方法文章

粉扑诱导的全细胞电流在脑切片中的应用

DOI：

10.3791/56387

⸱

2017年10月12日

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1School of Psychology, South China Normal University, 2School of Life Sciences, South China Normal University, 3Brain Science Institute, South China Normal University, 4Center for Studies of Psychological Application, South China Normal University, 5Guangdong Key Laboratory of Mental Health and Cognitive Science, South China Normal University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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我们描述的粉扑技术, 其中的药理试剂可以在整个细胞膜片钳记录, 并突出了各方面的特点, 这是至关重要的成功。

摘要

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在脑切片中进行全细胞膜膜片钳记录时, 常用的是药理学管理方法。在电生理记录中, 药物应用的最佳方法之一是粉扑技术, 可用于研究药理试剂对脑切片神经元活动的影响。粉扑应用的最大优点是在记录部位周围的药物浓度迅速增加, 从而防止了膜受体的脱敏。粉扑应用的成功使用需要注意以下因素: 药物的浓度、粉扑微的参数、粉扑微的尖端与记录的神经元之间的距离、持续时间和压力驱动粉扑 (磅每平方英寸, psi)。本文介绍了一个 step-by 步骤的过程, 记录全细胞电流诱导的膨化γ-丁酸 (GABA) 的一个神经元的前额皮质切片。值得注意的是, 同样的程序可以适用于其他脑区, 如海马和纹状体, 以及不同的准备, 如细胞培养。

引言

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膜片钳技术是研究神经元电信号的主要工具, 在二十世纪七十年代1,2中得到了发展。这项技术的一个主要优点是它提供了有关特定治疗 (例如, 药理学) 如何能够实时改变神经元功能或通道的知识3。脑切片全细胞记录中神经元功能的药理学评价需要应用药物, 如激动剂或特定受体的拮抗药, 来记录神经元。此方法允许识别在应用特定药物后发生的神经元改变, 从而更好地理解神经元的生理和病理特性4。虽然药理学管理可以通过灌注5或粉扑6进行, 后者是优势技术。特别是: (i) 粉扑应用迅速增加了在记录的神经元周围的药物浓度到一个水平, 使膜受体的脱敏被阻止;(ii) 药物膨化量极低, 因此对沐浴液的影响不大, 因而减少了被管理的化学药品对脑切片的不良影响;(iii) 粉扑协议可以设定和保存, 使实验非常精确地重现;(iv) 粉扑的应用代表了激动剂/拮抗药的经济用途, 特别是在这种试剂昂贵或难以获得的情况下。

在这里, 我们将专注于记录在急性制备的脑切片中, 由 GABA 引起的全细胞电流, 这种制备具有相对保存完好的脑回路的优点。我们如何进行粉扑诱导的抑制电流7将在本文中介绍。通过使用铯 (Cs+) 的内部解决方案, 并持有 0 mV 的神经元, 我们将引入 GABA-粉扑诱发抑制突触后电流 (eIPSCs) 与适当的技术细节。应用脂多糖 (lps) 注射液诱发的小鼠抑郁症模型, 结果表明, 与汽车控制相比, lps 注射的小鼠 eIPSC 振幅明显降低.我们的意图是, 这篇文章应该显示如何粉扑技术是广泛适用于研究, 以评估的影响, 任何化学物质, 化合物或药物的神经元活动的脑切片。

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方案

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动物住房和所有动物实验都是按照华南师范大学动物研究伦理委员会批准的程序进行的, 根据国家研究所设立的动物保育指南。健康.

1. 准备解决方案

  1. 准备500毫升标准人工脑脊液 (ACSF), 其中包含我们发布的工作中所描述的组件 7 中列出的 表 1 。
    1. 使用干净的玻璃烧杯与去离子水, 准备一个新的 ACSF 解决方案。用去离子水和干前的清洁铲子添加氯化钠, 氯化钾, NaH 2 PO 4 , NaHCO 3 , MgSO 4 , d-葡萄糖, 并添加 CaCl 2 后冒泡的解决方案与 95% O 2 /5% CO 2 混合物为〜20分钟 (详见表 1) 到500毫升的去离子水。搅拌直到完全溶解.
    2. 确保 ACSF 完全清除, 无需任何降水。然后将 pH 值调整到 7.2-7.4。气泡的气体混合物由 95% O 2 和 5% CO 2 组成, 用于 ~ 20 min.
  2. 在 表 2 中描述了包含化学品的250毫升切片切割解决方案 7 。
    1. 添加氯化钾, 氯化镁 2 , NaH 2 PO 4 , NaHCO 3 , 胆碱和 #183; Cl, d-葡萄糖, 并添加 CaCl 2 最后, 如1.1.1 中所示, 到250毫升的去离子水和溶解, 在1.1.1 和1.1.2 中描述.
    2. 冒泡后 95% O 2 /5% CO 2 , 将解决方案放在冷冻库中15-20 分钟, 以便切割解决方案变得 ice-cold 和部分冻结.
      注意: 我们在1-2 月大的小鼠制作切片时使用这种切削液;该公式可能不同于2月以上的小鼠.
    3. 在无菌内毒素-游离等渗盐水 (0.9% 氯化钠) 中溶解, 制备 LPS 溶液。LPS 是管理腹腔 (0.5 毫克/千克), 并开始记录2小时后.

2。前额叶皮质切片的制备

  1. 从冰箱中取出切削液, 然后质, 以获得一层泥浆。以 95% O 2 /5% CO 2 将解决方案放在冰和气泡上。
  2. 使用大而锋利的剪刀, 快速斩首描述的鼠标 9 , 并立即将头放入一个充满 ice-cold (0-4 和 #176; C) 切割液的烧杯中.
  3. 用细剪刀把头骨的顶端沿中线 caudal-to-nasal, 去掉侧面的颅骨部分。用细刮刀取出大脑, 然后滴入 ice-cold 切割液中.
    注: 步骤 2.2-2.3 必须迅速完成 (理想情况下, #60; 1 分钟).
  4. 将大脑放在 9 cm 培养皿的盖子上, 装满冰块。用 ice-cold 切削液冲洗大脑。用刀片切断小脑和嗅球.
  5. 将氰胶水应用于 vibratome 的标本持有人。小心地将脑块放在胶水滴上, 侧一侧向上, 并立即浸入 ice-cold 切割液中.
  6. 将 vibratome 的刀片式服务器调整到15和 #176 的角度; 参照水平平面, 准备350和 #181; m 冠状脑切片 (叶片振动频率 = 85 赫兹, 速度 = 0.1 毫米/秒).
  7. 使用吸管, 将切片转移到充满 ACSF 的恢复腔中, 孵育1小时 (在 RT), 持续冒泡 95% O 2 /5% CO 2 。

3。全细胞贴片记录

  1. 根据拉拔器操作手册中的特定指南, 将玻璃硼硅 micropipettes 用作记录电极或粉扑 micropipettes。对于记录电极, 尖端电阻是在范围4-6 米和 #8486;, 而粉扑 micropipettes 有尖端直径的范围2-5 和 #181; M.
  2. 添加 Na + 通道拦截器 (TTX, 1 和 #181; M), 以阻止快速 Na + 和 #160; 通道和因此行动电位, ACSF 和保持这个解决方案的恒定流速2-3 毫升/分钟在记录室, 由蠕动泵入房间和愿望。气泡的 ACSF 与 95% O 2 /5% CO 2 不断确保切片的可行性.
  3. 使用改良的巴斯德吸管将脑切片转入记录室, 其尖端被切割以适合切片大小。用带有平行尼龙线的铂片锚片覆盖切片, #8805; 2 毫米分开, 以保持在平台上的切片.
  4. 用内部解决方案填充记录微 7 ( 表 3 ), 用 GABA 在10和 #181; m、50和 #181; m 和100和 #181; m (溶解于 ACSF), 或 ACSF 作为车辆控制.
  5. 为了防止碎片堵塞, 在将记录电极浸入 ACSF 中之前, 使用1毫升注射器应用光正压。使用显微镜下的微 (4x 物镜), 定位记录电极和粉扑微, 使提示出现在显示器的视频图像的中心 ( 图 1 a ).
  6. 调整显微镜焦距 (40x 物镜), 同时逐渐降低粉扑微, 并将其置于记录神经元的45和 #176 的角度;。保持微和20-40 和 #181 之间记录的神经元之间的距离; m ( 图 1 B )。慢慢地和小心地接近神经元与记录电极, 然后释放正压。通过连接到电极托架的油管上的微弱和短暂的吸力来制造一个千兆欧姆的密封.
  7. 保持0毫伏的电压。在千兆欧姆密封形成后, 手动或自动补偿快、慢的电容。然后应用一个简短的和强吸力通过上述油管进入全细胞模式.
  8. 在电压钳模式下记录 eIPSC。使用 Picospritzer 控制的低气体压力 (氮气, 4-6 psi) 到粉扑微采用主8电压步进发生器提供单或配对 GABA 粉扑 ( 图 2 ).
  9. 更改粉扑持续时间以获得最佳的 eIPSC 结果 ( 图 3 ) 并测量 LPS 诱发的抑郁症模型 ( 图 4 ) 中的 eIPSC.

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结果

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这种粉扑技术可以让研究人员研究药物对特定神经元表面特殊受体的影响。在这篇文章中, 我们关注的电流介导 GABA 受体。图 1显示了粉扑和记录 micropipettes。为了消除对 ACSF 和蔗糖泡芙 (图 2A) 所产生的物理压力的记录神经元的任何影响, 将其用作控件。gaba 粉扑 (黑色) 引起的反应可以被 gaba 受体抑制剂阻断, 如 picrotoxin 所报告的10, 而基线条件可以通过 ACSF 洗 (蓝色) 恢复, 如图 2B所示。值得注意的是, 无论是 ACSF 还是蔗糖粉扑都不能诱发反应, 这表明 gaba 泡芙引起的反应是生理性的, 是由位于记录细胞表面的 gaba 受体介导的。剂量和粉扑-持续时间响应曲线显示在图...

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讨论

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粉扑应用广泛用于评价突触后受体功能3,4,7, 但在每个实验中都需要精确的控制。我们在这里描述了一个涉及全细胞贴片钳夹的过程, 它显示了 GABA-粉扑诱导的前额皮质脑切片中的干细胞 (即 eIPSCs)。记录电极的电阻约为5ω, 而粉扑 micropipettes 的尖端直径约为2-5 µm. 粉扑压力介于 4-6 psi 之间: 这一范围是至关重要的, 因为较高的压力可能导致神经元损伤, 而较低的压力会导致后突触后 GABA 受体激活不足。从粉扑微到神经元的水平距离约为20-40 µm (1-2 神经元的直径), 微与切片表面之间的夹角约45°。粉扑微的尖端是垂直20-40 µm 以上的切片 (z-axis)。粉扑持续时间应在10-150 毫秒. 在上述情况下, 10-50 µM 氨基丁酸的喷吹诱导了适当的神经元反应, 得到的 eIPSC 振幅和动力学参数是可重现的。虽然这里描述的协议重点在粉扑应用到一个切片补丁, 它也适合在神经元文化的记录, 如...

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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作者希望感谢以下组织: 中国国家自然科学基金 (31171018, 31171355), 广东省自然科学基金 (2013KJCX0054), 广东科学与技术部 (2014A030313418、2014A030313440) 和广州科技局 (201607010320)。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
硼硅酸盐玻璃微量移液器快门仪器BF150-86-101.50 mm 外径;0.86 mm 内径
微量移液器 拉拔器 快门仪器型号 P-97 Flaming/Brow 微量移液器拉拔器
显微作器Shutter InstrumentsMP-285
计算机控制放大器   Molecular DevicesMulticlamp 700B
数字采集系统 Molecular DevicesDigidata 1440A
成像相机尼康 2115001检测设备
显微镜 尼康 Eclipse FN1 
大师 8A.M.P.I.Master-8 脉冲刺激器
振动切片机LeicaVT 1000S
剃须刀片吉列74-S飞鹰
视频监视器松下WV-BM 1410
502 胶水熟食7146氰基丙烯酸酯胶
蠕动泵上海佳鹏公司BT100-1F
摄像机Olympus America MedicalOLY-150
Transfer PipetsBiologix30-0138A1
店

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  2. Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).
  3. Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).
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  9. Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J Vis Exp. (117), (2016).
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