本文描述了一种制备小鼠颈动脉和主动脉内皮面标本的方法。此类标本经特异性抗体免疫荧光染色后，可通过共聚焦显微镜观察整个血管壁内蛋白质的定位以及细胞类型的鉴定。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
石蜡包埋组织切片通常用于研究组织的组织学和组织病理学。然而，从这些切片中难以确定组织的三维形态结构。此外，所检测的组织切片可能并不包含研究目的所需的关键区域。这一局限性尤其阻碍了对血管的组织病理学研究，因为血管病变往往呈局灶性发展。因此，需要一种能够从血管壁表面至深层区域对血管壁进行大范围观察的方法。血管的全层平展（en face）制备技术恰好满足这一需求。在本文中，我们将演示如何制备小鼠主动脉和颈动脉的en face标本，并对其进行免疫荧光染色，以用于共聚焦显微镜及其他基于荧光的成像技术。
引言
在利用光学显微镜进行组织病理学研究时，通常需要将三维的生物组织样本进行石蜡包埋，随后切片和染色。经过石蜡包埋的组织样本在三个维度上可能达到数毫米大小。然而，为了实现光学显微镜观察，必须首先将组织切成薄片，使光线能够穿透，再通过染色增强薄片的对比度，以便成像。由于切片样本的厚度通常仅为5–10 µm，每次在二维平面上仅能观察到整个样本极小的一部分。虽然可以通过连续收集切片，对每张切片单独成像后借助计算机进行三维图像的重建，但这一过程极为繁琐。血管组织病理学研究，尤其是动脉粥样硬化发病机制的研究，面临独特的挑战。动脉粥样硬化是一种局灶性疾病，通常在血流紊乱的局部区域发生。此外，该疾病起始于大动脉的内膜层，内膜是一层由单层内皮细胞及其细胞外基质构成的薄层组织。由于上述原因，利用切片血管来定位和研究早期病变极具挑战性，因为很容易在切片过程中错过病灶。即使某一切片包含了病变区域，观察到的也仅是厚度为5–10 µm的横断面，其中包含内皮细胞以及中膜和外膜中的其他血管壁细胞。
整体封片（en face，发音为än ˈfäs）制备技术使我们能够观察血管表面的大范围区域，例如从主动脉根部一直延伸至髂总动脉的整段主动脉。利用经特异性抗体及其他特异性探针染色的此类标本，可精确定位病变的位置，以及在动脉粥样硬化发生过程中内皮细胞内各种分子事件的发生位置，例如蛋白质表达水平、定位及翻译后修饰的变化。除了研究动脉粥样硬化的发生外，en face 制备标本中观察到的内皮细胞形态还可作为反映局部时间平均血流....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
小鼠颈动脉部分结扎以及主动脉和颈动脉的分离以进行内皮面免疫染色的实验方案已获得机构动物护理和使用委员会批准（IBT 2014-9231）。
1. 左侧颈总动脉部分结扎
- 通过在桌面上放置一个 12 英寸 × 14 英寸的加热垫，并用一张大的无菌手术单覆盖加热垫和桌面，准备手术区域。调整吊臂支架的臂部，使体视显微镜的视野位于加热垫的中心区域。
- 打开桌面上的加热垫，将三档控温旋钮调至中等加热档位。在此温度设置下，手术板表面（见 1.6.1）温度将维持在 38–40 °C。
- 将一个洁净的笼子放在另一个加热垫上，按上述方法打开加热垫。该笼子将用于术后恢复（见 1.16）以及日常饲养。
- 在手术台上放置一个已高压灭菌的灭菌袋，内含虹膜剪（1 对）、组织镊（1 对）、防滑镊（2 对）、弹簧剪（1 对）、钝性牵开器（1 对；宽 2.5 mm）、圆柄持针器（1 个）、灭菌的 6-0 丝线缝合线、棉签、迷你棉签、手术单，以及 2" × 2" 纱布块。同时在手术台上放置一个装有 70% 乙醇的挤压瓶和另一个装有氯己定外科洗手液的挤压瓶。
- 称量小鼠体重。根据体重确定术前应给予的镇痛药剂量，该药物将在手术开始前立即给予。
- 将小鼠放入诱导室中。
- 打开氧气瓶和麻醉蒸发器....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
典型的内皮细胞正面免疫荧光图像如图所示 图3该图像显示了小鼠主动脉在肋间动脉开口附近的一个单层光学切片（较大的深色卵圆形区域）。主动脉经双重染色处理，使用了抗VE-钙黏蛋白抗体（绿色）和抗VCAM-1（血管细胞黏附分子-1）抗体（红色）。每条内皮细胞的黏附连接处均可见绿色线性染色轮廓。由于样本存在轻微不平整，部分黏附连接位于该光学切片之外。在肋间动脉开口处，抗VCAM-1染色信号更强，该区域已知存在紊乱的血流。图4展示了颈动脉的正面染色结果，使用抗VE-钙黏蛋白抗体（绿色）、抗VCAM-1抗体（红色）和DAPI（紫色）。左侧颈动脉（LCA）进行了部分结扎，而右侧颈动脉（RCA）未作处理。血管样本在手术后1天制备并进行染色。注意结扎侧血管中抗VCAM-1染色增强。经不同抗体免疫荧光染色的样本可用于研究目的蛋白的表达水平、靶蛋白翻译后修饰的程度，以及各种蛋白在内皮细胞内及血管壁其他细胞中的定位模式。10,11.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在处理小鼠血管时，需要注意血管内皮非常脆弱，任何过度的机械力都会损伤内皮细胞。例如，若灌注力度过大，内皮细胞会破裂或从血管壁上脱落，而使用手动注射器进行血管灌注时很容易发生这种情况。
为了获得恒定的灌注压力，我们使用重力灌注系统，其水柱高度为120 cm，产生相应的压力。据报道，小鼠的平均动脉压因品系不同而异，范围在130至170 cm H2O之间14。因此，我们所采用的灌注压力略低于测得的动脉压。在对大鼠主动脉进行灌注固定时，使用了90 cm H2O的水柱压力6。
在血管收获、清洗、纵向剖开、免疫染色和封片过程中，如果血管被拉伸，原位内皮细胞也会受到损伤。事实上，机械性损伤是内皮细胞在铺片标本制备过程中丢失的常见原因之一。血管拉伸可能在操作的任何步骤中发生，但最常见于血管收获时。此外，在清除附着于外膜的脂肪组织时也容易导致血管拉伸。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
作者的研究工作得到了美国国立卫生研究院向Abe博士提供的资助（HL-130193、HL-123346、HL-118462、HL-108551）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 氯化钠注射液 USP 500 mL 袋装 | Fisher Scientific | NC9788429 | |
| 12 孔板 | Fisher Scientific | 12556005 | |
| 6-0 涂层薇乔缝线 | Ethicon | J833G | |
| AF488 山羊抗大鼠 IgG | Life Technologies | A11006 | |
| AF546 山羊抗兔 IgG | Life Technologies | A11035 | |
| 抗 CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 | |
| 抗 VCAM-1 (H-276) 兔多克隆 IgG | Santa Cruz Biotechnology | Sc-8304 | |
| Aoto 流体系统 | Braintree Scientific | EZ-AF9000 | |
| 灭菌包裹布，24 英寸 × 24 英寸 | Cardinal Health | 4024 | |
| 钝头牵开器，宽 2.5 mm | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| 卡洛芬 (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 | |
| 氯己定擦洗液，2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC | |
| Curity 纱布敷料 2 × 2 | Cardinal Health | KC2146 | |
| 电热垫，12 × 14 | Fisher Scientific | NC0667724 | |
| 超细 Graefe 镊子 | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| 虹膜剪刀 | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| 显微盖玻片 22 mm × 50 mm | VWR | 48393059 | |
| 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| 正常山羊血清 | Equitech-Bio | GS05 | |
| 4% 多聚甲醛 PBS 溶液 | Santa Cruz Biotechnology | SC-281692 | |
| 培养皿 100 mm × 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Life Technologies | P-36935 | |
| Puritan 棉签 | VWR | 10806-005 | |
| Puritan 迷你棉签 | VWR | 82004-050 | |
| 圆柄持针器 | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| 丝线 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| 弹簧剪刀 | ROBOZ | RS-5601 | |
| 斜视剪刀 | Fine Science Tools | 14075-09 | |
| 防滑镊子 | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| 透明敷料 | Cardinal Health | TD-26C | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC327371000 |
参考文献
- Jelev, L., Surchev, L. A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations. J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).
- Neill, J. F. The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis. Ann Surg....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
