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利用自动荧光寿命成像显微镜的开源高内涵分析

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DOI：

10.3791/55119

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2017年1月18日

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1Photonics Group, Department of Physics, Imperial College London, 2Institute for Chemical Biology, Department of Chemistry, Imperial College London, 3MRC Clinical Sciences Centre, Hammersmith Hospital, 4Chemical Biology Section, Department of Chemistry, Imperial College London, 5Retroscreen Virology Ltd, 6Pfizer Global Research and Development, Pfizer Limited, Sandwich, Kent, UK, 7Centre for Histopathology, Imperial College London

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍一种开源的高内涵分析（HCA）仪器，该仪器利用自动化的荧光寿命成像（FLIM）技术，通过基于荧光共振能量转移（FRET）的检测方法来分析蛋白质相互作用。openFLIM-HCA 仪器的数据采集由基于 µManager 编写的软件控制，数据分析则在 FLIMfit 中进行。

摘要

我们介绍了一种开源的高内涵分析仪器，该仪器利用自动化的荧光寿命成像（FLIM）技术，通过检测多孔板中固定或活细胞的基于荧光共振能量转移（FRET）的信号，来分析蛋白质相互作用。该方法可用于筛选细胞信号传导过程，其读出方式包括基于分子内FRET的生物传感器，或蛋白质相互作用（如寡聚化或异源二聚化）的分子间FRET，从而用于鉴定结合伴侣蛋白。本文描述了该自动化多孔板FLIM仪器的功能，并展示了我们研究HIV Gag蛋白寡聚化以及活细胞中FRET生物传感器时间过程的示例数据。随后，我们详细说明了该系统的实际实施方案，包括硬件组件清单以及基于µManager编写的开源数据采集软件的说明。同时介绍了FLIMfit的应用，这是一个基于MATLAB的开源OMERO平台客户端，用于分析多孔板FLIM数据阵列。文中还概述了固定细胞和活细胞成像的实验方案，并演示了利用表达基于荧光蛋白的FRET构建体的细胞进行自动化多孔板FLIM实验的过程。此外，还提供了针对该特定FLIM-FRET数据集的数据分析逐步操作指南。

引言

在药物发现中，自动化高内涵分析（HCA）用于筛选化合物文库的应用日益广泛1，与此同时，生命科学基础研究领域也呈现出向自动化成像实验发展的趋势，以开展系统性研究，例如对siRNA文库进行表型筛选。对于以往通常采用手动操作、仅对数十个细胞培养皿使用传统显微镜成像的小规模生物学研究而言，自动化HCA也正变得越来越重要。由于能够检测和分析数百至数千个视野，自动化HCA显著提升了统计效力，可对实验噪声（包括"生物噪声"）进行平均化处理；同时，图像数据的自动采集与大规模样本阵列的自动分析有助于消除操作者偏差，并常可用于检测系统性误差的发生，例如在数据采集过程中仪器响应函数（IRF）轮廓的变化。基于荧光的检测方法在HCA中被广泛应用，大多数商用HCA仪器均具备一个或多个光谱通道的荧光强度成像功能，用于描绘标记蛋白的相对分布及其共定位情况。然而，尽管更先进的荧光成像模式（如荧光寿命成像（FLIM）、偏振各向异性成像和时间分辨荧光各向异性成像）能够提供强大的定量读出信号，例如用于检测蛋白质相互作用，但这些技术在商用HCA仪器中尚未得到广泛利用。本文中，我们提出一种在自动化显微镜上实现HCA用FLIM的开源方法。

荧光寿命提供了一种内在的比率型光谱读数，可用于区分不同的分子种类，或探测荧光团的局部分子环境，且不受荧光团浓度、激发/检测效率以及散射和样品吸收影响2。此外，由于荧光寿命测量可在单一光谱通道中完成，因此无需校准即可在不同仪器和样品之间直接比较。该方法可应用于内源性荧光团，包括某些细胞代谢物、脂质和细胞外基质成分，从而对生物过程和病理状态提供内在的读数。因此，无需标记的荧光寿命成像（FLIM）可绘制细胞内的代谢变化图谱3,4，并已被用于监测干细胞分化5,6以及胶原支架的生长7。我们最近证明，FLIM高内涵分析（HCA）可利用自发荧光实现细胞代谢的自动化无标记检测8。然而更常见的是，荧光寿命测量和FLIM被应用于外源性荧光团，这些荧光团可标记特定的生物分子，通常通过染料对细胞区室进行染色，或使用与抗体偶联的染料靶向固定细胞中的特定蛋白，或使用与特定蛋白融合表达的基因编码荧光蛋白来实现。荧光寿命可用于为感知其物理或化学环境的荧光探针提供稳健的定量读数。例如，已有染料被用于检测细胞膜的局部脂质相态9或细胞黏度10，并已开发出基于基因编码荧光蛋白的生物传感器，用于报告细胞信号分子（如IP311、PIP212和钙蛋白酶13）或离子（如钙离子14,15、钾离子16和氯离子17）的浓度。

许多此类生物传感器利用弗ör斯特共振能量转移（Förster Resonance Energy Transfer, FRET）18,19来读取生物传感器构象变化的信号。供体（"donor"）与受体（"acceptor"）荧光团之间的FRET通过短程直接偶极-偶极相互作用发生，通常要求荧光团之间的距离小于约10 nm。因此，FRET的检测表明标记蛋白之间处于紧密接近状态，从而可用来读取蛋白-蛋白相互作用20，例如在固定细胞中的终点检测，或在活细胞时间序列测量中的动态事件，如结合或寡聚化过程。通过在适当的分子构建体上同时标记供体和受体荧光团，还可根据FRET的变化来检测该构建体的构象改变或裂解，这正是许多生物传感器的工作原理21。对FRET效率的测量可提供供体-受体间距离信息以及发生FRET的供体荧光团所占的比例。因此，基于FRET的成像技术可用于在空间和时间上绘制并定量分子相互作用，e.g., 阐明细胞信号传导过程22。自动化此类成像技术可实现基于信号通路或信号网络读数的高通量检测。

在高内涵筛选（HCA）中，最常采用的FRET检测方法是光谱比率成像，即对受体与供体荧光强度比值的变化进行成像分析。尽管该方法易于实施——并且许多商用多孔板检测仪均已具备此功能——但要实现定量的光谱分辨FRET测量，仍需对系统的光谱响应进行校准23。这包括由光谱渗漏和受体的直接激发引起的光谱串扰，以及仪器和样品的透射特性（内滤效应）。原则上，这需要额外测量仅标记供体或仅标记受体的"对照"样品。

通过此类光谱比例型FRET测量，可获得有效FRET效率（实际FRET效率与发生FRET的供体/受体分子比例的乘积），同时还能获得供体与受体分子的相对比例24。光谱比例型FRET通常用于单分子FRET生物传感器，此时可假设供体/受体的化学计量比已知。为了确定发生FRET的供体和受体分子所占的比例，例如，获得剂量-反应曲线，需要了解实际的FRET效率。这可通过测量具有已知特性的阳性FRET对照样品，或采用其他方法（如受体光漂白或荧光寿命成像，FLIM）测定FRET效率来实现。

利用荧光寿命读数，可通过仅测量供体发射来检测和量化FRET，从而无需进行光谱校准以及额外的对照样品。因此，可在不同仪器和不同样品间比较FLIM-FRET读数，从而实现对活体疾病模型内窥镜或断层成像数据的比较分析25 需与基于细胞的检测结果进行基准比较。通过将供体荧光衰减曲线拟合至适当的多指数衰减模型，该模型对应于发生FRET和未发生FRET的供体分子群体，原则上可直接获得FRET效率及各群体所占比例，无需额外测量。然而，这些显著优势的代价是，FLIM每像素所需的检测光子数高于光谱分辨的强度成像——通常在拟合单指数衰减模型时，需数百个光子才能实现10%寿命测定精度；而在拟合复杂的（多指数衰减）模型时，所需检测光子数则上升至数千。传统上，这导致FLIM的采集时间较长（每个视野数十至数百秒），尤其是在激光扫描显微镜中采用按序像素采集的时间相关单光子计数（TCSPC）技术时更为明显。尝试通过提高激发光强度来加快成像速度，可能导致显著的光漂白和/或光毒性。加之缺乏合适的商业化仪器和软件工具，这些因素阻碍了FLIM在药物发现或系统生物学的高内涵筛选（HCA）中的应用，而这些领域通常需要对数百至数千个视野进行成像。目前已在自动化的多孔板显微镜中实现了激光扫描TCSPC FLIM26 用于在鉴定后的二次测量 "命中数" 通过稳态偏振分辨荧光各向异性成像27，其成像速度可达到与光谱比率成像相似的水平28 与其具有许多相同的优点和缺点。荧光各向异性成像利用FRET存在时受体荧光各向异性的降低，同时也对光谱串扰敏感。例如， 直接激发受体）。需要进行校准以校正偏振串扰，且无法直接测量FRET效率。

为了实现荧光寿命成像（FLIM）在高内涵筛选（HCA）中的优势，我们致力于解决图像采集速度以及技术普及性方面的问题。本文提供了一份完整的开源软件与硬件组件清单，可用于构建下文所述的自动化快速FLIM多孔板读取仪，并附有基于FRET的示例检测方法。在我们的方法29中，FLIM通过宽场时间门控成像实现，采用门控光学图像增强器（GOI），如图1所示；由于采用并行像素检测，该方法相比单光束扫描的TCSPC技术具有更快的成像速度和更低的光漂白效应。我们的openFLIM-HCA仪器可实现无人值守的FLIM检测，仅需数秒即可完成每个像素采集数百个光子（具体数量取决于样品亮度）的FLIM数据采集。结合将样品移至前一个视野所需的时间、调整采集参数以及维持样品聚焦所需的时间，通常每个视野的多孔板采集时间约为10秒25,28。光学切片可通过准宽场Nipkow（"旋转盘"）扫描器实现30。

对于荧光寿命成像（FLIM）数据分析，我们开发了一款名为 FLIMfit31 的开源软件工具，该工具可在常规PC工作站上快速分析多孔板FLIM数据集，并且是OMERO32的插件。FLIMfit 提供全局分析功能（见第1.2节），可在假设荧光寿命组分在整个图像或感兴趣区域（ROI）内保持不变的前提下，将FLIM数据拟合至复杂模型，且每个像素仅需数百个光子即可完成分析，从而减少所需检测光子数、降低样品的光照暴露以及缩短图像采集时间。在标准台式电脑上运行 FLIMfit，分析包含数百个视野（FOV）的数据集仅需数十秒的计算时间。因此，FLIM数据的采集与分析均可在适用于高内涵筛选（HCA）的时间尺度上完成。

openFLIM-HCA 硬件

我们的FLIM高内涵分析（HCA）实现包含六个关键组件：（i）带有光学自动对焦功能的荧光显微镜框架；（ii）电动（x-y-z）显微镜载物台；（iii）激发激光光源；（iv）配备门控光学增强器（GOI）、延迟发生器和相机的宽场时间门控FLIM系统；（v）用于数据采集与分析的计算机；以及（vi）用于光学切片成像的Nipkow圆盘扫描装置，以抑制离焦光信号。当检测弱信号时，这一点尤为重要，例如，来自细胞质膜上FRET生物传感器的信号，可能被细胞质荧光或盖玻片或培养基背景信号所淹没。时间门控FLIM数据通过使用超短脉冲激发辐射照射样品，将荧光发射成像至GOI的光电阴极，并在激发脉冲到达后，对GOI门控时间延迟的一系列设定值，采集一系列CCD图像上的GOI荧光屏图像而获得。随着激发后时间门控延迟的增加，荧光信号逐渐减弱，CCD采集到的一系列时间门控荧光强度图像构成了分析视场内所有荧光团衰减曲线所需的数据集。GOI的门控与激发脉冲同步，对于一系列CCD采集过程，时间门相对于激发脉冲的延迟在所需范围内设置为一系列递增的数值。该同步由延迟发生器实现，其包含一个"快速延迟盒"（提供最高20 ns、步长1 ps的延迟）和一个"粗调延迟盒"，后者提供的最小步长为25 ps。

对于荧光寿命成像（FLIM），激发光源可采用任意一种超快激光器。为方便起见，我们通常使用由光纤激光器泵浦的超连续谱光源，该光源可产生可见光谱范围内可调谐的皮秒脉冲，通过配备不同带通滤光片的电动滤光轮，可为任意荧光团选择合适的激发光。通常，我们在样品处使用的平均功率约为100–200 µW，脉冲重复频率为40或60 MHz。此类激发功率也可通过基于锁模钛掺杂蓝宝石激光器倍频的超快激光光源实现。需要注意的是，对于大多数实验，激发脉冲持续时间低于约100 ps已足够。另一个配备中性密度滤光片的电动滤光轮用于调节激发光强度。出于安全和操作便利考虑，激发光可通过单模光纤传输。宽场FLIM和光学切片FLIM的光路配置分别如图2和图3所示。有关所用具体组件的更多细节，请访问openFLIM-HCA wiki33。当前的元器件清单见补充材料。

对于宽场荧光寿命成像（FLIM），激发光辐射需要尽可能均匀地照射整个视场。为此，我们将激发激光束导向一个全息扩散器 "礼帽" 以10-50 Hz旋转的扩散器用于对激光散斑进行时间平均，扩散器平面成像至物镜的后焦平面。显微镜输出端的荧光图像被中继至门控光学成像器（GOI）的光阴极，GOI的荧光屏（有效区域对角线18 mm）通过一对相机镜头（放大倍率为0.7）成像至冷却科学CCD相机（芯片尺寸10.2 mm × 8.3 mm）的传感器上。系统由标准PC机控制，通过RS232协议与仪器连接。此外，使用Arduino微处理器控制激发光路中的快门，该快门仅在CCD相机采集FLIM数据时打开，并记录来自光电二极管的信号，该光电二极管用于测量经光谱滤波的超连续谱激发光源的平均功率。对于光学切片FLIM，激发激光通过单模保偏光纤耦合，直接连接至Nipkow盘扫描单元，如图所示 图3. Nipkow扫描单元输出的荧光图像被中继至GOI的光电阴极，系统其余部分与宽场FLIM相同。

openFLIM-HCA 软件

数据采集软件是用 µManager34提供完整的HCA数据采集功能，包括更改孔板成像顺序的选项、对任意视野采集时间序列、在测量过程中自动维持聚焦，以及控制激发和发射滤光轮和二向色镜切换器以实现自动多色成像。还可运行 "预扫描" 根据预设标准自动识别并记录适合的视野位置，以进行后续荧光寿命成像（FLIM）所需的荧光强度采集， 例如，根据强度。FLIM HCA 数据可保存为一系列 TIFF 文件，或保存为一系列 OME-TIFF 文件（即，每个视野一个文件，或整合多孔板中所有数据为单个 OME-TIFF 文件。有关 µManager 软件的更多信息及详细说明，请参见 openFLIM-HCA wiki33.

数据分析软件 FLIMfit31 是一个基于开源 MATLAB 的客户端，用于 OMERO 图像数据管理平台32，能够从 OMERO 服务器或计算机磁盘读取 FLIM 数据，如图4所示。该软件专为分析 TCSPC 或宽场时间门控 FLIM 仪器的数据而设计，具备多种功能，可对 openFLIM-HCA 获取的数据进行拟合，包括单指数衰减曲线拟合、双指数及更高复杂度的衰减曲线拟合，支持诸如偏振分辨荧光衰减曲线等模型。软件还可考虑固定或随时间变化的背景信号，并可使用实测的时空仪器响应函数（IRF），或采用理想化的 IRF 进行拟合，后者可根据完整的实验 IRF 测量结果逐像素进行时间偏移。荧光样品与 IRF 之间的全局时间差（t0）可通过荧光标准样品的测量确定。背景信号和 IRF 的空间变化也可被纳入分析。 FLIMfit 支持逐像素拟合 FLIM 数据，也可采用"全局分箱"或"全局拟合"方法，以实现对光子数较少（数百量级）的 FLIM 数据进行复杂衰减模型的拟合。

全局分箱是指在每个时间点上，将用户定义的感兴趣区域（ROI）内所有像素检测到的光子进行汇总，以获得足够数量的光子，从而能够拟合复杂的衰减模型。该ROI可以是整个视野（FOV），可以由用户手动定义，也可以通过图像分割工具确定。此外，还可以通过从其他图像分割软件导入掩膜（mask）到FLIMfit中来定义ROI。在FRET应用中，通常采用全局分箱方法拟合双指数衰减模型，以确定对应于发生FRET和未发生FRET的供体荧光团的荧光寿命组分，这些组分被假定在ROI内空间上保持不变；随后，在各像素上进行逐像素拟合，固定上述寿命组分值，以获得每个像素中发生FRET的供体荧光团所占的比例。

全局拟合 需要在整个视野（FOV）范围内，或在包含多个视野的FLIM数据集上，同时拟合寿命组分以及逐像素的FRET供体群体分数， 例如，来自多孔板实验或一系列荧光寿命图像。全局拟合能够利用图像中群体组分分数的空间变化信息，而这些信息在全局分箱方法中会丢失；因此，尽管计算量显著增加，全局拟合可为组分寿命的估计提供更强的约束，从而获得更可靠的结果35. FLIMfit 可在常规PC工作站上快速分析多孔板荧光寿命成像（FLIM）数据集，并实现全局拟合；例如，对于一个采用五个时间门控采集的多孔板时间门控FLIM数据集，共包含394个视野（FOV），每个视野为672 × 512像素，拟合至双指数衰减模型仅需32秒和2 GB内存31通过采用多线程并行算法实现的可分离非线性最小二乘拟合算法，实现了在多核处理器上的高效扩展 FLIMfit 代码已优化以最小化内存使用。 图5 展示了图形用户界面的一个快照 FLIMfit 更多详细信息可参见参考文献36中给出的网页。关于全局拟合和全局分箱的进一步信息可参见参考文献31。

以下使用我们的 openFLIM-HCA 仪器与软件进行荧光寿命成像高通量分析（FLIM HCA）的实验方案，可适用于多种具有 FLIM 检测读数的细胞成像实验。通常，多孔板 FRET 实验的设计应包含待研究条件之外的阳性与阴性生物学对照的重复孔。本文描述了对表达 FRET 构建体的 Cos 细胞进行光学切片 FLIM 分析（见图3）的具体实施方法，该构建体由 mTurquoise 荧光蛋白与 Venus 荧光蛋白通过一段短肽连接子连接而成。其中，mTq32V、mTq17V 和 mTq5V FRET 构建体（参见代表性结果部分）分别提供低、中、高 FRET 效率，同时包含不发生 FRET 的 mTq5A 构建体。这些构建体及其他执行本方案所需的材料均列于材料清单中。

方案

1. 多孔板阵列的制备

  1. 配制75 μM Coumarin 6的乙醇溶液（τ ~ 2.43 ns），用于参考测量，以确定t0。
  2. 将150,000个Cos细胞接种至6孔板的四个孔中，加入培养基过夜培养使其贴壁（参见材料清单）。
  3. 使用商用转染试剂，按照生产商说明书分别对四个孔中的细胞转染mTq5A、mTq5V、mTq17V和mTq32V，并继续培养24小时。
  4. 按照生产商方案，使用商用胰蛋白酶/EDTA溶液消化细胞使其脱离。
  5. 将表达mTq5A的Cos细胞（5,000个）重悬于Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，每孔加入至已用多聚-L-赖氨酸处理过的#1.5厚度玻璃底96孔板的A1-G3孔；同法将表达mTq5V的细胞加入A4-G6孔，表达mTq17V的细胞加入A5-G9孔，表达mTq32V的细胞加入A10-G12孔。
  6. 保持H1孔为空（用于检测多孔板本身的静态背景信号）。
  7. 向H2孔中仅加入200 µL HBSS（用于检测细胞培养基可能产生的背景信号）。
  8. 向H3孔中加入5,000个未转染的细胞悬液（HBSS中）（用于检测细胞自发荧光可能产生的背景信号）。
  9. 向H4孔中加入200 µL 75 μM Coumarin染料溶液（用于监测多孔板检测过程中t0的可能变化，例如由于环境温度变化或激光器及计时电路波动所致）。

2. openFLIM-HCA 数据采集

注意：详细信息可在 openFLIM-HCA 维基上找到33。

  1. 开始 µManager 以及 OpenFLIM-HCA 插件
  2. 选择适用于特定延迟发生器单元与激光重复频率组合的校准文件 "FLIM 控制：延迟盒校准文件：校准文件" .
  3. 设置数据保存的文件夹位置 "文件：设置基础文件夹".
  4. 检查激发光光路，确保激发光稳定耦合至传输光纤，并通过功率计测量传输光纤输出的光功率，以最大化耦合效率。光功率波动低于5%为可接受范围。
  5. 通过将GOI的输入触发信号作为示波器的触发源，同时显示GOI的监视器输出信号，来检测GOI触发是否稳定。
  6. 通过遮盖GOI的光阴极，将其增益设置为750 V，并调节其中一个中继透镜的焦距，使CCD记录到的稀疏单光子事件（由背景光泄漏穿过GOI盖板引起）图像尽可能清晰，从而检查GOI磷屏在CCD传感器上的成像效果。
  7. 通过成像均匀的荧光样品（例如盖玻片上的参考染料溶液液滴），使用足够低的激发光功率，检查样品视野是否 illumination 均匀< 1 µW），以确保目的基因（GOI）未达到饱和状态。
  8. 选择合适的平板定义文件， 即， 选择96孔板的选项（"文件：加载板属性").
  9. 使用 µManager GUI中，通过选择空位确保显微镜框架中无二向色分光立方体。
  10. 在整个实验中，为 GOI 手动选择 4 ns 的门宽。
  11. 获取IRF图像数据：
    1. 使用 µManager 图形界面中，通过选择空位确保光路中无显微镜物镜。手动将黑色阳极氧化光束挡板放置在物镜转换器上方，以防止激光逸出，并调整其角度以最小化反射回显微镜主体的光线。
    2. 使用 µManager 图形用户界面，设置 CSUX 中的滤波器（激发，二向色镜，发射）调整至可成像来自旋转尼康夫盘的激发光散射部分，但需确保其强度在200 ms的CCD积分时间内不足以使系统饱和。这是为了避免对目标基因（GOI）光电阴极暴露过多光照，从而可能损伤光电阴极。
    3. 使用 找到最大值点 在可编程快速延迟箱覆盖的整个延迟范围内进行功能检测。检查显示的输出图，然后按下前进按钮调节手动粗调延迟箱，使完整的IRF谱线位于快速延迟箱的扫描范围内。
    4. 调整采集参数（中性密度，曝光时间，帧累积）以确保CCD在最亮的时间门内不发生饱和，且有效积分时间为 >200 ms
    5. 在整个延迟范围内设置25 ps的延迟步长（"FLIM 控制：快速延迟盒：设置延迟").
    6. 按下以获取IRF图像 "Snap FLIM 图像".
    7. 通过阻断激光获取背景图像（"光路控制：中性密度：阻断"），减少延迟次数（"FLIM 控制：快速延迟盒：当前延迟设置（ps）"），其余属性保持不变，然后按下 "Snap FLIM 图像".
  12. 获取参考染料数据：
    1. 使用以下方法选择 H4 孔 µManager 图形用户界面 ("XYZ 对照：移至孔位：H4").
    2. 使用 µManager GUI中，选择滤光片（激发光434/17 nm，二向色镜，发射光482/25 nm）以对mTqFP进行成像。
    3. 使用 找到最大值点 在整个快速延迟箱的范围内进行调节，然后调整粗调延迟箱，使完整的衰减曲线位于快速延迟箱的延迟范围之内。
    4. 将延迟调整至强度最大的位置 "FLIM 控制：快速延迟盒：当前延迟设置（ps）". 调整采集参数（中性密度，曝光时间以确保CCD不饱和。
    5. 在整个延迟范围内设置25 ps的延迟步长（"FLIM 控制：快速延迟盒：设置延迟).
    6. 按下以获取参考染料数据 "Snap FLIM 图像".
    7. 通过阻断激发激光（参见2.11.7）获取第二张背景CCD相机图像
  13. 使用FLIM技术获取多孔板样品的数据 µManager 采集软件：
    1. 设置需要成像的孔以及每孔采集的视野数（"设置高内涵筛选的序列采集：XYZ位置").
    2. 手动选择一个包含待成像样本的代表性视野（FOV）。利用该视野确定最佳中性密度滤光片、目标基因（GOI）的门宽以及相机的积分时间，以使CCD相机的动态范围达到其75%。
    3. 设置自动对焦（"XYZ 控制：自动对焦")：按压 "仅返回焦点控制"，然后手动聚焦到目标细胞或结构上。设置 "自动对焦搜索范围" 至2000 µm并按压 "输入". 按压 "心房颤动现在" 以启动自动对焦程序。偏移值将显示在该字段中 "焦平面偏移（自动对焦）".
    4. 输入在 2.13.3 中获得的偏移值 "AF偏移" 并重复自动对焦程序两次（"心房颤动现在"检查偏移值是否已为零，以确认自动对焦系统的正常功能。
    5. 使用 "AutoGate" 功能在 OpenFLIM-HCA 使用采集软件选择延迟点的对数采样。或者，也可手动选择这些点，详见参考文献36。
    6. 设置 "累积帧" 以达到所需的目标总数据采集时间。增加累积帧数可提高荧光寿命成像（FLIM）数据的信噪比，但同时也会延长FLIM数据的总采集时间。
    7. 通过按下按钮运行多孔板的荧光寿命成像（FLIM）采集 "开始HCA序列" 按钮
  14. 使用与FLIM数据采集相同的采集设置，通过阻挡激发激光（见2.11.7）获取另一幅背景CCD相机图像。

3. 使用 FLIMfit 进行 openFLIM-HCA 数据分析

  1. 检查进行荧光寿命成像数据分析所必需的辅助文件是否齐全（即，IRF 和参考染料检测）。
  2. 将空孔（H1）、含培养基的孔（H2）以及含未标记细胞的培养基孔（H3）的数据导入 FLIMfit"文件：加载 FLIM 数据"）以检查是否存在任何高于表达细胞信号1%的背景贡献 "仅供者", 即， 在 A1-G3 孔中。
  3. 通过将含有培养基的孔板加载到 FLIMfit"文件：加载荧光寿命成像数据")加载第 2.14 节中获取的相机背景数据 ("背景：加载背景") 并使用 FLIMfit 选项 "工具：创建 TVB 强度图" 以生成TVB。有关TVB的更多细节，请参见参考文献31。
  4. 通过载入2.11节中获取的IRF数据并减去2.11.7节中获取的CCD相机背景，制备空间变化的IRF偏移图。使用 FLIMfit 选项 "工具：创建 IRF 偏移图" 用于计算空间变化的IRF偏移图。有关IRF偏移图的更多细节，请参见参考文献[31]。
  5. 将单指数衰减拟合到 2.12 节中获取的参考染料数据。加载参考染料以及 3.4 节中计算得到的空间变化 IRF 图谱，设置拟合参数（"寿命：实验编号：1") 与 t0 设为拟合参数（"寿命：FIT IRF 位移：拟合"）。该值的 t0 获得的结果随后呈现在下表所示的 "参数" 表。
  6. 加载第2.13节中获取的实验FLIM数据、第3.4节中计算的空间变化IRF图、第2.14节中获取的相机背景、第3.3节中准备的TVB文件，并输入负值 t0 在第3.5节中获得（"IRF：IRF 漂移：t0"）。然后使用所需的衰减模型拟合实验数据 FLIMfit36 根据实验要求。

结果

为展示 openFLIM-HCA 仪器的功能，我们呈现了三个典型的 FRET 应用实例。第一个实例涉及源自 Stephen Vogel 实验室开发的 FRET 模型构建体38。这些构建体包括一系列可遗传表达的荧光构建体，其中供体荧光蛋白（mTurquoise）通过长度受控的短肽连接子（分别为 5、17 和 32 个氨基酸）与受体荧光团（Venus）相连（即 mTq5V、mTq17V、mTq32V）。供体与受体荧光团之间不同的连接子长度导致不同的 FRET 效率，因而产生不同的供体荧光寿命。为提供阴性对照，将短连接子（5 个氨基酸）构建体中的 Venus 替换为 Amber——一种 YFP 的非荧光突变体（mTq5A），其不能作为 FRET 受体38。我们通过使用 NheI 和 BglII 酶对原始 pCXV 和 pC5A 载体进行限制性酶切，并连接来自 pmTurquoise-N1 载体的经相同酶切的 mTurquoise 片段，将原始载体中的 Cerulean 替换为 mTurquoise。该替换过程未改变连接子区域。

图6展示了在此模型系统中于Cos细胞中表达的典型FLIM FRET检测结果，其中多孔板的1-3列分别排列了转染阴性对照的细胞，4-6列为5个氨基酸连接子的FRET构建体，7-9列为17个氨基酸连接子的FRET构建体，10-12列为32个氨基酸连接子的FRET构建体。H行包含用于TVB估算的孔。 图6(a)显示了每个孔中典型视野下自动获取的荧光寿命图像示例。显然，阴性对照（1-3列）具有最长的荧光寿命，而连接子最短的FRET构建体（4-6列）的供体荧光寿命最短。图6(b)展示了每孔中所有视野（FOV）平均的平均荧光寿命在多孔板上的分布情况。图6(c)和(d)分别展示了mTq5A和mTq17V在一个视野中的供体荧光强度合并寿命图的示例。图6(e)显示了A1孔中所有成像细胞的供体荧光强度衰减曲线，以及单指数衰减模型的拟合结果和仪器响应函数IRF（主要由GOI门宽决定）。图6(f)展示了通过对多孔板每列进行像素级单指数拟合得到的平均荧光寿命。表1列出了各列的平均荧光寿命及其标准差（STD）。图6所示图像的数据采集耗时约160分钟。数据分析在配备10核、2.6 GHz处理器和64 GB内存的计算机上耗时92秒。

第二个示范性检测展示了利用荧光寿命成像-荧光共振能量转移（FLIM FRET）技术检测HIV-1 Gag在HIV-1病毒颗粒组装过程中发生寡聚化，以此作为评估该过程抑制剂的方法25,42。在合适的宿主细胞中表达HIV-1 Gag可为此阶段的HIV-1生命周期提供一个模型系统，因为其能够形成类似于未成熟HIV-1病毒颗粒的病毒样颗粒（VLPs）。在本检测中，我们在HeLa细胞中表达了与CFP融合的HIV-1 Gag蛋白，并通过不同抑制剂对Gag寡聚化所产生FRET信号的影响来比较其作用效果。所用抑制剂的具体信息见参考文献42。

样本制备与实验测量的详细步骤已在参考文献25中全面描述，在该研究中我们证明了可以利用荧光寿命成像（FLIM）读取聚集的Gag蛋白之间由CFP和YFP随机标记所介导的异源FRET，以及仅表达CFP标记Gag蛋白细胞中的同源FRET。尽管同源FRET通常不会引起供体荧光寿命的变化，但在CFP这一特殊情况下确实会产生变化，因为该荧光团存在两种具有不同平均荧光寿命的异构体40,41。相较于CFP/YFP异源FRET，CFP同源FRET检测具有样本制备更简便以及光谱利用效率更高的优势，这对于多重FRET检测可能尤为重要。

我们之前的工作应用荧光寿命成像-荧光共振能量转移（FLIM FRET）技术，在存在N-肉豆蔻酰转移酶（NMT）抑制剂的条件下检测Gag的寡聚化42该抑制剂可破坏负责将豆蔻酸添加至Gag蛋白的内源性酶，从而阻止Gag蛋白与质膜结合，而这一修饰是Gag蛋白膜定位的先决条件43 在HIV病毒颗粒或病毒样颗粒（VLPs）的形成过程中，我们证明异源FRET和同源FRET检测均可达到Z'值 >在使用NMT抑制剂的剂量反应研究中，Z'因子是制药行业中用于指示检测质量的一个参数，它反映了阳性对照与阴性对照的平均值之间的差异及其相对离散程度，从而生成一个用于评估检测质量的单一数值指标—— Z' > 0.5 被视为 "优秀" 用于药物分析44我们注意到，这种优异的性能是在样本的平均供体寿命变化约为300皮秒（ps）的情况下实现的——这表明，通过分析大量细胞的荧光寿命成像（FLIM）数据具有强大的统计学能力，使得即使荧光寿命的变化远小于手动显微镜实验中通常成像的细胞数量所能检测到的程度，也能获得有意义的读数。

在此，我们提供一个多孔板FLIM FRET数据集，用于比较4种针对HIV Gag寡聚化的抑制剂化合物（分别标记为ICL13、ICL14、ICL15） & ICL16)。本实验采用均相荧光共振能量转移（homoFRET）检测方法，使用瞬时转染Gag-CFP质粒的HeLa细胞。根据参考文献32中所述的标准方案，每种抑制剂设置九个不同浓度梯度，每种条件设两个重复孔。阳性对照为第1列，使用表达myr-Gag的细胞，该突变型Gag蛋白缺失豆蔻酸基团，无法形成病毒样颗粒（VLPs），模拟完全抑制状态。阴性对照为仅转染Gag-CFP的细胞，仅加入用于溶解其他列抑制剂的溶剂（第11列）。每孔采集八个视野（FOV）。

数据通过单指数衰减模型对每个像素进行拟合，下方显示的荧光寿命板图展示了每孔的平均寿命（基于八个视野中所有超过强度阈值的像素）。 图7(a). 图7(b) 显示荧光寿命随抑制剂浓度变化的相应曲线图。其中三种抑制剂显示出抑制作用（ICL13, ICL15） & ICL16）在与表达Gag-CFP的细胞共同孵育时表现出抑制作用。其中一个抑制剂（ICL14）在测试的所有剂量下均无任何效果。该板的Z'值为0.51。阳性与阴性对照组所得数值如图所示。 图7(b) 如黑色标记的点所示 100 µM 和 0.1 nM。

ICL13、ICL15 和 ICL16 的剂量反应曲线如图所示 图7(b) 然后采用四参数逻辑斯蒂非线性回归模型进行拟合，其中Hill系数固定为145 最大和最小寿命分别固定为阳性对照（第1列）和阴性对照（第11列）所得的值。返回的IC50 三条曲线的值分别为：ICL13 为 38 nM，ICL15 为 24 nM，ICL16 为 116 nM。为与 IC 进行比较50 通过细胞内荧光寿命成像显微（FLIM FRET）测量获得的数值，我们确定了IC50 用于抑制重组人NMT1在我们先前报道的生化酶活性测定中的酶活性42. 通过荧光寿命成像共振能量转移（FLIM FRET）发现具有活性的三种化合物在此项检测中也表现出最强的活性（IC50 分别为 ICL13、ICL15 和 ICL16 提供了 17 nM、51 nM 和 39 nM 的值，而 ICL14 在 FLIM FRET 测定中未显示出显著反应，因此被排除 约 对 NMT1 的活性低 100 倍（IC50 为1700 nM）。对于活性化合物，其IC50 通过这些独立的检测方法获得的数值 remarkably 相似，微小的差异可能归因于化合物在细胞中的摄取或代谢差异。

本项小型研究凸显了荧光寿命成像高内涵分析（FLIM HCA）在区分作用于同一靶标的不同化合物效力方面的能力。我们认为，这是首次在高内涵背景下利用自动化荧光寿命成像（FLIM）进行筛选，以生成多条剂量-反应曲线的示范性研究，展示了FLIM在筛选和/或表征具有潜在治疗价值的化合物方面的应用前景。

第三个FLIM FRET实验示例涉及一种基因表达的FRET生物传感器，用于检测由环磷酸腺苷（cAMP）激活的交换蛋白（EPAC），EPAC是一种Rap-1鸟嘌呤交换因子，可特异性结合cAMP。该EPAC FRET生物传感器（EPAC-SH188）以mTurquoise2荧光蛋白（mTq2FP）作为供体荧光团，并包含两个Venus-FP以构成复合受体46。cAMP是一种普遍存在的第二信使，参与多种生物体内的大量细胞内过程。它由腺苷酸环化酶在细胞膜上将ATP转化生成。本文中，我们展示了在向活体HEK293T细胞中加入腺苷酸环化酶激活剂佛司可林后，读取并定量其活性的能力；佛司可林可上调细胞内cAMP的生成，从而提高其胞质浓度。该EPAC传感器在非激活（未结合）状态下发生FRET，随着cAMP浓度升高，供体荧光寿命随之增加，因为cAMP导致生物传感器构象打开。mTq2FP的单指数衰减特性使得该生物传感器相较于基于CFP的生物传感器更适用于定量寿命分析45。图8展示了一个使用自动化多孔板FLIM显微镜记录的时间过程示例，其中我们绘制了加入100 µM佛司可林后，平均寿命的变化以及发生FRET的供体群体比例随时间的变化。为简化分析，我们假设总信号可由发生FRET和未发生FRET的单指数供体混合描述，并通过对时间序列数据拟合双指数衰减曲线，获得激活态EPAC FRET生物传感器的群体比例。

在cAMP（EPAC）数据采集过程中，选择了五个门延迟，门宽为4,000 ps，延迟时间分别设置为1,300 ps、4,300 ps（峰值强度）、4,919 ps、6,656 ps、8,035 ps、10,391 ps和16,000 ps。每个延迟的相机积分时间为250 ms。在单个孔中，我们采集了FLIM时间序列，每10秒获取一次图像，持续10分钟。由于加入forskolin导致样品的焦平面发生轻微偏移，从而影响了该时间点FLIM采集的荧光强度，因此在120 s和130 s时采集的数据点被剔除。

数据分析时，将图像导入 FLIMfit 软件，并按单个细胞进行分割。荧光寿命数据采用参考染料（75 µM Coumarin 6）获得的仪器响应函数（IRF）和固定的 t0 值，拟合为双指数衰减模型。所有细胞的供体荧光平均寿命如图8(a)所示。图8(b)展示了通过将相同的荧光寿命成像（FLIM）数据拟合至相同的双指数衰减模型所计算得到的FRET群体比例随时间的变化。

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其中 β 为发生 FRET 的供体比例。我们假设在加入佛司可林之前的时间点，体系中同时存在发生 FRET 和未发生 FRET 的组分。为获得这些寿命值，对前三个时间点的数据进行了双指数拟合，得到未发生 FRET 的供体寿命为 τ1 = 3,964 ± 21 ps，发生 FRET 的供体寿命为 τ2 = 3,022 ± 27 ps。在后续对整个数据集的拟合中，这两个寿命值被固定，以求得每个时间点的 β 值。

总之，我们展示了三种实验样品的典型荧光寿命成像高内涵分析（FLIM HCA）结果。第一种样品为96孔板，其中接种了表达FRET构建体的Cos细胞，该构建体包含一个mTqFP供体，通过不同长度的肽连接子与Venus荧光蛋白（FP）受体或非荧光的Amber构建体相连。随着连接子长度的变化，FRET效率及相应的供体荧光寿命的改变清晰可见，每种构建体的平均寿命标准差均小于36 ps。第二种典型实验为一项 "屏幕" 针对HIV Gag蛋白肉豆蔻酰化反应的四种潜在抑制剂，通过在表达CFP标记Gag蛋白的HeLa细胞中测定供体荧光寿命随抑制剂浓度变化的情况，计算其抑制百分比。该检测方法基于同源荧光共振能量转移（homoFRET），通常情况下供体荧光寿命不会因此发生变化，但由于CFP存在多种具有不同荧光寿命的异构体，故可观察到寿命变化。该特性在光谱效率方面具有一定应用价值。 例如， 用于多重检测不同的FRET信号读出25第三个示例实验是对表达cAMP FRET生物传感器EPAC的活体HEK293T细胞进行时间过程监测。结果显示，在佛司可林处理及后续应用后出现预期的反应。 FLIMfit 使用双指数衰减模型，检测到的光子数与活细胞成像相匹配——正如我们之前利用用于IP3的LIBRA FRET生物传感器所展示的那样47.

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图1. 使用门控光学图像增强器（GOI）的宽场时间门控荧光寿命成像示意图。左侧显示实验系统的示意图。右上方为激发脉冲示意图、时间门控图像的位置以及对数据的单指数拟合结果。右下方为卡通图，显示实验系统中两个物体的荧光衰减过程。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2. 使用门控光学图像增强器（GOI）的宽场开放式荧光寿命高通量成像（openFLIM-HCA）示意图。有关系统组件的更详细描述，请参见正文。请点击此处查看此图的放大版本。

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图3. 使用带有时序门控光学图像增强器（GOI）和尼普科夫盘扫描单元的光学切片 openFLIM-HCA 系统示意图。有关系统组件的更详细描述，请参见正文。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4. 图像数据从Manager采集程序传输至OMERO服务器或计算机磁盘，并进入FLIMfit进行分析的示意图。 数据流始于左上角，原始图像数据通过μ-Manager采集软件获取。虚线框内的部分表示FLIM数据分析的各个阶段，而框外部分则对应数据采集与存储过程。请点击此处查看该图的高清版本。

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图5. FLIMfit 用户界面截图。左上方为当前加载的视野列表及所选视野的荧光强度图像；左下方为拟合模型与拟合条件的选择区域；右上方为当前感兴趣区域的荧光衰减曲线（蓝色圆点）、数据拟合结果（红线）、仪器响应函数 IRF（红色虚线），下方为拟合残差（蓝线）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6. 在Cos细胞中表达的FRET模型构建体mTq5V、mTq17V、mTq32V的多孔板荧光寿命成像（FLIM）。（a）在文本中讨论的于Cos细胞中表达的不同FRET构建体，每孔视野（FOV）的代表性荧光寿命图像。（b）每孔中所有细胞平均的Venus荧光寿命热图。（c）mTurquoise Amber的强度图像与寿命图叠加（比例尺20 µm）。（d）mTurquoise Venus（17个氨基酸）的强度图像与寿命图叠加（比例尺20 µm）。（e）对A1孔中所有成像细胞的mTq5A构建体（阴性对照）荧光信号取平均后测得的强度衰减曲线（蓝色圆圈），以及单指数衰减拟合结果（蓝色实线）和仪器响应函数IRF（橙色虚线）。（f）沿多孔板各列平均后的平均寿命图，误差棒表示不同视野间荧光寿命的标准偏差。对于（a-d），寿命值采用伪彩色标尺表示，范围以皮秒（ps）为单位标示。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图7. 利用表达 Gag-CFP 的 HeLa 细胞进行 Gag 抑制剂多孔板荧光寿命成像显微（FLIM）筛选的示例。（a）多孔板中各孔供体平均荧光寿命的热图，其中第1列显示转染了myr-Gag-CFP的细胞，作为抑制作用的阳性对照；第11列显示转染了Gag-CFP但仅暴露于溶剂的细胞；虚线彩色方框表示已加入四种不同抑制剂的孔，其浓度从第2列的高剂量递减至第10列的低剂量。伪彩色标尺表示平均荧光寿命范围为2,200 ps至3,100 ps。（b）显示每种抑制剂的荧光寿命，误差棒表示重复孔之间的标准偏差。横轴上位于2和-4的黑点分别为来自第1列和第11列的阳性与阴性对照点。实线表示对不同抑制剂的剂量反应曲线数据的拟合结果。请点击此处查看该图的放大版本。

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图8. 使用FLIM在HEK293T细胞中进行时间推移测量以读取EPAC FRET生物传感器的典型应用。 加入佛司可林（绿色条表示）后，（a）平均荧光寿命和（b）发生FRET的供体分子比例随时间的变化。误差棒表示每个细胞的标准误差。请点击此处查看该图的高清版本。

每孔标准差误差每孔标准差误差
mT5A40083212mT17V30042610
mT5V27173513mT32V31333011

表1. FRET 构建体的平均寿命及标准差（STD）。

讨论

我们介绍了一种用于时间门控荧光寿命成像显微镜（FLIM）高内涵筛选（HCA）的自动化多孔板显微镜。该仪器通过使用开源软件进行控制，软件以 µManager 可选择将数据保存至 OMERO 服务器，并使用以下方法进行 FLIM 数据分析 FLIMfit36, 一个用MatLab编写的开源程序，可作为OMERO客户端使用32 该 µManager 仪器控制软件 openFLIM-HCA，可在线获取33 包含系统组件列表48 使学术研究人员能够自行构建荧光寿命成像高内涵分析（FLIM HCA）仪器。

为了获得可靠的荧光寿命成像（FLIM）数据，必须优化感兴趣信号增益（GOI）和CCD采集参数，并考虑t0的任何变化。如3.8.2节所述，应设置GOI增益和CCD相机积分时间，使信号达到CCD动态范围的约75%。在每个时间门延迟处使用较高的GOI电压以及多次CCD帧累积可提高信噪比49，但这会增加总的FLIM采集时间（因为在CCD相机饱和前每帧采集的荧光光子数较少，因此需要增加帧累积次数），因此应根据每个实验的具体情况权衡这一取舍。延迟发生器的校准取决于激光重复频率，因此必须确保将对应所用重复频率的正确校准文件加载到采集软件中。延迟盒的校准程序可在openFLIM-HCA Wiki33上找到。

如果细胞自发荧光相对于荧光信号较低，我们使用仅含培养基的孔中的信号来提供随时间变化的背景（TVB）。为了最小化细胞培养基产生的背景荧光，我们避免使用含有酚红的培养基。如果细胞自发荧光较强，则TVB可通过未标记细胞的测量值获得。然而，在这种情况下必须谨慎，因为该方法假设图像中每个像素的自发荧光背景相同。如果细胞内自发荧光在空间上存在显著差异，或激发光束及检测灵敏度在视场范围内不均匀，则该假设将不成立。

利用散射的激发光脉冲获取仪器响应函数（IRF）图像，可提供在拟合过程中与数据模型进行卷积的时间IRF轮廓，同时提供视场内IRF空间变化的分布图。可通过成像散射样品（如胶体悬浮液）来测量IRF，但在本仪器中，使用来自Nipkow转盘的激发光散射可获得更清晰的IRF测量结果。准确确定IRF的时间特性至关重要，因为激发光与时间门控之间的时间延迟误差会显著影响拟合过程，尤其是在拟合复杂的指数衰减模型时。利用散射激发光获取的IRF并不完全适用于拟合过程，因为其记录的是激发波长而非荧光发射波长处的信号，这可能影响其时间特性，尽管IRF的空间变化在两个波长下应保持一致。此外，由于散射物体引起的光路长度不同，散射IRF相对于真实IRF可能存在全局性的时间偏移，例如在光学切片FLIM中从Nipkow转盘获取的IRF即属此情况。该校正量t0是指需施加于所获取的散射激发光IRF上的全局时间偏移量，其值根据协议步骤4.4中所述的单指数参考染料数据计算得出。以下染料可用于不同激发波长：75 μM香豆素153的甲醇溶液（τ ~ 4.3 ns50）适用于295–442 nm范围内的激发；75 μM香豆素6的乙醇溶液（τ ~ 2.43 ns37）适用于430–500 nm范围内的激发；75 μM罗丹明B的水溶液（τ ~ 1.7 ns37）适用于488–575 nm范围内的激发。需注意，尽管在FLIMfit中可以为系统的每个像素使用不同的IRF，但通常可合理假设空间变化的IRF在图像中每个像素具有相同的时间轮廓，仅相对于全局t0存在一系列空间变化的时间偏移。我们将此称为IRF偏移图，其由散射光IRF确定。IRF轮廓、t0和IRF偏移图共同用于确保视场中每个像素均使用适当的IRF进行拟合。重要的是，t0可能随时间缓慢变化，因此应在任何FLIM数据采集之前进行测量。

用户应决定如何采样荧光衰减曲线，并需设置时间门的宽度及其相对于激发后的延迟时间。通常，建议使用较宽的门宽以最大化检测到的信号，对于荧光蛋白标记细胞的荧光寿命成像（FLIM），我们通常将门宽设为 4 ns。时间门延迟的数量应足以采样荧光衰减曲线（包括一个设置在激发脉冲前以测量背景信号的门），具体数量取决于分析中所用拟合模型的复杂程度。最佳数值可能依赖于衰减组分的寿命及其相对幅值。一般而言，拟合单指数衰减使用 4 个门即可，而对于更复杂的衰减模型，则可能需要 7 个或更多的时间门。

我们注意到，荧光寿命成像（FLIM）可通过多种时域或频域技术实现，而针对多孔板阵列的自动化FLIM高内涵筛选（HCA）最初是在一种（非光学切片）宽场显微镜上利用FRET的频域寿命读出实现的51。随后，首个用于HCA的自动化光学切片FLIM多孔板检测仪被报道，该系统采用宽场时间门控成像技术28。此后，宽场（非光学切片）频域FLIM HCA被应用于基于FRET的基因文库中翻译后修饰（酪氨酸磷酸化）的筛选52，而时间门控FLIM HCA则已被用于HIV-1 Gag寡聚化的FRET检测53、FOXM1的SUMO化修饰分析54以及Raichu RhoA和Rac1生物传感器的研究33。此外，也可使用TCSPC技术进行多孔板FLIM检测26，但迄今为止，该方法在通量方面仍难以匹敌基于宽场检测的技术。一种有望解决此问题的新兴方法是采用单光子计数探测器阵列，例如SPAD阵列55。

需要注意的是，使用荧光蛋白进行FRET检测时应谨慎对待任何读数，且从FLIMfit或其他任何FLIM分析软件获得的参数绝对值将取决于拟合模型所关联的假设。例如，当FRET供体具有显著的第二衰减组分时，若采用双指数模型拟合FRET-FLIM数据，可能导致与发生FRET的群体相关的快速衰减组分贡献被高估。因此，最好使用具有单指数寿命的供体，如mTq2FP。即便如此，最近的研究表明，FRET分析仍可能受到受体荧光蛋白暗态的影响，或因荧光团构象分布导致的多种发色团角度和距离而引起取向因子κ2的异质性56。尽管如此，我们及其他研究者已证实，基于荧光寿命的FRET读数确实能够产生与生物化学测量结果相关联的有用数据，可用于筛选蛋白质相互作用或监测生物传感器的动力学变化。因此，该openFLIM HCA平台可广泛应用于基于荧光寿命的各种检测，包括利用FRET或细胞自发荧光的实验8，以及基于染料探针的定量读出25。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

致谢

作者们衷心感谢来自英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC BB/E003621/1、BB/H00713X/1 和 BB/M006786/1）、英国技术战略委员会（技术奖项 CHBT/007/00030、EP/C54269X，与阿斯利康、GE 医疗、葛兰素史克、Kentech Instruments Ltd 合作）以及惠康基金会（WT 095931/Z/11/Z）的资助。FG 感谢英国工程与物理科学研究理事会（EPSRC）提供的博士生奖学金。DA、DK 和 SW 感谢由工程与物理科学研究理事会（EPSRC）资助的化学生物学研究所博士培训中心提供的博士生奖学金。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
显微镜框架OlympusIX81http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
光学自动对焦系统OlympusZDChttp://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
电动（x-y-z）显微镜载物台Marzhauser00-24-565-0000配备 Corvus 控制器
激发激光光源FianiumSC400-4超连续谱激光器 http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/
门控光学增强器 KentechHigh Rate Imager (HRI)
延迟发生器Kentech---参见 agile delay generator 和 precision delay generator
相机HamamatsuORCA-ER-II
Nipkow 盘扫描单元 YokogawaCSU-X1 http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/
平顶光束扩散器ThorlabsED1-S20-MD工程化扩散器
mTq5V Oxford GeneticsP3850含5个氨基酸连接子的 mTurquoise Venus 构建体
mTq17VOxford GeneticsP3847含17个氨基酸连接子的 mTurquoise Venus 构建体
mTq32VOxford GeneticsP3848含32个氨基酸连接子的 mTurquoise Venus 构建体
mTq5AOxford GeneticsP3849mTurquoise Amber 构建体
HEK293T------所用细胞类型
无酚红 HBSSSigma Aldrich55021C-1000ML成像培养基
培养基DMEM + 10% FBS + 0.5% 抗生素
DMEMSigma AldrichD6046-500ML用于配制培养基
FBSSigma Aldrich12003C-500ML用于配制培养基
xTremeGene9Sigma Aldrich6.37E+09用于转染，遵循 Roche 在线操作方案
胰蛋白酶/EDTA 溶液Thermo FischerR001100用于细胞消化，遵循 Thermo Fischer 在线操作方案

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