我们描述了一种用于检测靶向流感病毒血凝素的抗体激活Fc介导效应功能的方法。该检测方法也可经调整后用于评估靶向其他病毒表面糖蛋白的单克隆抗体或多克隆血清诱导Fc介导免疫应答的能力。
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摘要
摘要
抗体通过其抗原结合域和Fc区，在针对病毒病原体的先天免疫与适应性免疫应答的耦联中发挥关键作用。本文介绍如何利用经基因工程改造、表达激活型I型Fc-FcγR的Jurkat细胞系，检测靶向流感病毒血凝素的单克隆抗体对Fc效应功能的激活作用。通过该方法，可确定免疫球蛋白介导的特定Fc-FcγR相互作用的贡献。 体外 检测
引言
季节性流感疫苗所提供的免疫效果传统上通过血凝抑制（HI）试验进行评估1，该方法用于检测靶向血凝素受体结合位点的抗体。这些具有血凝抑制活性的抗体可提供完全免疫保护，但其保护范围通常较窄，仅对少数几种流感病毒株有效。分离并表征可识别血凝素（HA）的广谱反应性单克隆抗体，提示通用型流感疫苗的研发已接近实现。2,3,4,5,6,7,8通用流感疫苗的主要目标之一是诱导针对流感病毒保守区域的强效抗体反应9,10,11,12,13,14,15,16广泛反应性抗体，可识别这些由中和性与非中和性抗体组成的保守表位17,18，已被证明需要 Fc-FcγR 相互作用以实现最佳保护效果 体内 并强调 Fc 介导的免疫在流感病毒整体免疫应答中的作用19,20.
保护性相关因素在评估感染免疫中至关重要。这些指标使科学家和临床医生能够估算疫苗的有效性、数据的显著性以及治疗方案的走向。目前唯一确立的针对流感病毒感染的保护性相关指标是血凝抑制试验。抗体滴度为1:40时，与患病风险降低50%相关。1,21 ——反映了靶向HA球状头部受体结合位点、从而抑制凝集的抗体的存在。然而，也应注意，在老年人中，T细胞应答可能是流感病毒感染保护作用更佳的相关指标。有趣的是，最近有报道称，神经氨酸酶抑制活性可能是预测流感免疫力的更佳指标。22幸运的是，典型的 体外 中和试验或神经氨酸酶抑制试验等检测方法可测定针对HA茎部或神经氨酸酶特异性抗体。大多数这些传统方法 体外 然而，这些检测方法仅考虑抗体抗原结合区的功能，而未测量 Fc 区域的作用。此外，通过 Fc 受体结合发挥保护作用的非中和抗体的贡献 体内 未被检测到17,18为了测量由诱导Fc介导免疫（如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，ADCC）的抗体所提供的保护作用，需要一种可靠的 体外 需要进行检测。
以下所述方法通过使用经基因改造、表达激活型小鼠 I 型 Fc 受体 FcγRIV 的 Jurkat 细胞系，评估小鼠单克隆抗体诱导 Fc 介导功能的能力。抗体与 FcγR 的结合可转导细胞内信号，从而触发活化 T 细胞核因子（NFAT）介导的荧光素酶活性。该检测方法相较于传统技术具有多项优势，传统方法需分离和培养原代效应细胞，并使用流式细胞术检测 Fc 介导效应功能的激活19,23,24,25,26。首先，本文所述方案可轻松适用于不同病毒靶标、FcγR 以及来自不同物种（人源和小鼠）的抗体。其次，使用经改造的 Jurkat 细胞系，其表达的 FcγR 与受活化 T 细胞核因子（NFAT）启动子调控的荧光素酶报告基因相连，从而实现高通量检测，可通过测量发光强度的酶标仪轻松分析结果。在此方法中，传统原代效应细胞的激活被抗体与 Jurkat 细胞表面 FcγR 结合后诱导 NFAT-荧光素酶表达所替代。该 96 孔板检测格式可同时检测最多四种不同样本，每种设三个复孔，共七个稀释梯度——若采用传统技术，此类样本量将极为繁琐。此外，本检测中尚有若干需考虑的因素，可能影响实验设计与数据解读。病毒靶标必须在细胞表面表达，才能被抗体识别。为缓解此限制，可将靶抗原（例如 内部病毒蛋白）直接包被于培养板表面。然而，该方法尚未经过严格验证。另外，经改造的 Jurkat 细胞系仅表达一种激活型 FcγR，且不表达任何抑制型 FcγR，而原代细胞系则在生理条件下表达全部受体。
我们此前已利用该检测方法证明，在多克隆背景下，表位特异性在调控 Fc 介导的效应功能中起着关键作用，且抗体依赖性细胞介导的应答的最适激活需要两个结合位点27,28。本文中，我们描述了一种评估茎部特异性单克隆抗体结合并激活小鼠激活型 FcγRIV 能力的方法。尽管存在例外情况29,30，但大量广谱反应性抗体靶向血凝素抗原保守的茎部区域，因此在通用流感疫苗的开发中发挥着重要作用。
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方案
本手稿中进行的实验均遵循西奈山医学院的机构伦理准则和规定。
1. 通过转染或感染表达流感病毒血凝素
转染：
- 将人胚胎肾（HEK 293T）细胞以每孔 2 × 104 个细胞的密度接种于经组织培养处理的白色 96 孔板中，并在 37 °C 培养箱（含 5% CO2）中静置 4 小时。
- 每孔加入编码病毒血凝素的 100 ng DNA 和 0.2 μL 转染试剂，总体积为 50 μL，对细胞进行转染。
注意：质粒和转染试剂均用 1× Opti-最低必需培养基（MEM）减血清培养基稀释。 - 将培养板在 37 °C、含 5% CO2 的培养箱中孵育 18 小时后，移除转染培养基。
2. 感染
- 将 A549 细胞或 Madin Darby 犬肾细胞以每孔 2 × 104 个细胞的密度接种于经组织培养处理的白色 96 孔板中，并在 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养至少 18 小时。
- 用 1x MEM 稀释病毒，并在 37 °C、5% CO2 的培养箱中以感染复数（MOI）为 3、1 或 0.33 的条件感染细胞 1 小时。总体积应为 100 μL。
注意： 上述用于病毒稀释的 1x MEM 工作液是通过将 10x MEM 用水稀释制备而成。 - 感染后，移除接种液，并向每孔加入 100 μL 不含胰蛋白酶的 1x MEM。
- 将感染后的细胞在 37 °C、5% CO2 的培养箱中继续培养 18 至 24 小时。
3. 通过单克隆抗体或血清评估FcRg/NFAT介导的荧光素酶活性激活
- 首先，将转染或感染细胞的培养基更换为 25 µL 检测培养基（含 4% (vol/vol) 低 IgG 胎牛血清的 1x RPMI 1640）。
- 在另一个 96 孔板中，使用检测培养基将目标抗体从 30 μg/mL 开始进行四倍系列稀释。每种稀释液设三个复孔，示例板布局见图 1A。务必设置不含抗体的对照（无抗体对照）以及背景对照（仅检测缓冲液）。
注意：对于“无抗体”对照和背景对照，均加入 25 µL 检测缓冲液代替抗体。 - 将步骤 3.2 中系列稀释的抗体各 25 μL 转移至转染细胞或感染细胞板的相应孔中。
- 将板置于 37 °C 培养箱（含 5% CO2）中孵育 15 分钟。
- 每孔加入 25 μL 表达小鼠 FcgRIV 或人 FcgRIIIa 的改良效应 Jurkat 细胞（每孔 75,000 个细胞）。每孔总体积应为 75 µL，抗体的起始终浓度为 10 µg/mL（图 1B）。
注意：对于背景对照，加入 25 µL 检测缓冲液代替效应细胞。若需检测抗体依赖性细胞介导的吞噬作用，可使用表达人 FcgRIIa 的改良 Jurkat 细胞。 - 将板置于含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中孵育 6 小时。
- 使用前，在 37 °C 水浴中解冻并预热荧光素酶底物缓冲液约 1 小时。
注意：配制荧光素酶底物缓冲液时，将冻干的荧光素酶检测试剂溶解于所提供的检测缓冲液中。配制后的底物缓冲液可在 -30 °C 至 -10 °C 条件下保存最多六周。 - 除背景对照孔外，其余各孔均加入 75 μL/孔的荧光素酶底物缓冲液。
- 使用化学发光仪读数。
- 按以下公式计算诱导倍数：诱导倍数 = (诱导值 - 背景值) / (无单抗值 - 背景值)。
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结果
我们证明，一种针对茎部的单克隆抗体6F12（而非针对头部的单克隆抗体PY102）能够通过上调CD107a和干扰素γ来激活原代自然杀伤细胞19。为了模拟茎部特异性抗体激活原代人自然杀伤（NK）细胞的能力，我们显示，茎部特异性单克隆抗体6F12可强烈激活表达小鼠FcγRIV的改造型Jurkat细胞，激活程度约为对照的14倍。相比之下，头部特异性单克隆抗体PY102和对照IgG则无此激活作用（图2）28。
为了研究感染复数（MOI）是否会影响表达小鼠 FcγRIV 的 Jurkat 细胞的激活，我们将 MDCK 细胞以 MOI 为 3、1 或 0.33 的条件感染 X31 病毒（一种重配的甲型流感病毒，表达 A/Hong Kong/1/68 (H3N2) 病毒的血凝素和神经氨酸酶，以及 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 病毒的内部基因片段）。24 小时后，将表达小鼠 FcγRIV 的 Jurkat 细胞与单克隆抗体 ...
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讨论
本文所述方法可用于检测针对HA的单克隆抗体与小鼠FcγRIV结合的能力。靶抗原流感病毒血凝素在病毒感染或质粒DNA转染细胞后表达于细胞表面。该检测方法还可适用于将其他表面表达的病毒蛋白与不同的FcγR（人源或小鼠源）联合使用。此外，我们曾利用血清样本评估多克隆抗体诱导Fc效应功能的能力（数据未显示），这在研究感染或疫苗接种所诱导的适应性免疫应答时可能提供更具相关性的信息。我们还推测，可通过将可溶性蛋白直接包被于酶标板上，对该检测方法进行改进以测量识别病毒内部蛋白的抗体的诱导情况。然而，该方法尚未经过严格验证。
抗体依赖性效应功能的诱导可能受到多种因素的影响，包括但不限于效应细胞与靶细胞的比例（每孔加入的效应细胞数量）、所用抗体的浓度、效应细胞与靶细胞共孵育的时间，以及检测缓冲液中所用低IgG血清的浓度。
传统上，测量抗体或多种抗体血清的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性的标准检测方法涉及从供体采集的原代自然杀伤（NK）细胞。FcγR的结合及细胞内信号通路的激活通常通过检测活化标志物CD107a和/或IFN-γ的表达来...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本项目部分资金来自美国卫生与公共服务部、美国国立卫生研究院、国家过敏与传染病研究所的联邦基金，合同编号为CEIRS P01AI097092-04S1（P.E.L.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| A549 细胞 | ATCC | CCL-185 | 人肺腺癌肺泡基底上皮细胞 |
| HEK 293T 细胞 | ATCC | CRL-3216 | 人胚胎肾细胞 |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | 转染试剂 |
| 1X Opti-MEM 减血清培养基 | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
| 白色组织培养处理的 96 孔板 | Corning, Inc. | 3917 | 检测用板 |
| 10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 表达小鼠 FcgRIV 的 Jurkat 细胞 | Promega | M1201 | 试剂盒包含细胞、Bio-Glo 荧光素酶检测系统、1X RPMI 及低 IgG 血清 |
| 表达人 FcgRIIIa 的 Jurkat 细胞 | Promega | G7010 | 试剂盒包含细胞、Bio-Glo 荧光素酶检测系统、1X RPMI 及低 IgG 血清 |
| 表达人 FcgRIIa 的 Jurkat 细胞 | Promega | G9901 | 试剂盒包含细胞、Bio-Glo 荧光素酶检测系统、1X RPMI 及低 IgG 血清 |
| 荧光检测仪 | BioTek | Synergy H1 Multi-Mode reader | 发光板读数仪 |
| Bio-Glo 荧光素酶检测系统 | Promega | G7940 | 包含荧光素酶检测缓冲液和荧光素酶检测底物 |
| Madin Darby 犬肾细胞 | ATCC | CCL-34 | 犬肾细胞 |
参考文献
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