人视网膜及视网膜色素上皮-脉络膜组织的解剖用于蛋白质组学分析

摘要

人类视网膜由功能和分子特征不同的区域组成，包括中央凹、黄斑和周边视网膜。本文介绍一种利用打孔活检和手工剥离人眼组织层的方法，以分离并收集这些不同的视网膜区域，用于后续的蛋白质组学分析。

摘要

人类视网膜由感觉性神经视网膜和其下方的视网膜色素上皮（RPE）组成，RPE 与血管脉络膜层紧密连接。视网膜的不同区域在解剖结构和分子特征上各不相同，从而支持其独特功能，并表现出对疾病的差异性易感性。对这些区域和层次进行蛋白质组学分析，可为多种疾病（包括年龄相关性黄斑变性（AMD）、糖尿病和青光眼）的分子机制提供重要见解。然而，在进行定量蛋白质组学分析之前，必须首先分离视网膜的不同区域和层次。本文介绍了一种从人眼中分离和采集黄斑中心凹、黄斑区及周边视网膜区域及其下方 RPE-脉络膜复合体的方法，该方法包括区域性打孔活检以及手工剥离组织层。随后可采用一维 SDS-PAGE 及下游蛋白质组学分析技术（如液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS））鉴定各分离视网膜层中的蛋白质，从而揭示视网膜疾病的分子生物标志物。

引言

视网膜、视网膜色素上皮（RPE）和脉络膜是复杂的组织，其在蛋白质表达、生理功能及病理易感性方面表现出重要的区域差异^1,2。例如，年龄相关性黄斑变性（AMD）、视网膜色素变性以及中心性浆液性视网膜病变等疾病均分别在黄斑中心凹、黄斑区或视网膜周边部表现出特征性的病变定位^1,3,4,6。本文介绍一种可对不同视网膜区域进行独立取样的方法。该方法的总体目标是为从人视网膜及RPE-脉络膜的中心凹、黄斑区和周边区域可靠地采集组织样本以进行蛋白质组学分析提供指导。开发并应用此技术的依据在于，通过对这些特定视网膜区域进行蛋白质组学分析，可获得有关这些区域生理与病理生理功能的重要分子层面的见解。

该方法有望揭示不同区域对疾病易感性的蛋白质组学基础，并有助于发现新的特异性治疗靶点。事实上，对玻璃体及其与视网膜相互作用的蛋白质组学研究已为健康和病变组织的分子组成与功能提供了关键见解^{5,7,8,9,10,11,12,13}。然而，目前尚缺乏对不同视网膜区域进行明确的比较性蛋白质组学分析。本技术将有助于推动这些亟需开展的研究，通过提供一种可靠且可重复的组织采集方法，在与其他方法的比较中展现出优势。更重要的是，该方法具有很高的可及性，利用标准尺寸且易于获取的组织打孔活检工具即可完成。我们的技术强调了组织在蛋白质组学处理过程中的正确采集与储存，充分考虑了蛋白质稳定性与降解问题。因此，该方法最适合计划进行蛋白质组因子下游分子分析的研究人员使用。

方案

本研究已获得爱荷华大学机构审查委员会的批准，并遵循《赫尔辛基宣言》中提出的原则。

1. 黄斑和中心凹活检打孔

1. 将人眼打开并展成蝴蝶状，使其形成四个独立的组织瓣，具体操作如先前发表的文献所述。⁵
2. 从置于培养皿中的剖开的人眼开始，将4毫米的打孔活检工具对准黄斑中心，下压并轻轻滚动，直至在黄斑周围形成切口。
3. 接下来，将8-mm皮肤打孔活检工具对准黄斑区血管弓内侧中心并轻轻按压，同时进行滚动，以在黄斑周围制作切口。这将形成围绕第一圈组织的第二个外环状组织。

2. 周边视网膜活检穿刺

1. 使用4-mm皮肤打孔活检工具在周边视网膜的弓状结构外侧进行一系列打孔。每个象限瓣膜处制作两个打孔。
   注意：完成所有打孔后，眼球中央将呈现两个同心圆状打孔，分别代表黄斑和中心凹，每个瓣膜基部各有两个打孔，周边视网膜共8个打孔。

3. 黄斑和中心凹活检样本采集

1. 由于组织现已准备就绪，可将所有组织活检样本分别收集于微量离心管中，并使用液氮冷冻，以用于后续处理。所有样品在使用前均应保存在 -80 °C 条件下。
2. 使用弯曲的 0.12 Colibri 镊子夹住视网膜中央凹透明组织的边缘。采集时，抬起并分离中央凹组织与下方的视网膜色素上皮层-脉络膜。
3. 同样，使用 0.12 Colibri 镊子夹取透明黄斑区组织的外环部分。如果组织仍与下方或邻近组织相连，可使用 Westcott 剪刀小心修剪边缘，仅获取视网膜成分，并剔除穿孔中可能包含的视神经组织。

4. 周边视网膜采集

1. 使用弯曲的 0.12 Colibri 镊子轻轻将周边视网膜组织圆盘从下方的视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜分离，并放入各自的微量离心管中。
2. 若存在残留的玻璃体凝胶，应在收集视网膜组织前，先用镊子提起并尽可能分离去除凝胶。一旦视网膜被移除，下方仍保留有色素化的视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜。

5. 中央凹及黄斑区视网膜色素上皮-脉络膜采集

1. 使用0.12 Colibri镊子夹住位于已切除黄斑区下方的深色RPE-脉络膜组织边缘。小心将其从巩膜上分离并收集。
2. 使用同一把镊子夹住位于已切除黄斑区域下方的外圈深色RPE-脉络膜组织边缘。通过在环状组织的不同位置夹住边缘并轻轻牵拉，小心地将其从巩膜上分离。最终，该RPE-脉络膜组织环将被剥离，可进行收集。
   注意：在去除过程中，对侧手使用辅助镊子有助于操作RPE-脉络膜组织。与视网膜组织类似，可使用Wescott剪刀辅助去除 punch工具未能完全切开的组织。

6. 周边视网膜 RPE-脉络膜采集

1. 使用0.12 Colibri镊子剥离8个周边穿孔区域的视网膜色素上皮-脉络膜组织。
2. 同前，将视网膜色素上皮-脉络膜组织置于微量离心管中，并用液氮冷冻以用于后续处理。所有样品在使用前均应保存在-80 °C条件下。

7. 剪刀解剖

注意：如果穿刺活检刀片钝化或穿刺活检工具施力不足，可能导致组织周围切口不整齐。

1. 在这些情况下，应尽可能将组织拉开，然后使用Westcott剪刀进行修剪和分离。

结果

视网膜和视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜组织可根据具体研究需求采用多种方式进行处理。采集后，研究人员将获得来自黄斑中心凹区、周边黄斑区和视网膜周边区的视网膜及RPE-脉络膜组织样本（图1）。具体而言，中心凹区打孔样本包含中心凹、旁中心凹以及少量相邻的周边中心凹区域；黄斑区打孔样本则包括剩余的周边中心凹区域以及少量相邻的近周边区域；最后，周边区打孔样本取自中周和远周视网膜区域。在一项代表性实验中，组织样本经胰蛋白酶消化后，采用一维SDS-PAGE分析以观察其蛋白质组成（图2A）。该分析结果表明，视网膜不同区域之间存在差异性蛋白质表达。通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）⁶进一步分析，成功鉴定了视紫红质（rhodopsin）的肽段，该蛋白是视网膜中含量极高且具有特征性的蛋白质。来自黄斑区的一个代表性视紫红质质谱图如图2B所示。对蛋白质组成进行更...

讨论

组织采集后，样本的处理与处置是至关重要的考虑因素¹⁴。相比化学固定，液氮保存更受推荐，因为后者可能破坏蛋白质结构，从而影响后续分析结果。此外，与不涉及样本冷冻的保存方法相比，液氮保存同样更具优势。值得注意的是，Ferrer et al. 的研究显示，4 °C 或室温下保存的脑组织样本与在 0 °C 保存的样本相比，其蛋白质水平存在显著差异¹⁵。此外，在样本处理过程中需格外谨慎，因为在冷冻前进行的特定化学或物理处理可能改变蛋白质含量及翻译后修饰^16,17。这一点凸显了在处理样本时需充分考虑其后续分析用途的重要性。另外，组织采集的死后时间也是影响特定蛋白质水平与稳定性的另一因素。样本蛋白质组的降解程度取决于死后时间及储存温度^18,19,20...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4 毫米皮肤打孔活检工具	Miltex	REF 33-34
8 毫米皮肤打孔活检工具	Miltex	REF 33-37
0.12 Colibri 镊子	Stephens Instruments	S5-1145
Wescott 剪刀	Sklar Surgical Instruments	64-3146
微量离心管	Eppendorf	#022364111	1.5 mL
液氮	Praxair, Inc.	7727-37-9 [R]