流感血凝素特异抗体诱导的 Fc 介导效应函数的一种评估方法

季节性流感疫苗提供的免疫传统上是通过血凝抑制 (HI) 检测方法¹来评估的, 它测量了针对血凝素受体结合部位的抗体的存在。这些高活性抗体可以赋予杀菌免疫, 但在其保护范围内一般是狭窄的, 只对少数几株流感病毒提供免疫力。广泛反应性单克隆抗体的分离和鉴定血凝素 (HA) 表明, 普遍流感疫苗的发展范围内可^达2, 3, 4,^5,6,7,8. 普遍流感疫苗的主要目标之一是对流感病毒的保守区域⁽⁹、¹⁰、^{11、12 )}产生强烈的抗体应答。^,13,14,15,16. 有广泛的反应性抗体识别这些保守的表位, 由中和和非中和抗体^17,18, 被证明需要 Fc FcγR 的相互作用, 以优化保护在体内并突出显示 Fc 介导的免疫对流感病毒的整体免疫应答的贡献^19,20。

保护的相关性对于评估感染的免疫力至关重要。这些指标允许科学家和临床医生评估疫苗的功效、数据的重要性和治疗过程。预防流感病毒感染的唯一确定的相关性是血凝抑制试验。1:40 的滴度与患病风险的50% 降低有关 (¹²¹ ), 并反映了抗体的存在, 通过靶向位于 HA 球状头的受体结合点来抑制凝集。然而, 也应该指出, T 细胞反应可能是更好的相关性预防流感病毒感染的老年人。有趣的是, 最近的一份报告表明, 神经氨酸酶抑制活性可能是更好的预测流感免疫的²²。幸运的是, 典型的体外检测方法, 如中和或神经氨酸酶抑制试验可以测量 HA 茎或神经氨酸酶特异抗体。然而, 大多数这些常规的体外化验只考虑抗体的抗原结合区的功能, 而不测量 Fc 区域的作用。此外, 未检测到通过 Fc 受体参与在体内中保护的非中和抗体的贡献^17,18。为了测量诱发 Fc 介导免疫的抗体所提供的保护, 如抗体依赖性细胞介导的毒性 (ADCC), 需要一个健壮的体外检测。

下面描述的方法评估小鼠单克隆抗体的能力, 通过使用基因修饰的 Jurkat 细胞系, 表达激活鼠型 1 FcR, FcγRIV, 诱导 Fc 介导的功能。抗体参与 FcγR transduces 细胞内信号, 触发核因子的活化 T 细胞介导的荧光素酶活性。该方法优于传统技术, 需要分离和培养原效应细胞, 使用流式细胞仪检测 Fc 介导的效应函数的激活^{19,23,24 ,25,26}。首先, 这里描述的协议可以很容易地被改编成包含不同病毒的目标, FcγRs 和不同物种 (人和小鼠) 的抗体。其次, 使用修饰的 Jurkat 细胞系表达 FcγR 与荧光素酶报告基因在活化 T 细胞 (NFAT) 核因子下, 允许一个大的格式分析, 可以很容易地用一个平板阅读器测量发光。在这里, 传统的激活的主要效应细胞被取代诱导 NFAT-荧光素酶的抗体接触 FcγR 表面上的 Jurkat 细胞。这96井板格式化验允许测量多达四个不同的样品在 triplicates 与七稀释-许多样品可能是繁琐的使用传统技术。另外还有一点需要考虑, 这可能会影响实验设计和数据的解释。病毒靶必须在细胞表面表达, 以便抗体识别。为了减轻这种情况, 目标抗原 (例如内部病毒蛋白) 可以直接涂在盘子的表面上。然而, 这还没有经过严格的测试。此外, 修改后的 Jurkat 细胞系只表达一种激活 FcγR 的类型, 不表达任何抑制 FcγRs, 而主细胞系表达所有受体在生理环境中。

我们以前用这种方法来证明多克隆语境中的表位特异性在调节 Fc 介导的效应函数方面起着关键作用, 而抗体依赖性细胞介导反应的最佳活化需要两点联系^27,28。在这里, 我们描述一个方法, 评估的能力, 茎特定单克隆抗体参与和激活小鼠激活 FcγRIV。尽管有异常^29、30, 但大量广泛的反应性抗体瞄准了血凝素的抗原保守的茎区, 从而在普遍流感的发展中起着重要作用。疫苗.

本手稿中所做的实验是按照伊坎医学院的《道德和法规规范》进行的。

1. 通过转染或感染来表达流感病毒血凝素

染:

1. 平板人胚胎肾脏 (HEK 293T) 细胞密度为 2 x 10⁴细胞/在白色组织培养中处理96井板, 让它在4个°C 孵化器 (与 37 CO_5%) 坐在 2 h。
2. 染细胞与 100 ng DNA 编码的病毒血凝素和 0.2 ul 的转染试剂每井在 50 ul 的总容量。
   注: 质粒和 transfectant 试剂均在1x 最小必需培养基中稀释, 降低血清培养基。
3. 在37个°C 孵化器中孵化出 5% CO₂为18小时的模板后, 删除转染介质。

2. 感染

1. 板 A549 或 Madin 达犬肾细胞密度为 2 x 10⁴细胞/以及在白色组织培养处理96井板和增长至少 18 h 在37个°C 孵化器与 5% CO₂。
2. 在37个°C 孵化器与 5% CO₂中, 在1x 的内存中稀释病毒并感染细胞, 其感染的多样性为3、1或 0.33, 1 h。总容积应等于 100 ul。
   注意: 10x 内存被水稀释, 使1x 内存工作库存用于上述病毒稀释.
3. 感染后, 取出接种, 并在没有胰蛋白酶的情况下加入 100 ul 1x 的记忆。
4. 在 5% CO₂的 37 °C 孵化器中, 将受感染的细胞增长18到24小时。

3. 通过单克隆抗体或血清评估 FcRg/NFAT 介导的荧光素酶活性的活化

1. 首先, 用25µL 的检测介质 (1x RPMI 1640 补充 4% (卷/卷) 低 IgG 胎牛血清) 取代转染或感染细胞的生长培养基。
2. 在一个单独的96井板, 执行四倍稀释的抗体的兴趣开始在30微克/毫升使用化验媒介。在 triplicates 中执行稀释, 并在图 1A中演示一个示例板布局。请确保包含一个不包括抗体 (无抗体控制) 和背景控制 (单独检测缓冲区) 的控件。
   注: 对于 "no 抗体" 和背景控制, 添加25µL 的检测缓冲器, 而不是抗体。
3. 将25级稀释抗体从步骤3.2 转移到转染细胞或受感染细胞的相应井上。
4. 孵育板在 37 °C 孵化器 (与 5% CO₂) 为15分钟。
5. 添加 25 ul 的适当修改效应 Jurkat 细胞表达小鼠 FcgRIV 或人类 FcgRIIIa (7.5万细胞/井)。每个井的总容积应为75µL, 抗体的起始最终浓度为10µg/毫升 (图 1B)。
   注意: 对于背景控制, 添加25µL 的检测缓冲区, 而不是效应细胞。为了检查抗体依赖性细胞介导的吞噬功能, 可以使用一种表达人 FcgRIIa 的修饰 Jurkat 细胞。
6. 孵化板在一个37°c 孵化器与 5% CO₂为 6 h。
7. 解冻和温暖的荧光素酶基板缓冲在 37 °C 水约1小时前使用。
   注: 为了使荧光素酶基板缓冲, 重建冻干荧光素酶测定基质在化验缓冲区提供。重构的基板缓冲区可存储在-30 °c 到-10 °c 上, 最多六周。
8. 添加 75 ul/井的荧光素酶基板缓冲除背景控制以外的所有水井。
9. 读一紫外线。
10. 用以下方程式计算褶皱感应: 折叠感应 = (诱发值-背景值)/(无单克隆值-背景值)。

我们证明, 一个茎特定的单克隆, 6F12, 但不是头部特异的单克隆, PY102, 能够激活主要的自然杀伤细胞植入 CD107a 和干扰素γ19。为了模拟茎特异性抗体激活原发性 NK 细胞的能力, 我们表明, 一个茎特异性的单克隆抗体, 6F12, 可以有力地激活修饰的 Jurkat 细胞, 表达小鼠 FcγRIV 14 倍。另一方面, 头部特定的单克隆抗体, PY102 和对照 IgG 不 (图 2)28。

为了调查感染的多样性 (Jurkat) 是否会影响表达小鼠 FcγRIV 的细胞的诱导, 我们感染 MDCK 细胞 X31 (重组流感病毒表达血凝素和神经氨酸酶/红 Kong/1/68 (H3N2)病毒与 A/波多黎各 Rico/8/34 (甲型h1n1 流感) 的内部段), 其教学语言为3、1或0.33。二十四小时后, Jurkat 细胞表达小鼠 FcγRIV 和单克隆9H10 被添加到受感染的 MDCK 细胞。在图 3中, 我们显示感染了3语言的细胞可以诱导3倍以上的发光, 而 MDCK 细胞感染了0.33 的语言。

图 1: 样本板布局和实验组组成示意图.(A) 每个抗体样本的起始浓度为10µg/毫升, 并在板上连续稀释 (1 列到12列) 4 倍。每个样品都是在 triplicates 中完成的。为 no 单克隆控件保留行 G, 行 H 为背景。(B) 每个实验组的最终体积, 然后再加入荧光素酶基板缓冲物75µL。值得注意的是, 样本和 ' no 单克隆组 ' 有25µL 的效应细胞增加, 而背景对照组有75µL 的化验媒介。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 通过茎单克隆抗体诱导修饰的 Jurkat 细胞表达 FcgR.A549 细胞感染了 A/波多黎各 Rico/8/34 (甲型h1n1 流感), 其教学语言为3。24小时后感染, 添加了小鼠 FcγRIV 表达 Jurkat 细胞与 PY102, 6F12 或 IgG 控制。用萤火虫荧光素酶在 NFAT 反应元素下产生的发光信号对 Jurkat 细胞的诱导进行评价。误差条 = 标准偏差。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: 感染的多样性会影响茎特异抗体的诱导.MDCK 细胞感染了 X31 (H3N2), 其教学语言为3、1或0.33。在 24 h 后感染, FcgR 表达 Jurkat 细胞结合 9H10 (开始稀释10µg/毫升) 添加。用萤火虫荧光素酶在 NFAT 反应元素下产生的发光信号对 Jurkat 细胞的诱导进行评价。误差条 = 标准偏差。请单击此处查看此图的较大版本.

作者声明没有利益冲突。