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方法文章

成像根毛形态 拟南芥 双层微流控平台中的幼苗培养

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DOI：

10.3791/55971

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2017年8月15日

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1Bredesen Center for Interdisciplinary Research and Graduate Education, University of Tennessee, 2Bioscience Division and Center for Nanophase Materials Sciences, Oak Ridge national Laboratory, 3Department of Biochemistry and Cellular and Molecular Biology, University of Tennessee, 4Department of Microbiology, University of Tennessee

本文内容

摘要

本文演示了如何在双层微流控平台上培养拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗，该平台可将主根和根毛限制在单一光学平面上。该平台可用于根系精细形态的实时光学成像，也可用于其他方式的高分辨率成像。

摘要

根毛通过增加根系表面积，有助于植物更有效地吸收水分和养分。由于根毛体积微小，且常被其自然生长环境遮蔽，因此其形态与功能难以研究，常被排除在植物研究之外。近年来，微流控平台为高分辨率观察根系提供了可能，且在将根系转移至成像系统时不会对其造成干扰。本文介绍的微流控平台在既往“芯片上的植物”研究基础上进行了改进，采用双层结构设计，使拟南芥（Arabidopsis thaliana）主根与根毛保持在同一光学平面上。该设计可实现对根毛在细胞及细胞器水平上的定量分析，同时在施加实验处理时避免Z轴漂移。我们描述了如何在封闭且湿润的环境中储存该装置，无需使用流体泵，同时维持幼苗的已知无菌环境。在完成光学成像实验后，该装置可被拆解并用作原子力显微镜或扫描电子显微镜的基底，同时保持精细根结构的完整性。

引言

细根特征通过探索新的土壤空间并增加总根系表面积，提高植物对水分和养分的吸收能力。这些细根特征的周转在促进地下食物链方面起着重要作用。1 在大气二氧化碳浓度升高的条件下，某些植物物种的细根数量预计会增加一倍2细根通常被定义为直径小于2 mm的根，尽管新的定义主张根据细根的功能对其进行表征3与许多细根类似，根毛具有吸收和摄取功能，但其直径仅为微米级别，占据空间小得多。由于尺寸微小，根毛难以成像 原位 在田间尺度实验和模型中，它们常常被忽视，未被视为整体根系构型的重要组成部分。

来自地球 根毛研究，例如在琼脂平板上培养的幼苗所开展的研究，为科学界提供了有关细胞生长和运输的宝贵信息4,5虽然琼脂平板能够实现根系的非破坏性实时成像，但在添加营养物质、植物激素或细菌等实验处理时，难以实现较高的环境控制精度。近年来，微流控平台的出现为实现高分辨率成像并同时提供动态环境控制提供了新的解决方案。这些平台已实现在非破坏性条件下多种植物物种的生长与可视化，适用于高通量表型分析。6,7,8,9，分离的化学处理10，力测量11,12，以及微生物的添加13微流控平台的设计主要采用单个开放空间的流体层，使根系能够在其中生长，但在此过程中或处理期间，根毛可能会在生长过程中移入或移出光学焦平面。

本文介绍了一种利用光刻和软光刻技术构建双层微流控平台的方法，该方法在先前“芯片上的植物”设计的基础上进行了改进，通过将幼苗的根毛限制在与主根相同的成像平面内，实现了对根毛发育过程的实时、高分辨率连续观察，并贯穿整个实验处理过程。我们的培养方法允许拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗直接在该平台上由种子萌发，并在无需使用注射泵设备的湿润无菌环境中培养长达一周。在完成延时成像实验后，可打开本平台而不扰动细微根部结构的位置，从而便于后续使用其他高分辨率成像技术。本文展示了利用光学显微镜、扫描电子显微镜（SEM）和原子力显微镜（AFM）对该平台中根毛形态进行定量分析与可视化表征的代表性结果。

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方案

1. 双层平台的制备

  1. 多层模具的制备
    1. 根据制造商的说明，在直径为4英寸的硅片上旋涂基于环氧树脂的负性光刻胶（约63.45%固含量，1,250 cSt），转速为2,000 rpm，持续45秒，以获得第一设计层所需的20 µm高度。
    2. 将涂有光刻胶的硅片在95 °C下软烘烤4分钟。让硅片冷却5分钟。在紫外光接触式对准器中，通过掩膜版对硅片进行15秒的紫外光曝光（365 nm下约150 mJ/cm2），以定义底层的几何结构。
    3. 曝光后将硅片在95 °C下后烘5分钟。不进行显影，将硅片重新放回旋涂机，并以3,000 rpm旋涂第二层基于环氧树脂的负性光刻胶（约76.75%固含量，80,000 cSt），以实现150–200 µm的第二层高度。
    4. 让硅片静置5分钟后，转移至95 °C的加热板上烘烤45分钟。烘烤完成后取出硅片，并在平坦水平面上于室温下冷却并硬化5分钟。在紫外光接触式对准器中，对准并用第二层掩膜版对硅片曝光30秒（剂量约为300 mJ/cm2）。
    5. 将硅片置于加热板上，在95 °C下进行15分钟的曝光后烘烤，然后在平坦水平面上冷却5分钟，再进行显影。
    6. 将硅片放入塑料皿中，并浸入适当的显影液中（见材料表），同时显影两层光刻胶。可轻轻摇晃器皿，使新鲜显影液不断流过硅片表面。
    7. 17分钟后，用异丙醇（IPA）冲洗硅片。若出现白色薄膜，则交替使用显影液和IPA反复冲洗，直至薄膜消失。用氮气吹干图案化的硅片。
  2. 聚二甲基硅氧烷软光刻
    1. 将硅片置于等离子清洗机中（设定为高功率），用空气等离子体处理30秒以清洁表面。在低于硅烷闪点（85 °C）的加热板上，于化学通风橱中使用三氯(1H,1H,2H,2H-全氟正辛基)硅烷对硅片进行硅烷化处理，持续2小时。
    2. 将聚二甲基硅氧烷（PDMS）与固化剂按10:1的比例混合后浇注到硅模具上。将混合后的PDMS在真空腔中脱气，然后在70 °C烘箱中固化1小时，或直至PDMS完全固化。
    3. 使用手术刀切割PDMS器件，并从硅模具上剥离下来。使用1.5 mm的活检打孔器创建种子和处理入口，其中种子入口以45°角打孔，以促进根系向主通道生长。
    4. 使用透明胶带清除PDMS器件上的碎屑，并将器件图案面朝下放置在玻璃盖玻片上。对组装好的器件进行高压灭菌处理。

2. 植入装置

  1. Arabidopsis thaliana 种子准备
    1. 在微量离心管中用30%市售漂白剂（用去离子水稀释）和0.1% Triton X 去垢剂混合溶液对A. thaliana 种子进行表面灭菌7分钟，然后用无菌水清洗种子4次。
    2. 将微量离心管置于4 °C冰箱中过夜或最多一周，对种子进行低温层积处理。
  2. 装置准备
    1. 将已灭菌的装置放入真空脱气室中，以去除气体可渗透的PDMS材料和流体通道中的空气，便于后续填充。
    2. 从真空室中取出装置，并立即将其浸入盛有pH 5.7的¼强度植物培养液的培养皿中。
    3. 使用移液器从入口处抽吸液体，使装置充满液体。通过目视检查确保通道内无气泡残留。
    4. 将单个装置转移至新的干燥培养皿中。倒入或用移液器加入热琼脂，围绕装置直至琼脂液面几乎与PDMS装置顶部齐平。待琼脂凝固。
      注意：装置现已准备好用于播种，或可在4 °C下储存至使用时。
  3. 在装置内播种
    1. 在无菌环境下，使用小移液器将一颗已灭菌的种子转移至每个装置的入口处。
    2. 用石蜡膜（见材料表）封住培养皿，并将其置于室温下的光照/黑暗循环生长箱或窗台上。将培养皿竖直放置，使装置呈垂直方向，以便重力引导根部穿过通道生长。

3. 治疗

  1. 实验处理
    1. 在幼苗发育的预定时间，通过移液器将规定量的处理试剂分别加入8个侧孔中，对幼苗进行实验处理。
    2. 重新密封培养皿，并放回培养室或窗台。
    3. 在预定时间对样品进行成像，以获取单个时间点图像，或开始延时成像。

4. 光学成像

  1. 低分辨率（4 - 20X）成像
    1. 将含有装置和幼苗的整个培养皿置于倒置明场显微镜下，进行低分辨率（4 - 20X）明场或微分干涉差（DIC）成像。通过调节曝光时间、光源亮度、光圈和光的偏振状态，优化照明条件以清晰显示目标形态特征。移动载物台至根部目标区域，并对准根或目标根毛进行聚焦。
    2. 采集单个时间点或一系列时间序列图像。为观察根毛生长过程，每分钟拍摄一次生长中的根毛图像；为观察主根生长，则每30分钟采集一次图像。成像完成后，将培养皿及幼苗以垂直方向放回生长室或窗台。
  2. 高分辨率（20 - 63X）成像
    1. 待幼苗生长至所需时间后，使用镊子从琼脂上取下盖玻片及装置。用蘸有乙醇的实验室擦拭纸清洁盖玻片底部。
    2. 根据显微镜物镜制造商的建议，将推荐的浸没介质滴加至物镜上。将盖玻片朝下放置于显微镜载物台上，并升起载物台使其接触物镜上的浸没介质。通过调节曝光时间、光源亮度、光圈和光的偏振状态，优化照明条件。移动载物台至目标区域，并对准目标根毛进行聚焦。
      注意：观察胞质流动需使用DIC技术，观察细胞器运动则需使用荧光标记。
    3. 为定量分析根毛随时间的生长情况，每分钟采集一次图像。为观察细胞器运动，应在仍能识别细胞器荧光信号的前提下，尽量缩短荧光曝光时间，并以尽可能快的速度采集细胞器图像。对于较长时间的延时成像，应使用活细胞成像载物台培养箱以维持环境温度和湿度。
      注意：建议使用63X油镜对根毛细胞器进行成像。

5. 非光学成像

  1. 设备准备
    1. 待幼苗生长至所需时间后，从培养皿中取出装置和盖玻片。
    2. 将装置倒置，轻轻揭去盖玻片，使根部保留在PDMS通道内。
    3. 继续使用PDMS装置作为根部的基底，进行更高分辨率的原子力显微镜或扫描电子显微镜观察。
  2. 扫描电子显微镜
    1. 使用双枪电子束蒸发腔在根部及周围的PDMS上沉积一层薄铬（约20 nm）。
    2. 将根部和PDMS装置转移至扫描电子显微镜样品室。
      注意：成像条件， 即 电压、电流和工作距离需要优化，以在特定应用中达到所需的分辨率。
  3. 原子力显微镜（AFM）
    1. 将PDMS装置根部朝上固定在原子力显微镜（AFM）样品台上。为增强相机成像对比度并更清晰地区分根部与PDMS，可在将装置固定于AFM样品台前，先将其置于平坦的反射性基底（如镀金云母）上。
    2. 在PDMS装置顶部固定一个液体培养皿附件，并加水以保持根部在成像过程中的水分。
    3. 将样品台装入原子力显微镜（AFM）中。根据PDMS器件的厚度调整z轴控制，并通过摄像头引导，将悬臂驱动至根部的目标区域。
    4. 将激光与悬臂梁尖端对齐。为在接触模式成像中获得最佳效果，建议使用弹簧常数为0.01或0.03 N/m的悬臂梁，以在扫描过程中对根部施加最小的作用力。
    5. 缓慢降低扫描装置，直至悬臂刚好与样品接触。调节扫描尺寸至目标区域，选择扫描速度为每秒1行，每行采集256个电压点。开始扫描并采集数据。

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结果

此处所述的双层PDMS微流控装置具有一个 200 µm 主通道的高通道 拟南芥 根和一个 20 µm 高腔室用于限制侧向生长的根毛图1A）。该设计可用于根系直径相似的植物物种 拟南芥 并可轻松修改以适应不同体型的物种. 该设计包含一个用于植物的入口，以及8个侧向入口，可用于施加任何所需的化学或生物处理。通过在装置中预先填充培养基，并在装置周围倒入琼脂，可在整个实验过程中保持根部环境的湿润，无需使用外部流体设备。图1B琼脂还能在培养皿中稳定装置，使幼苗垂直生长，以促进根系沿主通道向下生长。培养皿可将幼苗限制在已知的无菌环境中，并允许通过培养皿直接观察根系，最高可实现20倍的放大成像。另一种选择是将PDMS装置直接密封在玻璃底培养皿上，以实现更高的光学放大倍数。

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讨论

本文所述构建植物芯片平台的方法具有独特性，其双层设计可将根毛限制在单一成像平面内，且该平台可拆解后用作高分辨率非光学成像的基底。采用高分辨率非光学成像技术可提供仅靠光学成像无法获得的植物组织信息。例如，原子力显微镜（AFM）成像可提供力的测量数据，用于计算根组织在发育过程中或特定化学或生物处理后的弹性；类似地，扫描电子显微镜（SEM）成像可提供根组织表面形貌的高分辨率细节，若结合化学成像技术，还可获得组织的元素组成信息19。该微流控平台的后续迭代将优化其与其他化学成像系统的兼容性，例如基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-MS）和相干反斯托克斯拉曼散射光谱（CARS）。

该方法的关键步骤包括使用琼脂固定装置，并为植物提供水分，而无需复杂的流体流动操作。在将PDMS装置从玻璃基底上拆解时，也必须小心操作，以保持根系形态的完整性。如果实验目的仅为低至中等分辨率的光学成像，且无需拆解装置，则可通过氧等离子体处理将装置与下方玻璃基底进行化学键合，从而简化操作流程。通过将PDMS直接化学键合至玻璃底培养皿上，然后如前所述在PDMS周围倒入琼脂...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本手稿由 UT-Battelle, LLC 根据与美国能源部签订的第 DE-AC05-00OR22725 号合同撰写。美国政府保留本手稿的版权，出版方在同意发表该文章的同时，承认美国政府保有在全球范围内非独占、已付费、不可撤销的许可，可用于发表或复制本手稿的已发表形式，或允许他人出于美国政府目的进行此类操作。能源部将根据《美国能源部公共获取计划》（http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan），提供对这些联邦资助研究成果的公众访问权限。

本工作部分由美国能源部科学办公室生物与环境研究项目下的基因组科学计划资助，属于植物-微生物互作科学重点研究领域（http://pmi.ornl.gov）。微流控平台的制备在纳米相材料科学中心的纳米制造研究实验室完成，该实验室为美国能源部科学办公室用户设施。JAA 获美国国家科学基金会研究生研究奖学金 DGE -1452154 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
硅片WRS Materials直径100mm，厚度500-550µm，优等品，电阻率10-20，N型掺磷<100>
接触式光刻对准仪Neutronix Quintel CorpNXQ 7500 掩模对准仪
荧光显微镜NikonEclipse Ti-U
实验室擦拭纸Kimberly ClarkKimwipe KIMTECH SCIENCE 品牌，34155
负性光刻胶环氧树脂MicrochemSU-8 2000s 系列
光刻胶显影液MicrochemSu-8 显影液
三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷Sigma Aldrich需在通风橱中使用
空气等离子清洗机Harrick Plasma
聚二甲基硅氧烷（PDMS）Dow CorningSylgard 184 硅橡胶基础剂
PDMS 固化剂Dow CorningSylgard 184 硅橡胶固化剂
干燥器Bel-ArtF42010-000
手术刀X-acto 刀
活检打孔器Ted Pella15110-15
胶带Staples透明胶带
微量离心管Eppendorf
吐温 X-100（Triton X）J.T.Baker XI98-07
漂白剂Chlorox浓缩型
植物培养基Phyto Technology LaboratoriesM524
琼脂TeknovaA7777
封口膜Parafilm
显微镜OlympusIX51
原子力显微镜Keysight Technologies5500 PicoPlus AFM
培养皿VWR
扫描电子显微镜JEOL7400
双枪电子束蒸发仪Thermionics定制双电子枪蒸发系统

参考文献

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