本文演示了如何在双层微流控平台上培养拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗，该平台可将主根和根毛限制在单一光学平面上。该平台可用于根系精细形态的实时光学成像，也可用于其他方式的高分辨率成像。
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本文内容
摘要
摘要
根毛通过增加根系表面积，有助于植物更有效地吸收水分和养分。由于根毛体积微小，且常被其自然生长环境遮蔽，因此其形态与功能难以研究，常被排除在植物研究之外。近年来，微流控平台为高分辨率观察根系提供了可能，且在将根系转移至成像系统时不会对其造成干扰。本文介绍的微流控平台在既往“芯片上的植物”研究基础上进行了改进，采用双层结构设计，使拟南芥（Arabidopsis thaliana）主根与根毛保持在同一光学平面上。该设计可实现对根毛在细胞及细胞器水平上的定量分析，同时在施加实验处理时避免Z轴漂移。我们描述了如何在封闭且湿润的环境中储存该装置，无需使用流体泵，同时维持幼苗的已知无菌环境。在完成光学成像实验后，该装置可被拆解并用作原子力显微镜或扫描电子显微镜的基底，同时保持精细根结构的完整性。
引言
细根特征通过探索新的土壤空间并增加总根系表面积，提高植物对水分和养分的吸收能力。这些细根特征的周转在促进地下食物链方面起着重要作用。1 在大气二氧化碳浓度升高的条件下，某些植物物种的细根数量预计会增加一倍2细根通常被定义为直径小于2 mm的根，尽管新的定义主张根据细根的功能对其进行表征3与许多细根类似，根毛具有吸收和摄取功能，但其直径仅为微米级别，占据空间小得多。由于尺寸微小，根毛难以成像 原位 在田间尺度实验和模型中，它们常常被忽视，未被视为整体根系构型的重要组成部分。
来自地球 根毛研究，例如在琼脂平板上培养的幼苗所开展的研究，为科学界提供了有关细胞生长和运输的宝贵信息4,5虽然琼脂平板能够实现根系的非破坏性实时成像，但在添加营养物质、植物激素或细菌等实验处理时，难以实现较高的环境控制精度。近年来，微流控平台的出现为实现高分辨率成像并同时提供动态环境控制提供了新的解决方案。这些平台已实现在非破坏性条件下多种植物物种的生长与可视化，适用于高通量表型分析。6,7
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方案
1. 双层平台的制备
- 多层模具的制备
- 根据制造商的说明，在直径为4英寸的硅片上旋涂基于环氧树脂的负性光刻胶（约63.45%固含量，1,250 cSt），转速为2,000 rpm，持续45秒，以获得第一设计层所需的20 µm高度。
- 将涂有光刻胶的硅片在95 °C下软烘烤4分钟。让硅片冷却5分钟。在紫外光接触式对准器中，通过掩膜版对硅片进行15秒的紫外光曝光（365 nm下约150 mJ/cm2），以定义底层的几何结构。
- 曝光后将硅片在95 °C下后烘5分钟。不进行显影，将硅片重新放回旋涂机，并以3,000 rpm旋涂第二层基于环氧树脂的负性光刻胶（约76.75%固含量，80,000 cSt），以实现150–200 µm的第二层高度。
- 让硅片静置5分钟后，转移至95 °C的加热板上烘烤45分钟。烘烤完成后取出硅片，并在平坦水平面上于室温下冷却并硬化5分钟。在紫外光接触式对准器中，对准并用第二层掩膜版对硅片曝光30秒（剂量约为300 mJ/cm2）。
- 将硅片置于加热板上，在95 °C下进行15分钟的曝光后烘烤，然后在平坦水平面上冷却5分钟，再进行显影。
- 将硅片放入塑料皿中，并浸入适当的显影液中（见材料表），同时显影两层光刻胶。可轻轻摇晃器皿，使新鲜显影液不断流过硅片表面。....
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结果
此处所述的双层PDMS微流控装置具有一个 200 µm 主通道的高通道 拟南芥 根和一个 20 µm 高腔室用于限制侧向生长的根毛图1A）。该设计可用于根系直径相似的植物物种 拟南芥 并可轻松修改以适应不同体型的物种. 该设计包含一个用于植物的入口，以及8个侧向入口，可用于施加任何所需的化学或生物处理。通过在装置中预先填充培养基，并在装置周围倒入琼脂，可在整个实验过程中保持根部环境的湿润，无需使用外部流体设备。图1B琼脂还能在培养皿中稳定装置，使幼苗垂直生长，以促进根系沿主通道向下生长。培养皿可将幼苗限制在已知的无菌环境中，并允许通过培养皿直接观察根系，最高可实现20倍的放大成像。另一种选择是将PDMS装置直接密封在玻璃底培养皿上，以实现更高的光学放大倍数。
Arabido.......
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讨论
本文所述构建植物芯片平台的方法具有独特性，其双层设计可将根毛限制在单一成像平面内，且该平台可拆解后用作高分辨率非光学成像的基底。采用高分辨率非光学成像技术可提供仅靠光学成像无法获得的植物组织信息。例如，原子力显微镜（AFM）成像可提供力的测量数据，用于计算根组织在发育过程中或特定化学或生物处理后的弹性；类似地，扫描电子显微镜（SEM）成像可提供根组织表面形貌的高分辨率细节，若结合化学成像技术，还可获得组织的元素组成信息19。该微流控平台的后续迭代将优化其与其他化学成像系统的兼容性，例如基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-MS）和相干反斯托克斯拉曼散射光谱（CARS）。
该方法的关键步骤包括使用琼脂固定装置，并为植物提供水分，而无需复杂的流体流动操作。在将PDMS装置从玻璃基底上拆解时，也必须小心操作，以保持根系形态的完整性。如果实验目的仅为低至中等分辨率的光学成像，且无需拆解装置，则可通过氧等离子体处理将装置与下方玻璃基底进行化学键合，从而简化操作流程。通过将PDMS直接化学键合至玻璃底培养皿上，然后如前所述在PDMS周围倒入琼脂.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本手稿由 UT-Battelle, LLC 根据与美国能源部签订的第 DE-AC05-00OR22725 号合同撰写。美国政府保留本手稿的版权，出版方在同意发表该文章的同时，承认美国政府保有在全球范围内非独占、已付费、不可撤销的许可，可用于发表或复制本手稿的已发表形式，或允许他人出于美国政府目的进行此类操作。能源部将根据《美国能源部公共获取计划》（http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan），提供对这些联邦资助研究成果的公众访问权限。
本工作部分由美国能源部科学办公室生物与环境研究项目下的基因组科学计划资助，属于植物-微生物互作科学重点研究领域（http://pmi.ornl.gov）。微流控平台的制备在纳米相材料科学中心的纳米制造研究实验室完成，该实验室为美国能源部科学办公室用户设施。JAA 获美国国家科学基金会研究生研究奖学金 DGE -1452154 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 硅片 | WRS Materials | 直径100mm，厚度500-550µm，优等品，电阻率10-20，N型掺磷<100> | |
| 接触式光刻对准仪 | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 掩模对准仪 | |
| 荧光显微镜 | Nikon | Eclipse Ti-U | |
| 实验室擦拭纸 | Kimberly Clark | Kimwipe KIMTECH SCIENCE 品牌，34155 | |
| 负性光刻胶环氧树脂 | Microchem | SU-8 2000s 系列 | |
| 光刻胶显影液 | Microchem | Su-8 显影液 | |
| 三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷 | Sigma Aldrich | 需在通风橱中使用 | |
| 空气等离子清洗机 | Harrick Plasma | ||
| 聚二甲基硅氧烷（PDMS） | Dow Corning | Sylgard 184 硅橡胶基础剂 | |
| PDMS 固化剂 | Dow Corning | Sylgard 184 硅橡胶固化剂 | |
| 干燥器 | Bel-Art | F42010-000 | |
| 手术刀 | X-acto 刀 | ||
| 活检打孔器 | Ted Pella | 15110-15 | |
| 胶带 | Staples | 透明胶带 | |
| 微量离心管 | Eppendorf | ||
| 吐温 X-100（Triton X） | J.T.Baker XI98-07 | ||
| 漂白剂 | Chlorox | 浓缩型 | |
| 植物培养基 | Phyto Technology Laboratories | M524 | |
| 琼脂 | Teknova | A7777 | |
| 封口膜 | Parafilm | ||
| 显微镜 | Olympus | IX51 | |
| 原子力显微镜 | Keysight Technologies | 5500 PicoPlus AFM | |
| 培养皿 | VWR | ||
| 扫描电子显微镜 | JEOL | 7400 | |
| 双枪电子束蒸发仪 | Thermionics | 定制双电子枪蒸发系统 |
参考文献
- Pritchard, S. G. Soil organisms and global climate change. Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).
- Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O'Neill, E. G. Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enric....
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