斑马鱼幼体性腺组织的解剖

摘要

本文介绍了一种分离幼体斑马鱼性腺组织的实验方案，该方法将有助于开展斑马鱼性别分化与维持机制的研究。

摘要

尽管野生斑马鱼具有 ZZ/ZW 性别决定系统，但驯化后的斑马鱼已丢失了性染色体，转而采用多基因性别决定系统，即由分布在基因组中的多个基因共同决定个体的性别。目前，参与调控性腺发育的基因及其作用机制仍不清楚。通常情况下，分离性腺组织是研究性别发育过程的第一步。本文介绍了一种从受精后 17 天（dpf）和 25 天（dpf）的斑马鱼幼鱼中分离性腺组织的操作流程。所获得的性腺组织可用于后续的形态学观察和基因表达谱分析。

引言

野生型斑马鱼4号染色体上的主要雌性性别决定因子在驯化型斑马鱼中丢失或发生改变即 常用实验室菌株¹相反，它们具有多基因性别决定系统，并受到温度、缺氧、食物可得性和种群密度等环境因素的影响。斑马鱼性别发育的详细机制尚未完全阐明。一些基本问题仍有待回答，例如斑马鱼性别决定发生的时间、主要的性别决定信号是什么，以及哪些基因调控性腺转化的第一步。^2,3.

在斑马鱼性别发育过程中，已确认存在几个重要阶段。在发育早期，从受精后4小时（hpf）开始，原始生殖细胞（PGCs）经历特化、向生殖嵴迁移并增殖。原始生殖细胞的数量以及生殖细胞与体细胞之间的相互作用对性腺分化至关重要⁴。在受精后13天（dpf），性腺处于未分化阶段。到17 dpf时，无论未来发育为雌性还是雄性，性腺均发育为具有双向潜能的卵巢。从卵巢向睾丸的转变始于21至25 dpf，该过程依赖于细胞凋亡，并可能持续数周。到35 dpf时，性腺性别已确定，卵巢和睾丸均开始进行性别特异性的配子生成^5,6,7。

迄今为止，已提出多种与性别决定相关的候选基因和机制。蛋白质组学和转录组学分析分离出许多具有性别二态性表达的基因，这些基因已被用于研究斑马鱼的性别分化^8,9,10。例如，在斑马鱼幼体中，cyp19a1a 基因特异性地在卵巢中表达，而在精巢中不表达^11,12。此外，amh 基因在卵巢滤泡颗粒细胞中弱表达，但在精巢支持细胞（Sertoli cells）中强表达¹³。相反，vasa 基因在雌性和雄性斑马鱼的生殖细胞中持续表达，因此可作为合适的性腺标记基因^14,15。

研究性腺基因表达水平对于理解性别决定和分化的分子机制至关重要，尤其是在双潜能卵巢阶段^3,9然而，幼年斑马鱼体型较小，其性腺相应也较小，这使得性腺组织的分离以进行后续分子分析变得困难。以往的研究采用显微解剖从鳃盖至肛孔之间的整个躯干区域¹⁶该组织样品虽然含有性腺，但由多种组织和器官组成。 alternatively，可采用性腺特异性表达GFP的转基因动物（如vasa:EGFP）用于性腺组织的分离。 通过 荧光激活细胞分选（FACS）和激光捕获显微切割^17,18但其广泛应用受到限制。本文介绍一种简单的方法，用于分离17天和25天龄幼鱼斑马鱼的性腺组织。我们展示了性腺相对于其他器官的位置，并从周围组织中分离出形态完整的性腺。进一步展示了性腺特异性基因，如vasa和 cyp19a1a 通过定量PCR（qPCR）分析发现，这些基因在分离的性腺中的表达水平显著高于躯干组织。本实验方案可实现对幼年斑马鱼性腺特异性基因的鉴定、分离、RNA纯化及扩增，从而为进一步开展性腺组织的分子分析提供支持。¹⁹.

方案

斑马鱼实验已获得复旦大学实验动物福利与使用委员会的批准。斑马鱼的饲养和繁殖均按照标准程序进行²⁰。

1. 准备工作

1. 培养17日龄和25日龄的幼年斑马鱼
   1. 在交配前一天傍晚，将2条雄性和2条雌性成年斑马鱼（健康，3至6月龄，实验室AB品系）转移至交配缸中，用隔板将雌雄分开。次日早晨更换缸内水体并移除隔板以允许其交配。受精后1至2小时，在100 mm培养皿中收集受精卵。
   2. 在早期发育阶段（4天内），将约40个胚胎置于含40 mL胚胎培养基（EM）的100 mm培养皿中，于28.5 °C培养，并每天更换两次EM。自5日龄（dpf）起，将幼鱼转移至1 L的养殖缸中（每缸40条幼鱼，300 mL系统水），并以活体轮虫喂养（充足供应，每日两次）。自10 dpf起，改用活体丰年虾替代轮虫进行喂养。在14 dpf时将鱼转移至循环水养殖系统²¹。
   3. 在循环水系统中继续培养幼年斑马鱼至17 dpf或25 dpf。确保光照/黑暗周期为14/10小时，系统水的pH值约为7.2。测量17 dpf幼鱼（体长5.5至6.8 mm）和25 dpf幼鱼（体长8至11 mm）的体长²²。
2. 制备2%琼脂板用于解剖。
   1. 将4 g琼脂加入200 mL无菌水中，在微波炉中加热至溶液透明。
   2. 将琼脂溶液冷却约15分钟，然后倒入直径为60 mm的培养皿中（约为培养皿体积的1/3）。将凝固后的琼脂板储存于4 °C。

2. 方案1：解剖17日龄和25日龄幼鱼的性腺组织

1. 将碎冰加入容器中，以麻醉17 dpf的幼鱼。用小塑料勺将已麻醉的幼鱼转移至含有30 mL冷Ringer's溶液的100 mm预冷培养皿中。将鱼保持在预冷的Ringer's溶液中孵育至少15分钟，以确保幼鱼完全麻醉。
2. 用小塑料勺将幼鱼转移至预冷的琼脂平板上。将整个鱼体浸入10 mL预冷的Ringer's溶液中，并轻轻使其侧卧。
3. 在25X体视显微镜视野下进行以下操作。用镊子夹住鱼体主干以固定。用另一把镊子从肛门至心脏方向纵向撕开腹部。轻轻去除身体一侧的皮肤和肌肉，以暴露内脏器官。
4. 小心移除位于 swim bladder（鳔）腹侧的器官团块。注意避免损伤附着在 swim bladder 上的性腺组织。
5. 切断 swim bladder 与前部躯体之间的连接，轻柔地拉出整个 swim bladder 及其相连的性腺组织。
   注：在17 dpf阶段，性腺组织通常包含周围的上皮组织和原肾管（protonephridium），这些结构彼此不易分离；但在25 dpf时可较容易分开。性腺还与肛门相连，在肛门处可见左右两侧性腺相互连接的交界结构。
6. 用镊子小心地将性腺组织从 swim bladder 上分离，并清除周围脂肪组织。
7. 立即将分离出的性腺组织转移至预冷的含有200 µL Ringer's溶液的1.5 mL离心管中。将离心管置于冰上，直至所有幼鱼的性腺组织均完成分离。
8. 按照步骤2.1 -  2.7所述方法解剖25 dpf幼鱼的性腺。

3. 方案2：分析分离性腺组织的基因表达

1. 从幼虫性腺组织中提取总RNA。
   1. 将分离的性腺组织转移至新的无RNase的1.5 mL离心管中，去除林格氏液。加入100 µL裂解液，涡旋振荡直至组织完全裂解。
   2. 按照试剂盒说明书进行总RNA提取操作。
   3. 向RNA溶液中加入1/10体积的10×DNase I缓冲液和1 µL DNase I，轻轻混匀。37 °C孵育20分钟。
   4. 向RNA溶液中加入1/10体积的DNase失活试剂，70 °C孵育10分钟。使用分光光度计测定总RNA浓度。于-20 °C保存。
2. 进行第一链cDNA合成
   1. 使用oligo(dT)-连接引物，按照生产商的说明书进行第一链cDNA合成。将1至2 µg RNA加入反应体系，总体积为20 µL。
   2. 在45 °C孵育反应液90分钟，随后在70 °C加热5分钟以终止反应。
   3. 向cDNA溶液中加入1 µL RNase H，以去除残留的RNA。轻轻混匀后，在约13,000 × g离心10秒，37 °C孵育20分钟。加入20 µL无核酸酶水，于-70 °C保存。
3. 进行荧光定量PCR
   1. 在带有荧光染料的PCR仪上进行qPCR。采用以下扩增程序：95 °C 15秒，Tm-5 °C 15秒，68 °C 30秒，共35个循环。引物序列如下：amh（正向：GTGGATGGCAGCAGTACGAC；反向：GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAATG），cyp19a1a（正向：GTCCTGTTGTCTCCTACTGTCG；反向：CATTTGAGTTGAATATGATGCCCTG），nanos3（正向：GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT；反向：CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC），vasa（正向：ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT；反向：CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC）和β-actin（正向：AGTGCGACGTGGACATCCGTA；反向：GCACTTCCTGTGGACGATGGA）¹⁹。

结果

对AB品系的斑马鱼幼鱼进行了性腺解剖。图1展示了17 dpf和25 dpf时斑马鱼幼鱼典型的性腺组织。首先，切开腹部一侧的皮肤和肌肉以暴露内脏器官。在移除内脏团块后，鱼鳔连同性腺保留在体腔内。性腺附着于鱼鳔的腹侧（图1B'中的箭头所示）。在17 dpf时，性腺处于双潜能卵巢阶段。分离得到的性腺包含左侧和右侧性腺，呈半透明状（图1C）。大多数情况下，其周围被覆有上皮组织和原肾管（图1C中的箭头所示）。在25 dpf时，性腺常被脂肪组织包裹（图1D）。在此发育阶段，可观察到较大或较小的性腺。未成熟卵巢体积较大，这是由于次级卵母细胞和滤泡细胞的发育增加了性腺体积（图1E）；而未成熟精巢体积较...

讨论

斑马鱼已成为一个强大的模式生物，被广泛应用于发育和疾病相关研究。成年斑马鱼器官（如脑、心脏、性腺和肾脏）的分离方法已有充分记录^23,24,25。由于幼体斑马鱼的性腺组织体积微小且处于动态重塑过程中，性腺组织的分离是一项具有挑战性的任务。以往研究通常采用整个解剖的躯干组织，或基于转基因 vasa:EGFP 的细胞分选及激光显微切割技术来分析幼体性腺²⁶。在斑马鱼驯化过程中，4号染色体发生了修饰，导致其性别决定机制至今仍不明确。本文所述方法可提供相对纯净且早期的性腺样本，适用于进一步的形态学和分子水平检测，有助于揭示斑马鱼的性别决定机制。

在发育早期阶段，将正在发育的性腺与其他结构分离并不容易。本方法描述了如何进行该解剖操作。要成功实施本实验方案，需注意一些关键步骤。首先，幼年斑马鱼的生长条件对于获得预期结果至关重要。幼年斑马鱼的性腺发育是一个高度动态的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养皿 100 mm	康宁	430167	用于胚胎培养
20x EM			配制1 L所需溶液：加入17.5 g NaCl、0.75 g KCl和2.9 g CaCl₂·2H2O；然后加入0.41 g KH2PO4, 0.412 g Na2HPO4 无水物和 4.9 g MgSO₄4·7H2O.
1x EM			将20倍浓缩的EM用蒸馏水稀释
AGAROSE G-10	基因	121985	用于制备2%琼脂平板
Trizol试剂	Invitrogen	15596-026	用于RNA提取
量杯玻璃	Shen Bo	250 ml	用于制备2%琼脂平板
微波炉	Midea	M1-211A	用于加热琼脂
镊子 DUMONT#5INOX	世界精密仪器公司	500341	用于解剖
体视显微镜	Motic	SMZ168	用于解剖
纯水设备	Millipore
林格氏液’s 溶液			对于需要的1 L溶液：加入6.78 g NaCl、0.22 g KCl、0.26 g CaCl2 以及1.19 g HEPES；然后加水定容至1 L；调节pH至7.2。经滤膜除菌后，保存于已灭菌的透明聚碳酸酯容器中。
移液管	Samco	202, 204
金属浴	QiLinbeier		Model GL-150
显微镜	Leica	M205 FA	用于显微照片
离心	Eppendorf	5417R
微型RNA提取试剂盒	Ambion	AM1931	从性腺组织中分离RNA
Dnase I	Sigma	AMPD1-1KT	在RNA溶液中进行DNA消化
RevertAid 第一链 cDNA 合成试剂盒	赛默飞世尔科技	#K1631	用于第一链 cDNA 合成
Rnase H	赛默飞世尔科技	#EN0202	用于消化cDNA溶液中的残留RNA。
SYBR Green 实时荧光定量 PCR 预混液	TOYOBO	QPK-201	该产品是一种基于Taq DNA聚合酶的2×实时PCR预混液  适用于SYBR Green I嵌合检测试验。
分光光度计	Ne滴	OD-2000+	测定总RNA的浓度
Mastercycler	Eppendorf	AG 22331 汉堡	基因表达谱分析