一种评估流感血凝素特异性抗体诱导的Fc介导效应功能的方法

摘要

我们描述了一种用于检测靶向流感病毒血凝素的抗体激活Fc介导效应功能的方法。该检测方法也可经调整后用于评估靶向其他病毒表面糖蛋白的单克隆抗体或多克隆血清诱导Fc介导免疫应答的能力。

摘要

抗体通过其抗原结合域和Fc区，在针对病毒病原体的先天免疫与适应性免疫应答的耦联中发挥关键作用。本文介绍如何利用经基因工程改造、表达激活型I型Fc-FcγR的Jurkat细胞系，检测靶向流感病毒血凝素的单克隆抗体对Fc效应功能的激活作用。通过该方法，可确定免疫球蛋白介导的特定Fc-FcγR相互作用的贡献。 体外 检测

引言

季节性流感疫苗所提供的免疫效果传统上通过血凝抑制（HI）试验进行评估¹，该方法用于检测靶向血凝素受体结合位点的抗体。这些具有血凝抑制活性的抗体可提供完全免疫保护，但其保护范围通常较窄，仅对少数几种流感病毒株有效。分离并表征可识别血凝素（HA）的广谱反应性单克隆抗体，提示通用型流感疫苗的研发已接近实现。^{2,3,4,5,6,7,8}通用流感疫苗的主要目标之一是诱导针对流感病毒保守区域的强效抗体反应^{9,10,11,12,13,14,....}

方案

本手稿中进行的实验均遵循西奈山医学院的机构伦理准则和规定。

1. 通过转染或感染表达流感病毒血凝素

转染：

1. 将人胚胎肾（HEK 293T）细胞以每孔 2 × 10⁴ 个细胞的密度接种于经组织培养处理的白色 96 孔板中，并在 37 °C 培养箱（含 5% CO₂）中静置 4 小时。
2. 每孔加入编码病毒血凝素的 100 ng DNA 和 0.2 μL 转染试剂，总体积为 50 μL，对细胞进行转染。
   注意：质粒和转染试剂均用 1× Opti-最低必需培养基（MEM）减血清培养基稀释。
3. 将培养板在 37 °C、含 5% CO₂ 的培养箱中孵育 18 小时后，移除转染培养基。

2. 感染

1. 将 A549 细胞或 Madin Darby 犬肾细胞以每孔 2 × 10⁴ 个细胞的密度接种于经组织培养处理的白色 96 孔板中，并在 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养至少 18 小时。
2. 用 1....

结果

我们证明，一种针对茎部的单克隆抗体6F12（而非针对头部的单克隆抗体PY102）能够通过上调CD107a和干扰素γ来激活原代自然杀伤细胞¹⁹。为了模拟茎部特异性抗体激活原代人自然杀伤（NK）细胞的能力，我们显示，茎部特异性单克隆抗体6F12可强烈激活表达小鼠FcγRIV的改造型Jurkat细胞，激活程度约为对照的14倍。相比之下，头部特异性单克隆抗体PY102和对照IgG则无此激活作用（图2）²⁸。

为了研究感染复数（MOI）是否会影响表达小鼠 FcγRIV 的 Jurkat 细胞的激活，我们将 MDCK 细胞以 MOI 为 3、1 或 0.33 的条件感染 X31 病毒（一种重配的甲型流感病毒，表达 A/Hong Kong/1/68 (H3N2) 病毒的血凝素和神经氨酸酶，以及 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 病毒的内部基因片段）。24 小时后，将表达小鼠 FcγRIV 的 Jurkat 细胞与单克隆抗体 .......

讨论

本文所述方法可用于检测针对HA的单克隆抗体与小鼠FcγRIV结合的能力。靶抗原流感病毒血凝素在病毒感染或质粒DNA转染细胞后表达于细胞表面。该检测方法还可适用于将其他表面表达的病毒蛋白与不同的FcγR（人源或小鼠源）联合使用。此外，我们曾利用血清样本评估多克隆抗体诱导Fc效应功能的能力（数据未显示），这在研究感染或疫苗接种所诱导的适应性免疫应答时可能提供更具相关性的信息。我们还推测，可通过将可溶性蛋白直接包被于酶标板上，对该检测方法进行改进以测量识别病毒内部蛋白的抗体的诱导情况。然而，该方法尚未经过严格验证。

抗体依赖性效应功能的诱导可能受到多种因素的影响，包括但不限于效应细胞与靶细胞的比例（每孔加入的效应细胞数量）、所用抗体的浓度、效应细胞与靶细胞共孵育的时间，以及检测缓冲液中所用低IgG血清的浓度。

传统上，测量抗体或多种抗体血清的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性的标准检测方法涉及从供体采集的原代自然杀伤（NK）细胞。FcγR的结合及细胞内信号通路的激活通常通过检测活化标志物CD107a和/或IFN-γ的表达来.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A549 细胞	ATCC	CCL-185	人肺腺癌肺泡基底上皮细胞
HEK 293T 细胞	ATCC	CRL-3216	人胚胎肾细胞
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019	转染试剂
1X Opti-MEM 减血清培养基	ThermoFisher Scientific	51985-034
白色组织培养处理的 96 孔板	Corning, Inc.	3917	检测用板
10X MEM	Gibco	11430-030
表达小鼠 FcgRIV 的 Jurkat 细胞	Promega	M1201	试剂盒包含细胞、Bio-Glo 荧光素酶检测系统、1X RPMI 及低 IgG 血清
表达人 FcgRIIIa 的 Jurkat 细胞	Promega	G7010	试剂盒包含细胞、Bio-Glo 荧光素酶检测系统、1X RPMI 及低 IgG 血清
表达人 FcgRIIa 的 Jurkat 细胞	Promega	G9901	试剂盒包含细胞、Bio-Glo 荧光素酶检测系统、1X RPMI 及低 IgG 血清
荧光检测仪	BioTek	Synergy H1 Multi-Mode reader	发光板读数仪
Bio-Glo 荧光素酶检测系统	Promega	G7940	包含荧光素酶检测缓冲液和荧光素酶检测底物
Madin Darby 犬肾细胞	ATCC	CCL-34	犬肾细胞