作为肿瘤对治疗反应的报告,或作为局部血管化和血管生成的指标14,23。结合高分辨率荧光显微内镜模式有助于引导探头定位,并为研究人员提供更完整的上皮组织结构与功能关系图像。本文描述了多模态显微内镜的构建与应用11。
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本研究的所有方面均已获得阿肯色大学人类受试者研究项目机构审查委员会批准(IRB #15-09-149)。所述方法均按照批准的指南进行,并已从所有参与者处获得知情同意。
1. 高分辨率荧光显微内窥成像系统的组装
注意:高分辨率荧光显微内窥成像模态的组装步骤如图2所示。

图2:高分辨率荧光显微内窥成像系统的组装。 高分辨率荧光显微内窥成像系统可通过构建直径为1.0英寸的组件外壳实现,组装过程中需特别注意二向色镜、物镜、激发/发射滤光片以及管镜的安装。这些组件的玻璃表面必须使用镜头纸小心处理。请点击此处查看该图的放大版本。
2. 次扩散反射光谱模式的组装
注意:子漫反射光谱模式的组装步骤可在图3中查看。

图3:亚扩散反射光谱模组的组装。 亚扩散反射光谱模组可通过一个基本的钨卤素灯与物镜耦合,将光聚焦至200 µm多模传输光纤,并连接光谱仪来构建。此外,可在灯-光纤-光谱仪光路中构建一个定制的电动光学开关,以在各个SDS之间切换。使用多个光谱仪从多个SDS采集数据的研究人员可省略光学开关组件。请点击此处查看该图的放大版本。
3. 次扩散反射光谱模式的校准
注意:以下步骤(第3节)必须在光谱数据采集(第4节)之前完成。

图 4:亚扩散反射光谱模式的校准。在实验前校准过程中,光纤探头尖端与20%漫反射标准板之间的垂直距离需根据源-探测器间距(SDS)的不同而调整。为了在所有实验中一致地实现这些垂直距离,设计了一种校准标准装置(装置横截面如图(a)所示),用于将探头精确固定在距离20%漫反射标准板的指定位置。在此特定的光纤探头设置中,来自钨卤素灯的光经光学开关传输,在源-探测器间距分别为(b)374 µm 和(c)730 µm 时显示(为清晰起见,图中移除了电机及电机臂)。校准所需的垂直距离分别为(d)374 µm SDS 对应 2.1 mm,以及(e)730 µm SDS 对应 3.9 mm。请点击此处查看该图的放大版本。
4. 体内 人体皮肤数据采集与光学特性提取
本节将演示多模态显微内窥镜技术在 体内 人类皮肤


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按照本方案操作后,研究人员将获得该组织部位的全视野、高分辨率且聚焦清晰的图像(图5)。若使用标准黄色荧光笔中的吡喃宁墨水进行染色,可观察到细胞轮廓;若使用如普鲁黄等染料染色,则可观察到单个细胞核。光谱采集完成后,后处理软件将使用 先验的 知识 体内 血红蛋白浓度([Hb])和黑色素浓度([Mel])21 以拟合亚扩散反射光谱并确定血红蛋白浓度([Hb])、黑色素浓度([Mel])和组织氧饱和度(SaO2如所示 图5后处理软件采用宽泛的生理范围([Hb] = 0–150 mg/ml,[Mel] = 0–30 mg/ml,以及 SaO2 = 0-100%)以拟合校准光谱。21
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此处报道的多模态高分辨率成像与亚扩散反射光谱光纤束微探针内窥镜可由研究人员优化后用于多种应用,包括在人体或动物研究中进行内窥镜或手持式操作。因此,该技术为可视化提供了灵活的方法 体内 从两个不同组织深度测量血红蛋白浓度、黑色素浓度和组织氧饱和度的同时,对顶端组织微结构进行成像。本文描述了光纤探头的技术规格,概述了高分辨率成像系统与亚扩散反射成像系统的组装方案,并展示了其在人体组织中的应用。 体内,使用派瑞宁染料作为荧光对比剂以实现组织可视化。其他染料(如普鲁黄或荧光素)可在获得适当批准后替代派瑞宁染料使用。4-7,11
该设计中的任何探头特性均可进行修改。对于高分辨率荧光显微内窥镜模式,直径为1 mm的成像光纤由50,000根独立纤芯组成,纤芯间距为4.5 µm,从而实现恒定的亚细胞空间分辨率4.5 µm。若研究人员希望获得更小或更大的视场,可选用不同尺寸的成像光纤,此类光纤直径通常在0.14至1.40 mm之间,易于获取。选用焦距为50 mm的管镜,以确保CMOS传感器能够完整捕获来自成像光纤的1 mm视场。在物镜保持不变...
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作者声明不存在任何竞争性经济利益。
本材料基于美国国立卫生研究院(1R03-CA182052,1R15-CA202662)、美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目(G.G.,DGE-1450079)、阿肯色生物科学研究所以及阿肯色大学博士学院奖学金的支持。本文中表达的观点、发现、结论或建议均为作者个人观点,不一定反映上述资助机构的官方立场。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 带二向色滤光片支架的30 mm笼式立方体 | Thorlabs, Inc. | CM1-DCH | |
| 470 nm二向色镜(光束分束器) | Chroma Corporation | T470lpxr | |
| 笼式组件杆,1.5",4件装 | Thorlabs, Inc. | ER1.5-P4 | |
| 笼式组件杆,3.0",4件装 | Thorlabs, Inc. | ER3-P4 | |
| 笼式组件杆,2.0",4件装 | Thorlabs, Inc. | ER2-P4 | |
| SM1螺纹30 mm笼式板 | Thorlabs, Inc. | CP02 | |
| SM1系列无应力固定环 | Thorlabs, Inc. | SM1PRR | |
| SM1透镜套管,1.00"螺纹深度 | Thorlabs, Inc. | SM1L10 | |
| 直角运动学镜架 | Thorlabs, Inc. | KCB1 | |
| 1"紫外增强铝镜 | Thorlabs, Inc. | PF10-03-F01 | |
| Z轴平移镜架 | Thorlabs, Inc. | SM1Z | |
| 10X Olympus平场消色差物镜 | Thorlabs, Inc. | RMS10X | |
| XY平移透镜镜架 | Thorlabs, Inc. | CXY1 | |
| 带SM1螺纹的SMA光纤适配板 | Thorlabs, Inc. | SM1SMA | |
| SM1透镜套管,0.50"螺纹深度 | Thorlabs, Inc. | SM1L05 | |
| 440/40带通滤光片(激发) | Chroma Corporation | ET440/40x | |
| 525/36带通滤光片(发射) | Chroma Corporation | ET525/36m | |
| 快干环氧胶 | Loctite | 1395391 | |
| 455 nm LED光源外壳套件 - 3瓦 | LED Supply | ALK-LH-3W-KIT | |
| 1"消色差双胶合透镜,f = 50 mm | Thorlabs, Inc. | AC254-050-A | |
| Flea 3 USB黑白相机 | Point Grey, Inc. | FL3-U3-32S2M-CS | |
| 0.5"支架座,L = 1.5" | Thorlabs, Inc. | PH1.5 | |
| 0.5"光学支架,L = 4.0" | Thorlabs, Inc. | TR4 | |
| 安装底座,1" x 2.3" x 3/8" | Thorlabs, Inc. | BA1S | |
| 长寿命钨卤素光源(可见光-近红外) | Ocean Optics | HL-2000-LL | |
| 20X Olympus平场物镜 | Edmund Optics, Inc. | PLN20X | |
| 定制铝制电机臂 | N/A | N/A | 定制设计与制造 |
| 定制铝制电机臂适配器 | N/A | N/A | 定制设计与制造 |
| 定制铝制电机外壳 | N/A | N/A | 定制设计与制造 |
| 步进电机 - 400步/转 | SparkFun Electronics | ROB-10846 | 多个供应商 |
| 定制铝制光纤开关 | N/A | N/A | 定制设计与制造 |
| 定制铝制光纤开关面板 | N/A | N/A | 定制设计与制造 |
| Arduino Uno - R3 | SparkFun Electronics | DEV-11021 | 多个供应商 |
| 自粘式电子面包板 | SparkFun Electronics | PRT-12002 | 多个供应商 |
| EasyDriver - 步进电机驱动器 | Sparkfun Electronics | ROB-12779 | |
| 12 V,229 mA电源 | Phihong | PSM03A | 多个供应商 |
| 增强灵敏度USB光谱仪(可见光-近红外) | Ocean Optics | USB2000+VIS-NIR-ES | |
| 550 µm,0.22 NA,SMA-SMA光纤跳线 | Thorlabs, Inc. | M37L01 | |
| 定制光纤探头 | Myriad Fiber Imaging | N/A | |
| 20% Spectralon漫反射标准板 | Labsphere, Inc. | SRS-20-010 | |
| 标准黄色荧光笔 | Sharpie | 25005 | 多个供应商,可用原黄素或荧光素替代 |
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