我们介绍了喷射给药技术，该技术可在全细胞膜片钳记录过程中施加药理学试剂，并重点阐述了确保该技术成功实施的各项关键特性。
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本文内容
摘要
摘要
在脑片中进行全细胞膜片钳记录时，通常需要使用药理学给药方法。电生理记录过程中，最佳的药物施加方法之一是喷射法（puff technique），该方法可用于研究药理学试剂对脑片中神经元活动的影响。喷射给药的最大优势在于，记录位点周围的药物浓度能够迅速升高，从而避免细胞膜受体发生脱敏。成功实施喷射给药需仔细控制以下几个关键因素：药物浓度、喷射微管的参数、喷射微管尖端与被记录神经元之间的距离，以及喷射的持续时间与驱动压力（单位为磅每平方英寸，psi）。本文介绍了一种逐步操作流程，用于记录在前额叶皮层脑片神经元上喷施γ-氨基丁酸（GABA）所诱导的全细胞电流。值得注意的是，该方法经过少量修改后，也可适用于其他脑区（如海马和纹状体）以及不同类型的样本，例如细胞培养物。
引言
膜片钳技术是研究神经元电活动的主要工具，于20世纪70年代开发1,2。该技术的一个主要优势在于，它能够实时揭示特定处理（例如药理学干预）如何改变神经元功能或离子通道3。在脑切片全细胞记录过程中进行神经元功能的药理学评估时，需要将药物（如特定受体的激动剂或拮抗剂）施加于被记录的神经元。该方法可识别特定药物作用后发生的神经元变化，从而加深对神经元生理与病理特性的理解4。尽管药物给药可通过灌流5或喷射6方式进行，但后者是更优的技术。具体而言：（i）喷射给药可迅速提高被记录神经元周围药物浓度至足够水平，从而避免膜受体发生脱敏；（ii）喷射药物体积极小，对浴液影响甚微，因而可显著减少所用化学物质对脑切片产生的不良效应；（iii）喷射程序可预先设定并保存，使实验具有高度可重复性；（iv）喷射给药可经济地使用激动剂/拮抗剂，尤其适用于价格昂贵或难以获得的试剂。
本文将重点介绍在急性制备的脑片中，通过喷吹 GABA 诱导全细胞电流的记录方法。这种制备方法的优势在于脑内神经环路相对保存较好。本文将详细描述如何开展喷吹诱导的抑制性电流7记录。通过使用基于铯离子（Cs+）的细胞内液，并将神经元钳制在 0 mV，我们将详细介绍 GABA 喷吹诱发的兴奋性抑制性突触后电流（eIPSCs）及其适当的技术细节。利用脂多糖（LPS）注射诱导的抑郁小鼠模型8，我们发现，与对照组相比，LPS 注射小鼠脑片中 GABA 喷吹诱发的 eIPSC 振幅显著降低。本文旨在说明，喷吹技术可广泛应用于评估任何化学物质、化合物或药物对脑片中神经元活动影响的研究。
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方案
动物饲养和所有动物实验均依照华南师范大学动物研究伦理委员会批准的程序进行，并遵循美国国立卫生研究院制定的《动物护理指南》。
1. 溶液的配制
- 根据已发表文献7中列出的成分，配制 500 mL 标准人工脑脊液（ACSF），具体见表 1。
- 使用洁净的玻璃烧杯和去离子水新鲜配制 ACSF 溶液。用去离子水清洗药匙并干燥后，依次向 500 mL 去离子水中加入 NaCl、KCl、NaH2PO4、NaHCO3、MgSO4、D-葡萄糖，并在用 95% O2 / 5% CO2 混合气体预充气约 20 分钟后（如表 1 所述）再加入 CaCl2。持续搅拌至完全溶解。
- 确保 ACSF 溶液完全澄清，无任何沉淀。调节 pH 至 7.2–7.4，并用 95% O2 和 5% CO2 的混合气体持续充气约 20 分钟。
- 根据表 2中所述化学成分7，配制 250 mL 切片用切割液。
- 向 250 mL 去离子水中加入 KCl、MgCl2、NaH2PO4、NaHCO3、胆碱·Cl、D-葡萄糖，并按 1.1.1 步骤所述最后加入 CaCl2，溶解方法同 1.1.1 和 1.1.2 所述。
- 用 95% O2/5% CO2 混合气体充气后，将溶液置于冰箱中冷冻 15–20 分钟，使切割液达到冰冻低温并部分结冰。
注意：我们使用该切割液对 1–2 月龄小鼠进行脑片制备；对于超过 2 月龄的小鼠，配方可能有所不同。 - 将 LPS 溶解于无菌无内毒素的等渗盐水（0.9% NaCl）中，配制成 LPS 溶液。通过腹腔注射给予 LPS（0.5 mg/kg），2 小时后开始记录。
2. 前额叶皮层切片的制备
- 从冷冻箱中取出切割液，混匀至呈泥状。将溶液置于冰上，并持续用95% O2/5% CO2气体饱和。
- 使用大型锋利剪刀，按照文献9所述方法迅速将小鼠断头，立即将头部放入盛有冰冻（0–4°C）切割液的烧杯中。
- 用精细剪刀沿中线从尾侧向鼻侧方向剪开颅骨顶部，并移除颅骨两侧部分。用精细刮勺取出脑组织，立即投入冰冻切割液中。
注意：步骤2.2–2.3必须迅速完成（理想情况下<1分钟）。 - 将脑组织置于盛有冰块的9 cm培养皿盖上。用冰冻切割液冲洗脑组织，然后用刀片切除小脑和嗅球。
- 在振动切片机的样品台表面涂抹氰基丙烯酸酯胶水。小心地将脑组织块放置在胶滴上，确保头端朝上，随后立即浸入冰冻切割液中。
- 调节振动切片机的刀片夹持器，使其与水平面成15°角，并制备350 µm厚的冠状脑切片（刀片振动频率 = 85 Hz，切片速度 = 0.1 mm/s）。
- 用移液器将切片转移至盛有人工脑脊液（ACSF）的恢复室中，在室温下孵育1小时，并持续用95% O2/5% CO2气体饱和。
3. 全细胞膜片钳记录
- 根据拉制仪操作手册中的具体指南，制备用于记录电极或喷吹微电极的玻璃硼硅酸盐微电极。记录电极的尖端电阻范围为4–6 MΩ，喷吹微电极的尖端直径范围为2–5 µm。
- 加入 Na+ 通道阻滞剂（TTX，1 µM），用于阻断快速Na⁺通道+ 通道，从而记录动作电位。使用蠕动泵将人工脑脊液（ACSF）以2-3 mL/min的恒定流速持续灌注记录室，并同时吸出废液。用95% O₂2/5% CO₂2 持续确保切片的活性。
- 使用经过改造的巴斯德移液管将脑片转移至记录室，该移液管的细端已被剪裁至适合脑片大小。用铂金制脑片固定锚覆盖脑片，锚上带有平行的尼龙丝，间距≥2 mm，以将脑片固定在平台上。
- 用内液填充记录电极微吸管7 (表3），并用10 µM、50 µM和100 µM GABA（溶于ACSF）或ACSF作为溶剂对照填充喷射微电极。
- 为防止杂质堵塞，在将记录电极浸入ACSF之前，使用1 mL注射器施加轻微正压。在显微镜（4倍物镜）下借助显微操作器，调整记录电极和喷吹微管的位置，使它们的尖端出现在显示器视频图像的中心图1A).
- 调节显微镜焦距（40倍物镜），同时逐渐降低喷流微电极，以45°角将其置于记录神经元上方。保持喷流微电极尖端与记录神经元之间的距离在20–40 µm范围内。图1B）。缓慢而小心地将记录电极靠近神经元，然后释放正压。通过连接电极 holder 的管路施加轻微且短暂的负压，以形成吉欧姆封接。
- 将电压维持在 0 mV。形成千兆欧封接后，手动或自动补偿快速和慢速电容。随后通过上述管道施加短暂而强烈的负压，以进入全细胞记录模式。
- 在电压钳模式下记录eIPSC。使用由Master 8电压步进发生器控制的Picospritzer，向喷吹微管施加低气体压力（氮气，4–6 psi），以递送单次或成对的GABA喷吹（图2).
- 调整吹入持续时间以获得最佳的eIPSC结果（图3）并在脂多糖（LPS）诱导的抑郁模型中记录兴奋性突触后电流（eIPSC） 图4).
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结果
加压给药技术可使研究人员研究药物对特定神经元表面特定受体的作用。本文重点研究由GABA受体介导的电流。图1展示了加压给药微电极和记录微电极。为消除加压过程本身所产生的物理压力对记录神经元的影响，使用人工脑脊液（ACSF）和蔗糖加压作为对照（图2A）。GABA加压（黑色）所诱导的反应可被GABA受体抑制剂（如蟾毒精）所阻断，如文献10所述；而通过ACSF冲洗可恢复至基线水平（蓝色），如图2B所示。值得注意的是，ACSF或蔗糖加压均不引发任何反应，表明GABA加压所诱导的反应具有生理意义，并由记录细胞表面的GABA受体介导。剂量与加压持续时间-反应曲线见图3。
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讨论
喷射给药法被广泛用于评估突触后受体功能3,4,7，但每次实验都需要精确控制。本文描述了一种结合全细胞膜片钳技术的操作流程，用于在前额叶皮层脑切片中演示GABA喷射诱导的抑制性突触后电流（即eIPSCs）。记录电极的电阻约为5 MΩ，而喷射微管尖端直径约为2–5 µm。喷射压力应控制在4–6 psi之间：此范围至关重要，压力过高可能导致神经元损伤，而压力过低则可能导致突触后GABA受体激活不足。喷射微管尖端与被记录神经元之间的水平距离约为20–40 µm（相当于1–2个神经元的直径），喷射微管与切片表面的夹角约为45°。喷射微管尖端在垂直方向上位于切片上方20–40 µm（z轴方向）。喷射持续时间应在10–150 ms范围内。在上述条件下，使用10–50 µM GABA进行喷射可引发适当的神经元反应，所获得的eIPSC振幅及动力学参数具有良好的可重复性。尽管本文所述方案主要针对脑切片中的喷射给药，但也适用于神经元培养物的记录，如我们已发表的研究工作所示<...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢以下机构的支持：国家自然科学基金委员会（31171018，31171355）、广东省科学技术厅（2013KJCX0054）、广东省自然科学基金（2014A030313418，2014A030313440）以及广州市科学技术局（201607010320）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 玻璃硼硅酸盐微量移液管 | Shutter Instruments | BF150-86-10 | 外径 1.50 mm；内径 0.86 mm |
| 微量移液管拉制仪 | Shutter Instruments | MODEL P-97 | Flaming/Brown 微量移液管拉制仪 |
| 显微操作器 | Shutter Instruments | MP-285 | |
| 计算机控制放大器 | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| 数字采集系统 | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| 成像相机 | Nikon | 2115001 | 检测设备 |
| 显微镜 | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Master 8 | A.M.P.I. | Master-8 脉冲刺激器 | |
| 振动切片机 | Leica | VT 1000S | |
| 剃须刀片 | Gillette | 74-S | FLYING EAGLE |
| 视频监视器 | Panasonic | WV-BM 1410 | |
| 502 胶水 | Deli | 7146 | 氰基丙烯酸酯胶 |
| 蠕动泵 | 上海佳鹏科技有限公司 | BT100-1F | |
| 视频摄像机 | Olympus America Medical | OLY-150 | |
| 移液管 | Biologix | 30-0138A1 |
参考文献
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- Lee, J., et al. Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons. Mol Brain. 5, 33(2012).
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- Chen, M., et al. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. Elife. 6, (2017).
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重印与许可
