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方法文章

En Face 小鼠血管制备

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DOI：

10.3791/55460

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2017年5月19日

 ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Division of Internal Medicine, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Radiation Oncology, University of Texas MD Anderson Cancer Center

本文内容

摘要

本文描述了一种制备小鼠颈动脉和主动脉内皮面标本的方法。此类标本经特异性抗体免疫荧光染色后，可通过共聚焦显微镜观察整个血管壁内蛋白质的定位以及细胞类型的鉴定。

摘要

石蜡包埋组织切片通常用于研究组织的组织学和组织病理学。然而，从这些切片中难以确定组织的三维形态结构。此外，所检测的组织切片可能并不包含研究目的所需的关键区域。这一局限性尤其阻碍了对血管的组织病理学研究，因为血管病变往往呈局灶性发展。因此，需要一种能够从血管壁表面至深层区域对血管壁进行大范围观察的方法。血管的全层平展（en face）制备技术恰好满足这一需求。在本文中，我们将演示如何制备小鼠主动脉和颈动脉的en face标本，并对其进行免疫荧光染色，以用于共聚焦显微镜及其他基于荧光的成像技术。

引言

在利用光学显微镜进行组织病理学研究时，通常需要将三维的生物组织样本进行石蜡包埋，随后切片和染色。经过石蜡包埋的组织样本在三个维度上可能达到数毫米大小。然而，为了实现光学显微镜观察，必须首先将组织切成薄片，使光线能够穿透，再通过染色增强薄片的对比度，以便成像。由于切片样本的厚度通常仅为5–10 µm，每次在二维平面上仅能观察到整个样本极小的一部分。虽然可以通过连续收集切片，对每张切片单独成像后借助计算机进行三维图像的重建，但这一过程极为繁琐。血管组织病理学研究，尤其是动脉粥样硬化发病机制的研究，面临独特的挑战。动脉粥样硬化是一种局灶性疾病，通常在血流紊乱的局部区域发生。此外，该疾病起始于大动脉的内膜层，内膜是一层由单层内皮细胞及其细胞外基质构成的薄层组织。由于上述原因，利用切片血管来定位和研究早期病变极具挑战性，因为很容易在切片过程中错过病灶。即使某一切片包含了病变区域，观察到的也仅是厚度为5–10 µm的横断面，其中包含内皮细胞以及中膜和外膜中的其他血管壁细胞。

整体封片（en face，发音为än ˈfäs）制备技术使我们能够观察血管表面的大范围区域，例如从主动脉根部一直延伸至髂总动脉的整段主动脉。利用经特异性抗体及其他特异性探针染色的此类标本，可精确定位病变的位置，以及在动脉粥样硬化发生过程中内皮细胞内各种分子事件的发生位置，例如蛋白质表达水平、定位及翻译后修饰的变化。除了研究动脉粥样硬化的发生外，en face 制备标本中观察到的内皮细胞形态还可作为反映局部时间平均血流模式的指标。这类数据对于研究内皮细胞在原位的机械信号转导具有重要意义。而常规的组织学横切标本在此类研究中并不适用。因此，在血管医学与生物学领域，掌握一种能够制备血管 en face 标本的技术尤为重要，该技术需能够观察血管表面的大范围区域，同时也能观察血管更深层的亚表面结构。

正如Jelev和Surchev1所综述的，血管生物学家已开发出多种方法用于观察血管内壁的铺片结构。一些巧妙的方法早在20世纪40年代和50年代就已建立。利用这些方法，研究人员能够研究衬于血管内表面的内皮细胞的基本组织结构。然而，由于这些铺片样本的制备方式（即所谓的Hautchen法2,3,4，或剥离血管表面的方法5）以及染色方法的限制，通常难以从血管表面连续获取至血管壁深层区域的完整形态学信息。将整体铺片（whole mount）血管样本与免疫荧光染色技术相结合，使我们不仅能够研究内皮细胞的形态以及这些细胞中蛋白质的表达与定位，还能将此类研究拓展至血管壁的内皮下区域。使用免疫荧光染色的血管铺片样本进行研究的早期工作始于20世纪80年代6,7。随着激光扫描共聚焦显微镜以及近年来多光子显微镜的出现，现在已能够清晰地获取免疫荧光染色的铺片血管样本中血管壁结构的在焦图像，以及活体动物中血管网络的图像8,9,10,11。这些基于计算机的成像技术可生成在焦的光学切片图像，通过叠加这些图像，可以获得组织中血管壁及血管网络的重建三维图像。此外，还可以生成沿重建图像Z轴方向切面的图像12,13。

本文将介绍一种制备小鼠主动脉和颈动脉内皮面（en face）标本用于免疫荧光染色的方法。即使这些血管经过实验性操作后，仍可制备内皮面标本。例如，颈动脉可先进行部分结扎，术后仍可制备内皮面标本。因此，本文还将详细描述我们进行颈动脉部分结扎的操作方法。与大鼠、兔或人等较大动物的血管标本制备相比，小鼠血管体积较小且更为脆弱，因此在手术分离及后续抗体染色和显微镜观察过程中需格外小心。由于小鼠是目前最常用的基因修饰动物模型，对许多研究人员而言，能够在不损伤血管的前提下妥善处理小鼠血管显得尤为关键。本论文将详细介绍在制备小鼠主动脉和颈动脉内皮面标本时如何操作小鼠血管。为便于演示，我们将使用野生型 C57/b6 小鼠。

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方案

小鼠颈动脉部分结扎以及主动脉和颈动脉的分离以进行内皮面免疫染色的实验方案已获得机构动物护理和使用委员会批准（IBT 2014-9231）。

1. 左侧颈总动脉部分结扎

  1. 通过在桌面上放置一个 12 英寸 × 14 英寸的加热垫，并用一张大的无菌手术单覆盖加热垫和桌面，准备手术区域。调整吊臂支架的臂部，使体视显微镜的视野位于加热垫的中心区域。
  2. 打开桌面上的加热垫，将三档控温旋钮调至中等加热档位。在此温度设置下，手术板表面（见 1.6.1）温度将维持在 38–40 °C。
    1. 将一个洁净的笼子放在另一个加热垫上，按上述方法打开加热垫。该笼子将用于术后恢复（见 1.16）以及日常饲养。
  3. 在手术台上放置一个已高压灭菌的灭菌袋，内含虹膜剪（1 对）、组织镊（1 对）、防滑镊（2 对）、弹簧剪（1 对）、钝性牵开器（1 对；宽 2.5 mm）、圆柄持针器（1 个）、灭菌的 6-0 丝线缝合线、棉签、迷你棉签、手术单，以及 2" × 2" 纱布块。同时在手术台上放置一个装有 70% 乙醇的挤压瓶和另一个装有氯己定外科洗手液的挤压瓶。
  4. 称量小鼠体重。根据体重确定术前应给予的镇痛药剂量，该药物将在手术开始前立即给予。
  5. 将小鼠放入诱导室中。
  6. 打开氧气瓶和麻醉蒸发器，以对诱导室中的小鼠进行麻醉。维持异氟烷浓度为 2%。小鼠通常在 3–5 分钟内停止活动。
    1. 在小鼠麻醉过程中，将一块较小的无菌手术单（24 英寸 × 24 英寸）置于体视显微镜下方，以形成无菌手术面。然后将一块已用 70% 酒精清洁过的丙烯酸手术板放置在铺好的手术单上。因此，手术板应位于加热垫上，但被两层手术单隔开。
  7. 当小鼠在诱导室中停止活动后，将其转移至术前准备区，并将其鼻部置于连接麻醉蒸发器（2% 异氟烷）的鼻罩中。使用电动剃毛器或脱毛膏去除颈部区域的毛发。推荐使用脱毛膏，因为该方法不会产生松散的毛发碎片，而这些碎片很难从手术区域彻底清除。
  8. 保持鼻罩位置不变，将小鼠移至手术板上。
    1. 用胶带将小鼠的左右前肢固定在手术板上。将两只后肢一起用胶带固定在小鼠右侧。这会使小鼠身体轻微旋转，从而使小鼠颈部左侧更有利于手术操作。
  9. 用 70% 酒精、氯己定外科洗手液，再用 70% 酒精依次消毒切口区域。除颈部切口区域外，其余部位用灭菌手术单覆盖。
  10. 通过夹捏脚趾确认小鼠已完全麻醉，并通过腹腔或皮下注射给予镇痛药（卡洛芬 3–5 mg/kg）via。
  11. 在解剖显微镜下，使用手术刀或虹膜剪在颈部区域做一条腹侧正中切口。
    注：我们通常使用剪刀，因为体视显微镜的工作距离有限，使用手术刀较为困难。
  12. 将覆盖在血管上的唾液腺向动物左侧推开并重新定位，以暴露左侧颈总动脉（LCCA）。
  13. 识别手术视野内的所有血管（图 1）。左侧颈总动脉（LCCA）分为左侧颈内动脉（ICA）和左侧颈外动脉（ECA）。甲状腺浅动脉（STA）起源于 ECA 的内侧。枕动脉（OA）通常起源于 ECA，但在某些小鼠中可能起源于 ICA。
  14. 使用灭菌的 6-0 丝线结扎除 OA 外的所有动脉分支。为此，完成以下两个结扎步骤。
    1. 轻轻去除左侧颈内动脉（ICA）周围及下方的结缔组织。用镊子夹取一段预先剪好的 6-0 丝线（约 2.5 cm），将其从动脉下方穿过。用另一对镊子将丝线拉出约其长度的 1/3，然后结扎该动脉。
    2. 以同样方式去除左侧颈外动脉（ECA）周围的结缔组织，并在左侧甲状腺上动脉（STA）近端进行结扎（图 1）。注意避免损伤手术视野内穿行的神经纤维。
  15. 完成上述结扎后，将唾液腺复位，并滴加 2–3 滴无菌生理盐水以保持手术区域湿润。使用 6-0 涂层薇乔缝线缝合皮肤。
  16. 手术后，将小鼠放入预热的笼子中（见 1.2.1）。小鼠通常在 5 分钟内苏醒并开始活动。确认小鼠行为正常后，将其笼子转移至动物饲养室。
  17. 术后前 3 天每日观察小鼠。根据实验方案要求，可在不同条件下长期饲养小鼠。手术后任意时间均可制备血管内皮铺片（en face preparations）。

2. En Face 免疫染色

  1. 通过吸入过量 CO2 对小鼠实施安乐死。
  2. 将小鼠仰卧位（腹部朝上）固定在解剖板上。
  3. 使用虹膜剪沿腹中线做切口，暴露腹腔。
  4. 沿胸骨两侧剪断肋骨，暴露胸腔。
  5. 在下腔静脉或一侧股动脉上做小切口以排出血液。
  6. 将连接于重力灌注装置（120 cm 水压）的 26 G 针头插入左心室心尖部，用含肝素（40 U/mL）的生理盐水灌注循环系统，持续灌注至流出液体变澄清为止。
  7. 将灌注液由生理盐水更换为含 4% 多聚甲醛的 PBS（磷酸盐缓冲液）固定液，继续灌注 5 分钟。
  8. 使用钝头剪刀和镊子取下主动脉及左右颈总动脉，置于含有固定液的 50 mL 锥形管中，并置于冰上。
  9. 将血管转移至盛有 PBS 的培养皿中，在解剖显微镜下仔细去除附着在主动脉和颈总动脉上的脂肪和结缔组织。沿纵轴纵向分离并剖开主动脉和颈总动脉，以暴露内皮层（图 2）。
  10. 将每根血管分别转移至 12 孔板中的一个孔，每孔加入 0.5 mL 通透液（含 0.1% Triton X-100 的 PBS），在室温下轻轻振荡孵育 10 分钟进行通透处理。
  11. 用 PBS 短暂洗涤一次。
  12. 为阻断非特异性抗体结合位点，将血管置于 TTBS（含 2.5% Tween 20 的 Tris 缓冲盐水）中，加入来源于制备二抗的同种动物的 10% 正常血清，在室温下振荡孵育 30 分钟。
  13. 将血管与适当稀释于含 10% 正常血清的 TTBS 中的一抗（稀释方法如上所述）在 4 °C 下振荡孵育过夜。每种一抗的稀释比例需预先优化确定。
  14. 进行以下对照染色操作。
    1. 用 TTBS 代替一抗孵育血管，随后加入二抗孵育。
    2. 用含有非免疫性（或免疫前）血清或与一抗来源动物（物种）相同的 Ig 的 TTBS 孵育血管，随后加入二抗孵育。
    3. 省略二抗孵育步骤。这些对照样本必须与特异性抗体染色样本同时以相同方式处理。
  15. 用 TTBS 在室温下振荡洗涤血管 3 次，每次 10 分钟。
  16. 加入适当稀释于含 10% 正常血清的 TTBS 中的荧光标记二抗，在室温下振荡孵育 1 小时。此步骤可同时加入 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）进行核染色，方法为加入终体积比 1/5,000 的 DAPI 储存液（含 5 mg/mL DAPI 的 H2O 溶液）。
  17. 用 TTBS 在室温下振荡洗涤 3 次，每次 10 分钟。
  18. 用 PBS 短暂冲洗一次。
  19. 在盖玻片（22 mm × 50 mm）上滴加一滴抗荧光淬灭剂，将血管置于盖玻片上，使内皮面朝下。
  20. 将载玻片（22 mm × 75 mm）覆盖在血管上，注意避免产生气泡。
  21. 将载玻片放置于洁净的实验用纸巾（例如 Kimwipe）上，并用两张实验用纸巾覆盖其上。在其上方轻压 3.5 kg 的重物（例如 将一瓶水放在厚书上），持续最多 5 分钟，以压平“内皮面朝下”（en face）的血管样本。
  22. 移除重物，并擦去盖玻片周围的多余液体。
  23. 在盖玻片的四个角涂抹指甲油，将载玻片放入载玻片盒中，盖玻片朝上，于室温（或 4 °C）避光静置过夜。此过程可进一步压平组织，便于高倍显微镜观察。
  24. 用指甲油完全密封盖玻片边缘。
  25. 待指甲油完全干燥后立即进行显微成像。
  26. 如需长期保存，可将载玻片存于 -20 °C。

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结果

典型的内皮细胞正面免疫荧光图像如图所示 图3该图像显示了小鼠主动脉在肋间动脉开口附近的一个单层光学切片（较大的深色卵圆形区域）。主动脉经双重染色处理，使用了抗VE-钙黏蛋白抗体（绿色）和抗VCAM-1（血管细胞黏附分子-1）抗体（红色）。每条内皮细胞的黏附连接处均可见绿色线性染色轮廓。由于样本存在轻微不平整，部分黏附连接位于该光学切片之外。在肋间动脉开口处，抗VCAM-1染色信号更强，该区域已知存在紊乱的血流。图4展示了颈动脉的正面染色结果，使用抗VE-钙黏蛋白抗体（绿色）、抗VCAM-1抗体（红色）和DAPI（紫色）。左侧颈动脉（LCA）进行了部分结扎，而右侧颈动脉（RCA）未作处理。血管样本在手术后1天制备并进行染色。注意结扎侧血管中抗VCAM-1染色增强。经不同抗体免疫荧光染色的样本可用于研究目的蛋白的表达水平、靶蛋白翻译后修饰的程度，以及各种蛋白在内皮细胞内及血管壁其他细胞中的定位模式。10,11.

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讨论

在处理小鼠血管时，需要注意血管内皮非常脆弱，任何过度的机械力都会损伤内皮细胞。例如，若灌注力度过大，内皮细胞会破裂或从血管壁上脱落，而使用手动注射器进行血管灌注时很容易发生这种情况。

为了获得恒定的灌注压力，我们使用重力灌注系统，其水柱高度为120 cm，产生相应的压力。据报道，小鼠的平均动脉压因品系不同而异，范围在130至170 cm H2O之间14。因此，我们所采用的灌注压力略低于测得的动脉压。在对大鼠主动脉进行灌注固定时，使用了90 cm H2O的水柱压力6。

在血管收获、清洗、纵向剖开、免疫染色和封片过程中，如果血管被拉伸，原位内皮细胞也会受到损伤。事实上，机械性损伤是内皮细胞在铺片标本制备过程中丢失的常见原因之一。血管拉伸可能在操作的任何步骤中发生，但最常见于血管收获时。此外，在清除附着于外膜的脂肪组织时也容易导致血管拉伸。

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致谢

作者的研究工作得到了美国国立卫生研究院向Abe博士提供的资助（HL-130193、HL-123346、HL-118462、HL-108551）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 氯化钠注射液 USP 500 mL 袋装Fisher ScientificNC9788429
12 孔板Fisher Scientific12556005
6-0 涂层薇乔缝线EthiconJ833G
AF488 山羊抗大鼠 IgG Life TechnologiesA11006
AF546 山羊抗兔 IgG Life TechnologiesA11035
抗 CD144 (Ve-Cad)BD BiosciencesBD555289
抗 VCAM-1 (H-276) 兔多克隆 IgGSanta Cruz BiotechnologySc-8304
Aoto 流体系统Braintree ScientificEZ-AF9000
灭菌包裹布，24 英寸 × 24 英寸Cardinal Health4024
钝头牵开器，宽 2.5 mmFine Science Tools18200-10
卡洛芬 (Rimadyl) zoetisNADA#141-199
氯己定擦洗液，2%Med-Vet InternationalRXCHLOR2-PC
Curity 纱布敷料 2 × 2Cardinal HealthKC2146
电热垫，12 × 14Fisher ScientificNC0667724
超细 Graefe 镊子Fine Science Tools11152-10
虹膜剪刀Fine Science Tools14090-11
显微盖玻片 22 mm × 50 mmVWR48393059
显微镜载玻片Fisher Scientific12-550-18
正常山羊血清Equitech-BioGS05
4% 多聚甲醛 PBS 溶液Santa Cruz BiotechnologySC-281692
培养皿 100 mm × 15 mmFisher ScientificFB0875713
含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂Life TechnologiesP-36935
Puritan 棉签VWR10806-005
Puritan 迷你棉签VWR82004-050
圆柄持针器Fine Science Tools12076-12
丝线 6/0Fine Science Tools18020-60
弹簧剪刀ROBOZRS-5601
斜视剪刀Fine Science Tools14075-09
防滑镊子Fine Science Tools00649-11
透明敷料Cardinal HealthTD-26C
Triton X-100Fisher ScientificAC327371000

参考文献

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