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方法文章

利用三维细胞培养和非抗凝全血评估内皮细胞的抗凝和抗炎特性

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DOI：

10.3791/56227

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2017年9月5日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Research, University of Bern, 2Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern, 3Immunology Research Centre, St. Vincent's Hospital Melbourne, 4Institute of Pathology, University of Bern, 5Institute of Molecular Animal Breeding and Biotechnology, Ludwig-Maximilian University

本文内容

摘要

我们介绍一种 体外 一种可用于研究和分析全血（未经抗凝处理）中凝血过程的模型。该系统中的抗凝作用依赖于健康内皮细胞的天然抗凝效应，而内皮细胞激活将导致血液凝固。

摘要

体内，内皮细胞对循环血液的天然抗凝至关重要。因此，内皮细胞的活化会导致血液凝固。这一现象在多种临床情况下均可观察到，例如存在预形成抗供体抗体时的器官移植（包括异种移植）以及缺血/再灌注损伤。为了遵循3R原则（减少、替代和优化）以减少动物实验，建立用于研究内皮细胞活化对血液凝固影响的体外模型将非常理想。然而，常规的平面培养系统所提供的内皮表面积与血液体积之比仅为每毫升血液对应1–5 cm2内皮，不足以实现由内皮介导的天然抗凝作用。将内皮细胞培养于微载体珠上，可将表面积与体积之比提高至40–160 cm2/mL。该比例的提升足以确保全血的"天然"抗凝效果，从而避免使用抗凝剂。本文介绍了一种基于微载体的体外系统，用于研究猪内皮细胞的基因修饰对未经抗凝处理的人全血凝固的影响。在该检测方法中，将原代猪主动脉内皮细胞（野生型（WT）或转染人CD46和血栓调节蛋白的转基因型）培养于微载体珠上，随后与新鲜采集的未经抗凝处理的人全血接触。该模型可用于测定并量化血浆中细胞因子的释放，以及补体和凝血系统的活化标志物。此外，通过共聚焦显微镜对活化的内皮细胞以及免疫球蛋白、补体蛋白和凝血蛋白在内皮化微珠上的沉积情况进行成像分析。该检测方法还可用于评估旨在抑制内皮细胞活化从而防止凝血的药物效果。除具备减少此类研究中动物使用数量的潜力外，该检测方法操作简便且结果具有一致的可重复性。

引言

血管内皮由单层内皮细胞（EC）组成，这些细胞排列在血管腔内。在生理状态下，静息的内皮细胞负责维持抗凝和抗炎的微环境。1 这一功能通过内皮细胞表面表达抗凝和抗炎蛋白来实现。例如，由缺血/再灌注损伤或（异种）移植器官的血管排斥反应引起的内皮细胞活化，会导致内皮表面从抗凝和抗炎状态转变为促凝和促炎状态。1

为了研究内皮细胞与凝血因子之间复杂而引人入胜的相互作用， 体外 尽可能接近地模拟的模型 体内 情况非常理想。一种常见的局限性是表征传统 体外 使用抗凝血液是凝血检测的一个特点，这使得对凝血介导效应的分析变得困难，即使对枸橼酸盐抗凝全血重新钙化，也无法重现新鲜非抗凝血液所能获得的结果。2 此外，在传统的平面培养细胞系统中，无法利用内皮层的抗凝血特性，因为每单位血液体积无法达到足够的内皮细胞表面积。本文所介绍的模型通过在球形微载体珠表面培养内皮细胞（EC），克服了这些限制，从而实现了较高的内皮细胞表面积与血液体积之比。 >16 cm2/mL，这与小动脉或小静脉中的情况相似，且已有研究描述该密度足以通过内皮细胞表面实现血液的“自然”抗凝。3,4 全血在此条件下可无需添加抗凝剂直接使用。实验过程中可采集血样，用于检测和定量细胞因子、凝血因子及可溶性补体活化标志物。此外，可通过共聚焦显微镜分析内皮细胞包被的微载体珠，以检测补体和免疫球蛋白的沉积情况，以及内皮细胞活化标志物的表达。另一项有意义的应用是测试旨在抑制内皮细胞活化从而防止凝血的药物。5 尽管该模型无法完全替代动物实验，但它提供了一种用于检验特定功能假设的方法 离体 利用细胞从而减少在缺血/再灌注损伤或异种移植基础研究中所使用的动物数量。

本研究所描述的模型用于模拟异种移植环境，其中将猪主动脉内皮细胞（PAEC）培养在微载体珠上，并与未经抗凝处理的人全血共同孵育。研究人员分析了多种携带不同人类基因（如用于调节补体系统的CD46和/或用于调节凝血系统的血栓调节蛋白（hTBM））的转基因PAEC的抗凝血特性。内皮细胞活化、补体系统和凝血系统受到严密调控且相互关联。6 因此，了解这些不同的转基因细胞在接触人血后，其黏附分子表达、细胞因子释放、糖萼脱落以及抗凝蛋白丢失等方面的行为至关重要。7

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方案

德国兰德拉斯猪（在当地农舍培育的野生型及德国慕尼黑路德维希-马克西米利安大学分子动物育种与生物技术研究所培育的转基因型），体重介于30 kg至40 kg之间，用于本研究。所有动物均在标准条件下饲养，自由饮水并喂食 随意摄取所有动物实验均遵循英国《动物法案（科学程序）》、美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》以及瑞士动物保护法。所有动物研究均符合ARRIVE指南。所有动物实验程序均经州级兽医服务机构动物实验委员会（瑞士伯尔尼州）批准，许可编号BE70/14。实验方案根据3R原则进行了优化，并采用先进的麻醉和镇痛管理措施，以尽量减少动物使用数量，并降低实验过程中动物所承受的压力与疼痛。

根据瑞士法律及伯尔尼大学医院的伦理指南，通过封闭系统静脉穿刺法从健康个体采集血液。短语"非抗凝血液"指血液未经过任何抗凝剂处理。

以下步骤需在无菌条件下进行。操作人员须熟悉基本的细胞培养无菌技术。

1. 肺动脉内皮细胞的分离

注意：从3至6月龄的德国长白猪（因其他体内实验而被实施安乐死）获取长度为6至10 cm的胸主动脉节段，并立即转移至含有运输培养基（DMEM + 1% 青霉素/链霉素）的500 mL玻璃瓶中。

  1. 用含12.5 µg/mL纤维连接蛋白的1× PBS预包被6孔板，并于37 °C孵育1小时。
  2. 提前预热无菌1× PBS和细胞培养基（DMEM）。
  3. 将猪主动脉从运输介质中取出。
  4. 将主动脉置于聚苯乙烯板上。
  5. 预先用温热的PBS轻轻冲洗。
  6. 沿纵向切开主动脉，并用针固定。
  7. 在血管内表面加入温热的细胞培养基。
  8. 吸除纤维连接蛋白-细胞培养基，加入新鲜细胞培养基（DMEM，添加10% FBS、1%青霉素/链霉素和0.4%内皮细胞生长培养基补充剂混合液）。
  9. 将一根棉签浸入细胞培养基中，然后将棉签头沿血管内表面最顶端同一方向轻柔缓慢地擦拭。
  10. 在6孔板的一个孔中，将细胞逐圈擦拭。
  11. 对其余各孔重复相同操作。
  12. 在显微镜下观察细胞，并将6孔板置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。
  13. 第二天更换培养基，之后每2–3天更换一次。
  14. 当细胞即将汇合时，用胰酶消化细胞并接种至T75培养瓶（PAEC P1）。

2. 肺动脉内皮细胞（PAEC）表征

  1. 在8孔细胞培养板中加入含12.5 µg/mL纤连蛋白的1× PBS溶液进行预包被，并于37 °C孵育1小时。
  2. 每孔接种5 × 104个细胞，在37 °C培养箱中过夜培养。
  3. 用PBS++（含CaCl2和MgCl2的PBS）洗涤细胞两次，每次每孔300 μL。
  4. 用3.7%多聚甲醛在室温下固定细胞10分钟，每孔200 μL。
  5. 用PBS++洗涤细胞三次，每次每孔300 μL。
  6. 加入300 μL含1× PBS-3% BSA的封闭缓冲液，室温孵育30分钟。
  7. 将一抗（抗VE-钙黏蛋白、抗CD31、抗vWF）用含1× PBS-1% BSA-0.05%去污剂的溶液稀释后加入，每孔160 μL，室温孵育1小时。
  8. 用PBS++洗涤三次，每次每孔200 μL。
  9. 将二抗和DAPI用含1× PBS-1% BSA-0.05%去污剂的溶液稀释后加入，每孔160 μL，室温孵育1小时。
  10. 用PBS++洗涤三次，每次每孔200 μL。
  11. 用基于甘油的封片剂封片，并在荧光显微镜下检测内皮细胞标志物的表达。
    注意：将猪主动脉内皮细胞在T175培养瓶中培养（低糖DMEM培养基，含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和0.4%内皮细胞生长因子补充剂混合物），直至细胞融合度达到90%。（接种密度为1 × 106个细胞，90%融合度约相当于5 × 106个细胞）。

3. 微载体珠的包被

  1. 在50 mL离心管中，将7 mL微载体珠与42 mL胶原蛋白溶液（100 μg/mL，用0.2%乙酸溶液稀释）混合，室温孵育1小时。
  2. 用25 mL PBS（pH 7.4）洗涤珠子两次（加入25 mL PBS，用移液器充分混匀，待珠子沉降后弃去上清液，重复一次），再用25 mL DMEM培养基洗涤一次。
  3. 在50 mL离心管中，用10 mL补充了10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素、1% L-谷氨酰胺、0.4%内皮细胞生长培养基补充剂混合物以及25 μL肝素（5000 IU/mL）的M199培养基覆盖珠子，静置10分钟使其平衡，之后再进行后续操作。

4. 收集细胞

  1. 从含有PAEC的T175培养瓶中移除细胞培养基，并加入5 mL pH 7.4的PBS。
  2. 从T175培养瓶中移除PBS。
  3. 加入5 mL含0.05% EDTA的胰蛋白酶溶液，在37 °C孵育3–4分钟。
  4. 用15 mL细胞培养基冲洗培养瓶以收集细胞，将细胞悬液转移至50 mL离心管中。
  5. 在室温下以1,200 × g离心8分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于5 mL细胞培养基中。

5. 将细胞接种至搅拌烧瓶中

  1. 向细胞悬液中加入 20 mL 细胞培养基并重悬。
  2. 向 500-mL 磁力搅拌瓶中加入 20 mL 细胞培养基（不含细胞）。
  3. 将细胞加入步骤 3.3 中已洗涤的微载体珠中，并用 25-mL 血清移液管小心混匀。
  4. 将珠子/细胞混合物转移至磁力搅拌瓶中。
  5. 用 10 mL 细胞培养基冲洗 50-mL 离心管，以收集残留的细胞。
  6. 向搅拌瓶中额外加入 85 mL 细胞培养基，并于 37 °C 摇床中（100 × g，混合间隔：每 45 分钟 3 分钟）过夜培养。
  7. 加入 50 mL 细胞培养基（总体积 200 mL），并在 37 °C 摇床中继续搅拌 24 小时（100 × g，混合间隔：每 45 分钟 3 分钟）。
  8. 加入无色 RPMI 培养基（添加 10% FBS、1% 青霉素/链霉素、1% L-谷氨酰胺、0.4% 内皮细胞生长培养基补充剂混合物和 25 μL 肝素），直至总体积达到 320 mL。
  9. 每 48 小时更换一次培养基：移除 100 mL 旧培养基，并加入 100 mL 新鲜的补充无色 RPMI 培养基。
  10. 培养细胞 5 至 7 天，具体时间取决于细胞包被珠子的融合状态。

6. 汇合度验证

  1. 用移液器收集200 μL包被细胞的磁珠，转移至聚丙烯管中。
  2. 用600 μL 1× PBS缓冲液洗涤磁珠3次（加入PBS后，倾斜试管并轻轻混匀，避免细胞脱落；待磁珠沉降后，弃去上清液，重复此步骤）。
  3. 加入200 μL苦味酸溶液，固定磁珠10分钟。
  4. 用600 μL 1× PBS缓冲液洗涤3次。
  5. 加入用1× PBS稀释的DAPI染液，孵育10分钟。
  6. 将磁珠转移至载玻片上，使用甘油封片剂加盖盖玻片。
  7. 在共聚焦显微镜下观察磁珠。

7. 实验步骤

  1. 用10 mL血清移液管将包被细胞的珠粒从磁力搅拌瓶中取出（操作无需在无菌条件下进行），转移至12 mL圆底聚丙烯管中。
  2. 让珠粒沉降（约1–2分钟），去除上清液。
  3. 向各管中添加更多珠粒，直至每管恰好含有2 mL珠粒。
  4. 向每管中加入5 mL透明RPMI培养基，使用10 mL血清移液管轻轻混匀。
  5. 让珠粒沉降，去除上清液。
  6. 再用RPMI培养基重复洗涤一次，并彻底去除所有上清液。

8. 使用非抗凝血液孵育

  1. 从健康志愿者体内小心缓慢地采血（不使用喷射式采血针或真空采血管），将血液收集至9 mL中性聚丙烯管中（无需抗凝剂）。
  2. 用10 mL血清移液管将8 mL血液缓慢转移至每个含有2 mL细胞包被微珠的聚丙烯管中（总体积为10 mL）。始终避免剧烈操作血液或微珠，以防内皮细胞过早活化。该操作耗时1 - 2分钟。
  3. 轻轻倾斜血液/微珠混合物以确保充分混匀，并用石蜡膜密封管盖。
  4. 将试管置于37 °C培养箱内的水平倾斜摇床（仅使用轻柔倾斜模式）上，并记录凝血时间。
    1. 在设定的时间点，例如 10、20、30、50、70、90分钟后，从不同试管中分别取出至少1.5 - 2 mL血液-微珠混合物用于血清或血浆分析。
      注意：对于6个时间点，建议每组细胞设置超过3个重复，因为血液取样将在不同试管中进行。
    2. 如需收集血清，让血液自然凝固；如需收集血浆，在加入血液样本前向2 mL试管中添加EDTA或枸橼酸盐。
    3. 将试管置于冰上保存，在4 °C条件下以2,500 × g离心10分钟，然后将血清/血浆于-80 °C保存直至使用。
      注意：材料的详细信息见材料表

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结果

在旋转烧瓶中培养 7 - 10 天后（图 1），细胞达到汇合状态，覆盖了微载体珠的整个表面（图 2）。验证细胞是否汇合是一个重要步骤，因为微珠表面的内皮细胞单层若未达到汇合，将显著缩短凝血时间，这是由于微载体珠表面具有强烈的促凝血活性（凝血时间：4 ± 1 分钟）（图 3）。

另一个需要注意的重要因素是倾斜板的速度。较高的倾斜速度会促进血液凝固。如果微载体表面存在内皮细胞单层，则可观察到凝血时间延长。与野生型PAEC相比，使用GalTKO/hCD46/hTBM转基因PAEC可显著延长凝血时间（图3）。当PAEC表面缺失Gal-α-1,3-Gal异种抗原（GalTKO）时，凝血时间增加（PAEC WT为25 ± 8分钟...

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讨论

本文介绍的模型适用于与凝血相关的研究，可用来分析凝血的不同方面及其与内皮细胞（EC）的相互作用8。在异种移植研究中，该模型是一种有效的体系，可用于检测不同基因修饰的猪源性内皮细胞与人血孵育后的抗凝血特性9。

实验方案中最关键的步骤包括：在开始实验前确保微珠表面完全被细胞覆盖（达到汇合）；以及仔细采集和处理未抗凝全血，以避免因高剪切应力导致血小板过早活化，若使用真空采血管采集血液则可能引发此类情况。10 然而，该系统存在一些局限性，包括缺乏可循环的封闭系统以及缺乏能够更真实地模拟生理状态的生理剪切应力 体内 条件。

尽管存在这些局限性，所描述的模型相较于目前现有的模型仍具有显著优势。由于使用了微载体珠，内皮细胞表面积与血液体积的比率得以增加，从而能够建立抗凝血和抗炎环境，并可使用未抗凝的全血。在当前的平面培养模型中，这一点无法实现，因此涉及内皮细胞活化导致血液凝固的机制...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由瑞士国家科学基金会（SNSF，资助号：320030_156193）资助。作者感谢Benoît Werlen博士提供Biosilon微载体珠。我们还感谢Hans Peter Kohler教授和André Haeberli教授在建立微载体珠模型方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PAEC本实验室从猪主动脉中分离
微载体珠（Biosilon）Thermo Fisher Scientific160-250
牛I型胶原蛋白GibcoA10644-01
DMEMGibco21885-025
199培养基SigmaM7528
RPMIGibco32404-014
中性管Sarstedt02.1726.001
聚丙烯管SimportT406-2A
搅拌烧瓶Tecnomara
生物搅拌器BrouwerMCS-104S
大鼠抗CD31R&D SystemsMAB33871稀释比例 1:100
山羊抗大鼠IgG-Cy3Jackson Immuno Research112-166-003稀释比例 1:500
山羊抗VE-钙黏蛋白Santa Cruzsc-6458稀释比例 1:100
兔抗vWFDAKOA0082稀释比例 1:100
驴抗山羊IgG – Alexa 488Molecular ProbesA11055稀释比例 1:500
山羊抗兔 - FITCSouthern Biotech4050-02稀释比例 1:500
DAPISigma32670-25MG-F稀释比例 1 µg/mL
0.05% 胰蛋白酶-EDTAGibco25300-054
FBSGibco10270-106终浓度：细胞培养基中含10%
适配器Sarstedt14.1205
共聚焦显微镜Carl ZeissLSM 710
图像分析软件Image J免费获取地址：https://imagej.net
内皮细胞生长培养基添加剂混合液PromoCellC-39216每500 mL DMEM中加入2 mL
青霉素-链霉素Gibco15140-122终浓度：细胞培养基中含1%
L-谷氨酰胺Gibco25030-024终浓度：细胞培养基中含1%
肝素钠Drossa Pharm AG储存浓度：5000 U.I./mL
腔室载玻片Bioswisstec AG30108
CaCl2 × 2H2OMerck2382.0500
MgCl2 ×6 H2OMerck1.5833.1000
Tween 20Axon Lab AG9005-64-5
牛血清白蛋白（BSA）SigmaA7030
甘油凝胶封片剂DakoC0563

参考文献

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