通过穿孔包装系统中二氧化氯的可控释放延长葡萄番茄的贮藏期并提高其安全性

摘要

本文介绍了一种新型缓释二氧化氯（ClO₂）产品的应用方案，该产品可减少腐败并延长新鲜水果的保质期。将缓释型ClO₂产品添加至标准商用葡萄番茄包装中，并针对大肠杆菌（Escherichia coli）和链格孢菌（Alternaria alternata）进行测试。

摘要

一种可控释放的二氧化氯（ClO₂）气体发生系统₂) 袋是通过将ClO的浆料形式密封而制备的₂ 进入半透性聚合物薄膜；在有无水果的容器中监测该小袋的释放特性。将小袋固定在装有葡萄番茄的带孔周转箱内侧，并在20 °C下储存14天期间评估其对微生物种群、硬度和失重的影响。3天内，ClO₂ 蛤壳中的浓度达到3.5 ppm，并在第10天前保持恒定，之后至第14天降至2 ppm。ClO₂ 袋泡显示出强效的抗菌活性，可减少 大肠杆菌 通过3.08 log CFU/g降低种群数量 Alternaria alternata 种群在储存14天后减少了2.85 log CFU/g。ClO₂ 处理还减少了番茄的软化和重量损失，延长了番茄的整体货架期。我们的结果表明，ClO₂ 处理有助于在不损害番茄品质的前提下延长其贮藏期并提高微生物安全性。

引言

富含新鲜水果和蔬菜的饮食可能有助于降低多种疾病的风险，包括冠心病和某些类型的癌症¹。然而，一些食源性微生物病原体，如Escherichia coli、Salmonella enterica和Listeria monocytogenes，与食用新鲜水果和蔬菜相关，可能导致消费者因摄入受污染的农产品而患病甚至死亡²。例如，E. coli O157:H7的暴发曾与葡萄、番茄和草莓有关^3,4，甲型肝炎的暴发则与新鲜蓝莓有关⁵。此外，微生物污染还可能通过采后腐烂造成大量产品损失⁶。Alternaria alternata是一种重要的植物致病真菌，已知可在超过380种植物宿主中引起叶斑病及其他病害⁷。研究表明，该真菌可导致番茄发生Alternaria黑斑病⁸、茎溃疡病以及叶枯病⁹。因此，需要一种安全有效的采后去污染处理方法，以同时控制食源性病原体并防止新鲜农产品的采后腐烂。

低残留和无残留技术是替代性消毒剂的新趋势。多种采后杀菌剂已被用于减少腐败微生物并预防食源性疾病。臭氧作为一种强效抗菌剂，已被证明可保持草莓和蓝莓的品质与新鲜度^10,11。然而，臭氧可能导致果实表层组织氧化，从而引起变色以及风味品质下降¹²。氯已被用于新鲜农产品（如蓝莓和苹果）的消毒¹³。尽管氯具有良好的杀菌效果，但它可能与含氮化合物或氨发生反应，产生致癌副产物¹⁴，尤其是在用于新鲜水果消毒时尤为明显¹⁵。

二氧化氯（ClO₂）是一种替代性消毒剂，已获中国和美国批准用于果蔬采后处理¹⁶。ClO₂ 是一种水溶性氧化剂，其氧化能力是游离氯的 2.5 倍¹⁷。ClO₂ 在低浓度和短接触时间下即具有高效性¹⁸。在用于消毒的浓度下，ClO₂ 毒性低、腐蚀性小，被公认为是在多种环境中使用最有效的杀菌和杀真菌剂之一^19,20,21。

大量研究结果表明，ClO₂ 能够控制食源性病原体和采后腐烂¹⁶。例如，ClO₂气体已被用于灭活L. monocytogenes、Salmonella和E. coli O157:H7，并防止蓝莓和草莓腐败^22,23。ClO₂气体在降低微生物污染风险的同时，还能保持新鲜水果的品质，并在控制草莓采后腐烂方面表现出有效性²⁴。然而，该气体在高浓度下不稳定，且难以运输，传统上需要在现场使用昂贵的发生器或效率较低的双组分粉末混合方式。

然而，一种新型二氧化氯（ClO₂）产品已显示出在控制食品腐败微生物和病原体方面具有显著效果，该产品采用即用型、可控释放的剂型（即无需使用发生器或预先混合原料），在初步实验中表现优异²⁵。这种ClO₂形式安全、成本低、无腐蚀性、易于运输，并可实现可控释放，且对环境无不良影响。先前的研究表明，将这种缓释型ClO₂粉末包裹在过滤材料中并置于蛤壳式包装内，可显著减少新鲜蓝莓和草莓的腐烂，降低果实失水，并在采后贮藏期间维持果实硬度^25,26。最近，一种可控释放的ClO₂小包已被开发出来，其通过将ClO₂浆料密封于半透性聚合物薄膜中制成。本研究的目的包括：1）监测ClO₂气体在密闭容器和打孔蛤壳包装中的释放特性；2）研究在容器中使用可控释放ClO₂小包对葡萄番茄上食源性病原菌及果实腐烂的影响；3）评估可控释放ClO₂对葡萄番茄贮藏品质的影响。

方案

1. 密闭腔室顶空中气态ClO₂ 的测量

1. 准备材料：ClO₂ 释放袋（含 0.5 g ClO₂ 悬浊液（有效成分 9.5%），封装于特定聚合物薄膜中以控制释放速率（总表面积为 6 cm²）；具体成分属商业机密）、玻璃密闭舱（19.14 L）以及带可开关气体进出口的盖子。
2. 使用双面胶将 ClO₂ 释放袋固定在盖子上。
3. 用凡士林密封盖子，关闭密闭舱。
4. 将 ClO₂ 气体检测仪的进气口和出气口连接至密闭舱。
   注意：该系统为气体循环系统，测量过程中无气体损失。
5. 开启进气和出气气流，分别在孵育 0、1、2、3、4、24、26、28 和 48 小时后测定密闭舱内的 ClO₂ 浓度。
6. 使用温湿度数据记录仪监测密闭舱内的温度和相对湿度（RH）。

2. 果实准备与贮藏

1. 从当地零售商处获取 15 kg 新鲜的葡萄番茄（Solanum lycopersicum var. cerasiforme），确保果实健康且无可见缺陷。
2. 接种液的制备
   1. 使用来自柑橘果实表面的 E. coli（野生型）和 A. alternata 菌株进行接种²⁷。
   2. 将 E. coli 接种于 E. coli 琼脂（ECA）培养基中，在 35 °C 下培养 1 天²⁷，然后将菌体转接到新的平板上继续培养 1 天。用接种环取 ECA 平板上的菌落，在 Levine 伊红美蓝（EMB）琼脂平板上划线，于 35 °C 培养 24 小时以确认菌种；呈现反光性金属绿色的菌落为 E. coli 阳性。
   3. 将 A. alternata 接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中，在 25 °C 下培养至孢子出现。
   4. 将 E. coli 菌体从琼脂平板上刮下，悬浮于 50 mL 无菌蒸馏水中，通过与 McFarland 浊度标准比对，使菌液浓度达到约 9 log CFU/mL。随后加入含 0.1% Tween-20 的 1,950 mL 无菌水，最终配制成总量为 2 L 的接种液。
   5. 通过在 EC 琼脂平板上进行稀释涂布法验证细胞浓度。将 A. alternata 的孢子从培养基上刮下，悬浮于含 0.1% Tween-20 的 2 L 无菌蒸馏水中。
      注：最终 E. coli 的接种量为 7.5 log CFU/g，A. alternata 的接种量为 5.5 log CFU/g。
3. 将 7 kg 番茄放入一个 10 L 的不锈钢盘中，并用可高压灭菌袋完全覆盖。将袋和盘置于生物安全柜中。使用喷雾瓶从上方将接种液（2 L）均匀喷洒到果实表面，同时用手套轻轻搅拌果实以确保覆盖均匀。
   1. 5 分钟后，将番茄单层放置于灭菌过的垫纸上，静置风干 2 小时。将约 200 g 果实分别装入 24 个 1 磅（约 1.14 L）带孔托盒中。
4. 小心折叠受污染的铝箔，放入不锈钢盘中。脱下手套并放入盘中。将可高压灭菌袋包裹后，对所有受污染物品在 121 °C 下高压灭菌 25 分钟。
5. 将 ClO₂ 缓释袋固定在 12 个托盒的盖子内侧，其余 12 个托盒作为对照组。称量每个完整的托盒重量。将果实于 20 °C 下贮存 14 天。
6. 在第 3、7、10 和 14 天取样。每天每处理组取 3 个托盒作为 3 个重复样本。

3. 蛤壳中ClO₂浓度的监测

1. 将二氧化氯（ClO₂）气体检测仪的进气管和出气管插入蛤壳式培养皿的中央，两管末端相距2 cm，在第3、7、10和14天进行ClO₂浓度测定。

4. 微生物种群及果实品质特性的测定

1. 将每个重复组的5个果实（约60 g）与99 mL无菌磷酸钾缓冲液（0.01 M，pH 7.2）一同置于无菌采样袋中，在旋转摇床上以100 rpm振荡1小时。
   1. 使用螺旋接种仪将缓冲液洗脱物进行连续稀释（1倍、10倍和100倍），每种稀释度各取50 µL，分别接种于ECA培养基（用于E. coli）和PDA培养基（用于A. alternata）。
   2. ECA平板在35 °C下培养24小时，PDA平板在25 °C下培养3天。使用光学菌落计数仪读取微生物菌落数量。使用后，对所有接触过污染果实的设备进行消毒处理。
2. 按照制造商的操作规程，使用果实硬度测试仪测定果实硬度。每次使用前校准仪器。每个重复组测定20个果实，结果以将果实压缩1 mm所需的压强（牛顿，N）表示，并换算为N·m⁻¹。
3. 在贮藏开始时及贮藏期间，称量装有果实的整个密封盒的重量，并与初始重量比较，计算失重率。

5. 统计分析

1. 所有实验均需设置三个重复。采用方差分析（ANOVA）对数据进行分析。通过邓肯氏多重极差检验（Duncan's multiple range test）确定均值间的差异显著性；显著性水平定义为 p <0.05。

结果

ClO₂的释放量在最初几小时内呈线性增长，前4小时每小时增加约2.38 ppm。24小时孵育后，释放速度减缓，ClO₂浓度达到25.4 ppm。然而，24小时孵育后浓度趋于稳定（图1）。

顶空气体中的 ClO₂ 在第3天至第10天期间，含葡萄番茄的蛤壳包装内的浓度约为4 ppm，储存10天后浓度下降，第14天时约为2 ppm（图2）。初始种群的 E. coli 和 A. alternata 在果实中 接种后分别为 4.3 和 3.4 log CFU/g（图3）。使用 ClO 处理₂ 囊袋减少了种群数量 大肠杆菌 和 A. alternata 分别减少了 3.08 和 2.85 ...

讨论

二氧化氯是一种理想的杀菌剂，可用于防止食物腐败。然而，高浓度的二氧化氯不稳定且无法运输，通常需要昂贵的现场发生装置或效率较低的双组分粉末混合方式。本研究探讨了一种稳定、即用型二氧化氯制剂在减少食物腐败和食源性疾病发生率方面的应用。与目前使用的其他二氧化氯应用技术相比，商用 ClO₂ 制剂具有更高的稳定性和使用便捷性。₂ 此处使用的试剂成本效益高、保质期长，且无需大型发生器或预先混合。然而，由于ClO₂具有强氧化性₂，ClO的气体释放特性₂ 难以测量，因此很少有相关报道。在之前的一项研究中，采用滴定法来测量释放速率²⁸然而，该方法准确性较低且操作更为复杂。一些研究评估了ClO₂的浓度₂ 通过将其溶于水，然后采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）进行检测²⁹然而，这种GC-MS仪器结构复杂且价格昂贵³⁰. 在我们的研究中，一种 ClO₂ 使用气体检测仪测量 ClO 的浓度₂

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Curoxin® 二氧化氯袋	Worrell Water Technologies		浆状物，有效成分含量 9.5%，密封于半透性聚合物薄膜中
葡萄番茄	Santa Sweets, Inc		Santa Sweets Authentic
ClO2 气体检测仪	Analytical Technology, Inc., Collegeville, PA		PortaSens II
带孔蛤壳式包装盒	Packaging Plus LLC, Yakima, WA		OSU #1，1 磅
Escherichia coli			来自果实表面的野生型（WT）
Alternaria alternata			来自果实表面
E. coli 琼脂	EC 肉汤，Oxoid，英国		含 1.5% 琼脂的 EC 肉汤
马铃薯葡萄糖琼脂	BD Difco，Sparks，MD
莱文氏伊红美蓝琼脂	BD Difco，Sparks，MD
触发式喷雾瓶	Impact Products, LLC.，Toledo，OH
灭菌采样袋	Fisherbrand，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA
轨道摇床	New Brunswick Scientific，New Brunswick，NJ		Innova 2100
IUL Instruments Neutec Eddy jet 螺旋接种仪	Neutec Group Inc.，Farmingdale，NY
EZ 微型光学平板读数仪	Synoptics, Ltd.，Cambridge，英国		ProtoCOL
果实硬度测试仪	Bioworks Inc，Wamego，KS		FirmTech 2
Tinytag 温度和相对湿度数据记录仪	Gemini Data Loggers，West Sussex，英国
McFarland 浊度标准液	Fisherbrand，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA