利用三维细胞培养和非抗凝全血评估内皮细胞的抗凝和抗炎特性

摘要

我们介绍一种 体外 一种可用于研究和分析全血（未经抗凝处理）中凝血过程的模型。该系统中的抗凝作用依赖于健康内皮细胞的天然抗凝效应，而内皮细胞激活将导致血液凝固。

摘要

体内，内皮细胞对循环血液的天然抗凝至关重要。因此，内皮细胞的活化会导致血液凝固。这一现象在多种临床情况下均可观察到，例如存在预形成抗供体抗体时的器官移植（包括异种移植）以及缺血/再灌注损伤。为了遵循3R原则（减少、替代和优化）以减少动物实验，建立用于研究内皮细胞活化对血液凝固影响的体外模型将非常理想。然而，常规的平面培养系统所提供的内皮表面积与血液体积之比仅为每毫升血液对应1–5 cm²内皮，不足以实现由内皮介导的天然抗凝作用。将内皮细胞培养于微载体珠上，可将表面积与体积之比提高至40–160 cm²/mL。该比例的提升足以确保全血的"天然"抗凝效果，从而避免使用抗凝剂。本文介绍了一种基于微载体的体外系统，用于研究猪内皮细胞的基因修饰对未经抗凝处理的人全血凝固的影响。在该检测方法中，将原代猪主动脉内皮细胞（野生型（WT）或转染人CD46和血栓调节蛋白的转基因型）培养于微载体珠上，随后与新鲜采集的未经抗凝处理的人全血接触。该模型可用于测定并量化血浆中细胞因子的释放，以及补体和凝血系统的活化标志物。此外，通过共聚焦显微镜对活化的内皮细胞以及免疫球蛋白、补体蛋白和凝血蛋白在内皮化微珠上的沉积情况进行成像分析。该检测方法还可用于评估旨在抑制内皮细胞活化从而防止凝血的药物效果。除具备减少此类研究中动物使用数量的潜力外，该检测方法操作简便且结果具有一致的可重复性。

引言

血管内皮由单层内皮细胞（EC）组成，这些细胞排列在血管腔内。在生理状态下，静息的内皮细胞负责维持抗凝和抗炎的微环境。¹ 这一功能通过内皮细胞表面表达抗凝和抗炎蛋白来实现。例如，由缺血/再灌注损伤或（异种）移植器官的血管排斥反应引起的内皮细胞活化，会导致内皮表面从抗凝和抗炎状态转变为促凝和促炎状态。¹

为了研究内皮细胞与凝血因子之间复杂而引人入胜的相互作用， 体外 尽可能接近地模拟的模型 体内 情况非常理想。一种常见的局限性是表征传统 体外 使用抗凝血液是凝血检测的一个特点，这使得对凝血介导效应的分析变得困难，即使对枸橼酸盐抗凝全血重新钙化，也无法重现新鲜非抗凝血液所能获得的结果。² 此外，在传统的平面培养细胞系统中，无法利用内皮层的抗凝血特性，因为每单位血液体积无法达到足够的内皮细胞表面积。本文所介绍的模型通过在球形微载体珠表面培养内皮细胞（EC），克服了这些限制，从而实现了较高的内皮细胞表面积与血液体积之比。 >16 cm²/mL，这与小动脉或小静脉中的情况相似，且已有研究描述该密度足以通过内皮细胞表面实现血液的“自然”抗凝。^3,4 ....

方案

德国兰德拉斯猪（在当地农舍培育的野生型及德国慕尼黑路德维希-马克西米利安大学分子动物育种与生物技术研究所培育的转基因型），体重介于30 kg至40 kg之间，用于本研究。所有动物均在标准条件下饲养，自由饮水并喂食 随意摄取所有动物实验均遵循英国《动物法案（科学程序）》、美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》以及瑞士动物保护法。所有动物研究均符合ARRIVE指南。所有动物实验程序均经州级兽医服务机构动物实验委员会（瑞士伯尔尼州）批准，许可编号BE70/14。实验方案根据3R原则进行了优化，并采用先进的麻醉和镇痛管理措施，以尽量减少动物使用数量，并降低实验过程中动物所承受的压力与疼痛。

根据瑞士法律及伯尔尼大学医院的伦理指南，通过封闭系统静脉穿刺法从健康个体采集血液。短语"非抗凝血液"指血液未经过任何抗凝剂处理。

以下步骤需在无菌条件下进行。操作人员须熟悉基本的细胞培养无菌技术。

1. 肺动脉内皮细胞的分离

注意：从3至6月龄的德国长白猪（因其他体内实验而被实施安乐死）获取长度为6至10 cm的胸主动脉节段，并立即转移至含有运输培养基（DMEM + 1% 青霉素/链霉素）的500 mL玻璃瓶中。

1. 用含12.5 µg/mL纤维....

结果

在旋转烧瓶中培养 7 - 10 天后（图 1），细胞达到汇合状态，覆盖了微载体珠的整个表面（图 2）。验证细胞是否汇合是一个重要步骤，因为微珠表面的内皮细胞单层若未达到汇合，将显著缩短凝血时间，这是由于微载体珠表面具有强烈的促凝血活性（凝血时间：4 ± 1 分钟）（图 3）。

另一个需要注意的重要因素是倾斜板的速度。较高的倾斜速度会促进血液凝固。如果微载体表面存在内皮细胞单层，则可观察到凝血时间延长。与野生型PAEC相比，使用GalTKO/hCD46/hTBM转基因PAEC可显著延长凝血时间（图3）。当PAEC表面缺失Gal-α-1,3-Gal异种抗原（GalTKO）时，凝血时间增加（PAEC WT为25 ± 8分钟.......

讨论

本文介绍的模型适用于与凝血相关的研究，可用来分析凝血的不同方面及其与内皮细胞（EC）的相互作用⁸。在异种移植研究中，该模型是一种有效的体系，可用于检测不同基因修饰的猪源性内皮细胞与人血孵育后的抗凝血特性⁹。

实验方案中最关键的步骤包括：在开始实验前确保微珠表面完全被细胞覆盖（达到汇合）；以及仔细采集和处理未抗凝全血，以避免因高剪切应力导致血小板过早活化，若使用真空采血管采集血液则可能引发此类情况。¹⁰ 然而，该系统存在一些局限性，包括缺乏可循环的封闭系统以及缺乏能够更真实地模拟生理状态的生理剪切应力 体内 条件。

尽管存在这些局限性，所描述的模型相较于目前现有的模型仍具有显著优势。由于使用了微载体珠，内皮细胞表面积与血液体积的比率得以增加，从而能够建立抗凝血和抗炎环境，并可使用未抗凝的全血。在当前的平面培养模型中，这一点无法实现，因此涉及内皮细胞活化导致血液凝固的机制.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PAEC			本实验室从猪主动脉中分离
微载体珠（Biosilon）	Thermo Fisher Scientific	160-250
牛I型胶原蛋白	Gibco	A10644-01
DMEM	Gibco	21885-025
199培养基	Sigma	M7528
RPMI	Gibco	32404-014
中性管	Sarstedt	02.1726.001
聚丙烯管	Simport	T406-2A
搅拌烧瓶	Tecnomara
生物搅拌器	Brouwer	MCS-104S
大鼠抗CD31	R&D Systems	MAB33871	稀释比例 1:100
山羊抗大鼠IgG-Cy3	Jackson Immuno Research	112-166-003	稀释比例 1:500
山羊抗VE-钙黏蛋白	Santa Cruz	sc-6458	稀释比例 1:100
兔抗vWF	DAKO	A0082	稀释比例 1:100
驴抗山羊IgG – Alexa 488	Molecular Probes	A11055	稀释比例 1:500
山羊抗兔 - FITC	Southern Biotech	4050-02	稀释比例 1:500
DAPI	Sigma	32670-25MG-F	稀释比例 1 µg/mL
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300-054
FBS	Gibco	10270-106	终浓度：细胞培养基中含10%
适配器	Sarstedt	14.1205
共聚焦显微镜	Carl Zeiss	LSM 710
图像分析软件	Image J		免费获取地址：https://imagej.net
内皮细胞生长培养基添加剂混合液	PromoCell	C-39216	每500 mL DMEM中加入2 mL
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	终浓度：细胞培养基中含1%
L-谷氨酰胺	Gibco	25030-024	终浓度：细胞培养基中含1%
肝素钠	Drossa Pharm AG		储存浓度：5000 U.I./mL
腔室载玻片	Bioswisstec AG	30108
CaCl2 × 2H2O	Merck	2382.0500
MgCl2 ×6 H2O	Merck	1.5833.1000
Tween 20	Axon Lab AG	9005-64-5
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A7030
甘油凝胶封片剂	Dako	C0563