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使用共聚焦显微镜观察巨噬细胞外陷阱

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DOI：

10.3791/56459

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2017年10月19日

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1Monash Lung and Sleep, Monash Medical Centre, 2Monash University

本文内容

摘要

巨噬细胞胞外诱捕网是一种新近描述的结构。本文将重点介绍共聚焦显微镜技术及其可视化方法 体外 和 体内 来自肺组织样本。

摘要

定义中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）存在的一种主要方法是共聚焦显微镜技术。我们对已建立的共聚焦显微镜方法进行了改进，以用于可视化巨噬细胞胞外诱捕网（METs）。这些胞外诱捕网的特征是存在胞外染色质，并共表达其他组分，如颗粒蛋白酶、瓜氨酸化组蛋白和肽基精氨酸脱亚氨酶（PAD）。METs的表达通常在细胞经刺激后进行检测，并与未刺激样本进行比较。实验中还包含背景对照和同型对照样本。细胞通过明确定义的图像分析软件进行分析。共聚焦显微镜可用于检测METs的存在，既可用于体外实验，也可用于体内样本分析。 体外 和 体内 在肺组织中。

引言

中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps, NETs）最初由 Brinkmann et al.1 描述。它们主要在感染（尤其是细菌感染）刺激下产生，在宿主防御中发挥重要作用1,2。此外，NETs 也被报道可在非感染性疾病中形成，包括血管炎和系统性红斑狼疮（SLE），以及在佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA）这一有丝分裂原的刺激下产生2,3。近年来人们认识到，其他类型的细胞也可能产生胞外诱捕网，例如巨噬细胞。然而，巨噬细胞胞外诱捕网（macrophage extracellular traps, METs）在现有文献中尚未被明确定义4,5。我们近期已建立了在体外（in vitro）和体内（in vivo）检测 METs 的方法6,7。本文将描述利用共聚焦显微镜检测 METs 的实验方法。

NETosis 区别于其他细胞通路（如凋亡8）的关键特征包括染色质的释放，并伴随以下三个特征：（1）组蛋白瓜氨酸化（H3Cit）9，（2）颗粒蛋白酶的共表达10，以及（3）肽基精氨酸脱亚胺酶（PAD）4 的参与11,12。巨噬细胞同样表达 H3Cit、颗粒蛋白酶和 PAD，这些特征可用于界定 METs 的存在。

微囊泡（METs）在肺部可能具有特别重要的作用，因为肺泡和气道中主要存在的细胞是巨噬细胞，而巨噬细胞在启动针对感染或炎症的细胞免疫反应中起首要作用。此外，尽管肺部大部分区域为空腔（例如，肺泡内部），METs 能够向可用空间扩展，这与实体器官形成对比。

目前定义中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）存在的最常用方法是共聚焦显微镜技术。目前尚无明确定义的方法用于检测巨噬细胞胞外诱捕网（METs）。本方案中已将检测NETs的技术改进并用于检测METs的存在。该方法的主要要求是能够使用共聚焦显微镜以及配备适当的图像分析软件。

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方案

本方案遵循以下批准的实验：（1）由莫纳什医疗中心伦理委员会批准的人类实验；（2）由墨尔本大学伦理委员会批准的动物实验。

1. 支气管肺泡灌洗（BAL）巨噬细胞

  1. 通过以下方法获取肺泡灌洗液（BAL）中的肺巨噬细胞：(1) 通过支气管镜检查从人体受试者获取6；(2) 通过气管内抽吸法从小鼠获取13。
    注意：巨噬细胞的获取通常会导致这些细胞发生一定程度的活化。巨噬细胞来源于因疑似医学问题而需接受支气管镜检查的患者，并非所有受试者均适用于METs分析（需根据各个独立项目具体确定）。
    1. 取BAL溶液，离心（500 × g，10分钟）形成细胞沉淀，用培养基（含5%胎牛血清和1% L-谷氨酰胺的RPMI培养基）在室温下洗涤两次，然后将细胞重悬于4 mL培养基中。
    2. 如有需要，可申请进行正式的细胞分类计数；大多数细胞（通常>80%）为巨噬细胞6。
      注意：该步骤通常由临床组织学服务部门通过观察不同类型细胞的形态学特征完成6。
    3. 使用台盼蓝排斥法和血细胞计数板对BAL溶液中的巨噬细胞进行活细胞计数。
      注意：BAL溶液如步骤1.1所述，来源于人和小鼠。
    4. 将1 - 4 × 105个巨噬细胞加入含500 µL培养基的24孔板中的盖玻片上，于37°C孵育过夜；细胞将贴附于盖玻片。对于人源样本，需添加抗生素（例如，青霉素和链霉素，104 U/mL），以防止细菌污染。

2. 支气管肺泡灌洗液巨噬细胞的免疫荧光标记/显微镜检测

注意：细胞已如上所述贴附于盖玻片上。

  1. 移除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次。用含2%多聚甲醛/高碘酸/赖氨酸（PLP）的固定液固定细胞10分钟。
  2. 用PBS短暂洗涤细胞，然后在含0.2% Tween 20的PBS中透化处理20分钟。
  3. 用含10%鸡血清和5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液封闭细胞，室温孵育30分钟。
  4. 加入一抗及同型对照抗体，室温下孵育1小时，稀释比例为1:100（更详细信息见材料表），或在37 °C进行孵育。
    注意：对于支气管肺泡灌洗（BAL）样本，通常无需使用巨噬细胞特异性标记物。
  5. 加入一抗后，用PBS洗涤细胞，再与相应的二抗在室温下孵育40分钟。
  6. 用PBS洗涤样本，然后使用含DAPI的封片剂封片，通过共聚焦显微镜（如上所述）在405、488、561和647 nm激光激发下，使用40倍、1.0 NA油镜进行观察。

3. 肺组织样本

注意：对于肺组织的体内研究，应在相关暴露后研究样本（例如，如 O'Sullivan 等7所述）。本实验最相关的暴露为传染性微生物，尤其是细菌。可用于本方法的小鼠品系包括 C57BL/6 或 BALB/c 小鼠，年龄 10 - 12 周，体重 25 - 30 g，雄性。

  1. 通过腹腔注射氯胺酮（400 mg/kg）和赛拉嗪（40 mg/kg）处死小鼠。使用手术镊和剪刀打开胸腔，暴露肺和心脏。
    1. 使用21号针头将温热的PBS经右心室灌注30秒以冲洗血管中的血液，随后将10 mL 2% PLP固定液经右心室灌注30秒。
    2. 用温热的PBS（42 °C）冲洗开放的胸腔。使用21号针头和一段裁剪合适的0.8 mm导管对气管进行插管，并注入800 µL预热至42 °C的3%低熔点琼脂糖溶液。
    3. 用编织丝线（4.0 USP）结扎气管。将丝线环绕气管，在套管插入点稍下方打一个简单的单结固定。为使琼脂糖凝固，将冰冷的PBS施加于肺周围。使用剪刀和钝性分离技术将肺和心脏整体从胸腔中取出。分别取出每侧肺组织，随后在4 °C条件下用2% PLP或福尔马林固定16小时。
    4. 将标本保存在4 °C的PBS中，直至进行组织切片。上述获取肺组织的方法此前已有描述13。
  2. 按照以下步骤准备肺组织样本。
    1. 将步骤3.1中切除的肺组织在10%中性缓冲福尔马林中固定24小时（室温）。转移至75%乙醇，并放入组织处理机中进行12小时循环处理（75%乙醇中2.5小时，无水乙醇中3小时，溶剂3B中3.5小时，石蜡中3小时）。
    2. 将组织包埋于标准石蜡中，制成福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织块，并在室温下保存。
      注：在此阶段，通常可方便地将肺组织切片用于常规载玻片制备。
    3. 使用切片机将FFPE肺组织切成4–5 µm厚度的切片，并如O'Sullivan et al.7此前所述，将切片贴附于带电荷的涂层载玻片上。
    4. 进行封片时，在60 mm × 24 mm盖玻片（1.5号）上滴加3滴封片介质，将载玻片倒置在盖玻片上并挤出多余介质。用指甲油密封边缘，于室温保存。

4. 肺组织样本的制备/显微观察

  1. 对FFPE肺组织样本进行脱蜡、复水，并用抗原修复液进行预处理。
    1. 将FFPE切片在60 °C下烘烤60分钟。然后将切片放入二甲苯溶液中30分钟，转移至70%乙醇溶液中室温孵育5分钟。用自来水冲洗。
    2. 用耐热塑料膜包裹，在压力锅中使用 10 mmol/L Tris、1 mmol/L EDTA，pH 9.0 溶液进行 HIER 抗原修复，加热 10 分钟。室温冷却 20 分钟。在摇床上用自来水洗涤两次，每次 5 分钟，再在摇床上用 PBS 洗涤一次。
    3. 用含10%鸡血清的5% BSA/PBS溶液在室温下封闭30分钟。
  2. 对组织进行染色。
    1. 为了定义巨噬细胞中的METs，在4 °C条件下，将一抗（MMP-9、H3Cit和F4/80）以1/100稀释度溶于1% BSA/PBS中孵育16小时（有关抗体用量的具体信息列于 材料表用PBS在摇床上洗涤两次，每次5分钟。
    2. 在室温下，用含1% BSA的PBS缓冲液稀释的相应二抗孵育40分钟，实现荧光检测。所用抗体为：（1）鸡抗小鼠488（绿色），（2）鸡抗山羊594（红色），（3）驴抗小鼠647（远红）。
    3. 用 PBS 清洗切片，然后使用含 DAPI 的封片剂封片，以进行染色质染色。
  3. 使用安装在倒置显微镜上的共聚焦激光扫描头获取荧光图像。
    1. 使用405、488、561和647 nm激光激发样本。点击逐行扫描并调平按钮（2次行平均），以20X物镜采集单层512 × 512像素的图像。 0.1 数值孔径空气和 40倍 1.0 NA 油浸物镜
    2. 每个切片至少获取十个视野进行分析，并为每个结果提供相应数据即对照组10个高倍视野（HFOV），刺激样本组10个高倍视野 等等。，每只小鼠。
      注意：为了获得整个视野的代表性样本，可采用矩阵系统，即将视野划分为不同的区域，并对每个不同样本使用相同的矩阵来选择视野。例如，该区域可分为9个部分，并从中心和4个角各采集两个HFOV。

5. METs 的三维（3-D）成像

注意：由于 METs 是三维结构，通过获取多个 z 轴层析图像并进行重建，可能提供有价值的信息。

  1. 使用振动切片机从石蜡包埋块中切取肺组织样本，设置振幅为1.8 mm，切片速度为0.1–0.5 mm/s，切片厚度为200 µm。
  2. 用相应血清（10%胎牛血清和10%鸡血清）的20%溶液封闭肺组织，随后在含有3.75% Triton-X 100的PBS中于室温下轻柔振荡透化7小时。
  3. 将切片置于微量离心管中，加入200 µL体积的相关一抗（MMP-9、H3Cit 和 F4/80），于4 °C孵育16小时（抗体浓度详见材料表）。
  4. 用PBS清洗切片，每次10分钟，共清洗3次，然后在室温下与相应的二抗孵育1小时。
  5. 将肺组织切片在DAPI溶液（1:5,000）中染色20分钟，随后将盖玻片加盖至含PBS的显微镜载玻片上。
  6. 使用配备405 nm、440 nm、473 nm、543 nm和635 nm激光器的倒置共聚焦显微镜（40x 1.3 NA）获取荧光图像。
  7. 使用40x 1.3 NA油镜，以最优z轴步进采集厚度为0.54 µm的三维z轴层扫图像。
    注：所用软件因显微镜型号而异。在补充文件1中提供了某一显微镜软件操作示例。

6. 图像分析

注意：样本分析需要使用特定的成像分析软件，相关示例列在材料表中。虽然结果分析将取决于所使用的具体程序，但以下列出的要点至关重要。

  1. 支气管肺泡灌洗样本分析
    1. 通过选择DAPI的蓝色通道并设定细胞的最小尺寸来确定巨噬细胞的数量（例如, > 直径为18 µm。使用相应软件，测量每视野中巨噬细胞的总数。
    2. 通过DAPI检测到的细胞外染色质，并结合其他标志物的共表达，计数具有MET特征的细胞数量例如MMP12、PAD2 和 H3Cit。
      注意：可分析的标记物数量取决于可用激光器的数量，但理想情况下除DAPI外，还应至少包括另外两种标记物。其他关于MET表达的特异性较低的参数（例如，具有细胞外染色质和核增大的细胞数量）可用于评估。
    3. 为比较支气管肺泡灌洗（BAL）样本中MET的表达水平（对照组、烟雾暴露组及烟雾暴露/DNase处理组之间），每份样本需分析至少100个BAL巨噬细胞。
    4. 为了测量荧光的二抗及同型对照水平；每个样本至少测量100个细胞的荧光强度。测定每种标记物的背景荧光平均水平例如，H3Cit）使用标准软件进行分析。
    5. 为定义MET表达，计数具有典型表型的细胞（例如，共表达 H3Cit 和 MMP9 的细胞外染色质）并对每个 MET 测量标记物的荧光强度水平（例如，H3Cit 和 MMP9）。如果细胞产生 METs 的染色信号未高于背景值且与同型对照无差异，则排除这些细胞。
    6. 对于人BAL样本，每个样本至少分析100个细胞，以确定形成METs的巨噬细胞百分比。对于小鼠样本，由于细胞较小且METs较难界定，应分析每个样本中更多的细胞数量。例如，200个巨噬细胞。
  2. 肺组织样本分析
    1. 为确定肺组织中 METs 的存在，可使用 F4/80 等特异性巨噬细胞标记物。
    2. 通过检测表达细胞外染色质且共定位F4/80的细胞与其他参数（如6.1节所列）来确定肺组织中METs的存在。
    3. 测定仅使用二抗和同型对照的样本中的背景荧光水平。排除未超过背景水平的METs进行分析。

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结果

可通过支气管肺泡灌洗（BAL）样本、肺组织以及较厚的肺组织切片中的三维图像观察到髓系细胞外陷阱（METs）。图1展示了在BAL样本中观察到的METs示例。METs的形态会因其成熟阶段的不同而有所变化。显微镜下最早可观察到的特征是细胞核向细胞边缘移动。随后出现细胞外染色质，以及共同表达的其他介质，如H3Cit和颗粒蛋白酶。在早期阶段，细胞仍大致保持球形，并表达出细胞外陷阱结构；而在后期阶段，MET的形成则表现为细胞体的伸长。

肺组织的METs如图2所示。当肺组织被液体充盈以显示其结构时，METs通常会被推至肺泡壁上。METs的形态也会因组织切片平面的不同而有所差异。肺组织样本的标准切片厚度为4-5 µm。较厚的组织切片可进行多张图像采集，从而实现METs的三维观察。抗体在肺组织中的渗透深度有限，因此25-50 µm的切片厚度最为理想。<...

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讨论

本综述中所述方法基于用于确定中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）存在的方法14肺泡灌洗液样本中，巨噬细胞迄今为止是占主导地位的细胞类型，该采集方法特别适用于研究巨噬细胞外陷阱（METs）。若肺泡灌洗液中存在红细胞，应使用氯化铵裂解这些细胞。肺泡灌洗操作通常会激活巨噬细胞，因此在未刺激的样本中也预期会有METs的存在。肺泡灌洗巨噬细胞通常具有很强的贴壁性。由于这类细胞占主导地位且可通过形态学特征加以区分，一般无需使用特异性标记物进行识别。通常情况下，肺泡灌洗液中超过80%的细胞为巨噬细胞（中性粒细胞比例低于5%），经过多次洗涤后，一般仅剩贴壁的白细胞即，巨噬细胞）保持6如果对人类样本中巨噬细胞与中性粒细胞的区分存在疑问，可使用中性粒细胞标志物（如中性粒细胞弹性蛋白酶）进行鉴别。在肺组织中，可使用特异性巨噬细胞标志物（例如，F4/80）是必需的，因为巨噬细胞难以与其他细胞类型区分。巨噬细胞具有自发荧光，因此使用背景对照和同型对照非常重要；对于经刺激的样本尤其如此。

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披露

作者就本研究无任何披露事项。

致谢

本工作由蒙纳士大学、国家健康与医学研究理事会以及蒙纳士肺与睡眠研究所的资助项目支持。作者感谢莫纳什医疗中心临床免疫学部门的工作人员，以及朱迪·卡拉汉（Judy Callaghan）、亚历克斯·富尔彻（Alex Fulcher）、克尔斯滕·埃尔加斯（Kirstin Elgass）和 Camden Lo（莫纳什显微成像中心，MMI）在共聚焦显微成像方面提供的帮助，并感谢蒙纳士大学MMI设施的支持。作者同时感谢蒙纳士组织学平台提供的设施及其在科学与技术方面的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
人源样本：一抗
兔抗人 H3Cit（瓜氨酸 R26）AbcamAB510310 µg/mL
兔抗人 MMP12Novus BiologicalNB110-572141:100 浓度无法量化
小鼠抗人 MMP9Novus BiologicalAB1199061:200 腹水，未提供浓度
兔抗人 PADI2/PAD2AbcamAB164787 µg/mL
小鼠抗人 PADI4/PAD4AbcamAB12808610.1 µg/mL
羊抗人中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）LifeSpan BioscienceLS-B424425 µg/mL
名称公司货号备注
小鼠样本：一抗
山羊抗小鼠 MMP9AbcamAF90910 µg/mL
兔抗小鼠 H3Cit（瓜氨酸 R26）AbcamAB510310 µg/mL
大鼠抗小鼠 F4/80本实验室（杂交瘤）本实验室20 µg/mL
羊抗人 Anti-HNE /NESapphire BioscienceLS-B424425 µg/mL
小鼠抗人 ­­­­PADI4/PAD4AbcamAB12808610.1 µg/mL
Super-frost plus 载玻片MenzelS41104A
Dapi-prolong goldMolecular probesP36931
吐温-100（Triton-X 100）Sigma-Aldrich85111
氯化铵Sigma-AldrichE9434
名称公司货号备注
二抗
鸡抗兔 AF 488Life technologiesA-21441
鸡抗兔 AF 594Life technologiesA-21442
鸡抗山羊 AF 594Life technologiesa-21468
鸡抗小鼠 AF488Life technologiesA-21200
驴抗羊 AF 594Life technologiesA-11018
鸡抗小鼠 AF 647Life technologiesA-21463
驴抗羊 AF 594Life technologiesA-11016
同型对照
兔 IgG本实验室
兔 IgG本实验室
小鼠 IgG1BD Bioscience550878
兔 IgG本实验室
小鼠 IgG2aBioLegend400201
羊 IgG本实验室
名称公司货号备注
软件程序
ImarisBitplane
Image JNIH
荧光强度平均值可使用 Microsoft Excel 等标准办公软件进行计算
名称公司货号备注
显微镜
C1 共聚焦扫描显微镜Nikon
FV1200 共聚焦扫描显微镜Olympus
名称公司货号备注
组织来源
来自莫纳什医疗中心（Monash Medical Centre）支气管镜检查室的人支气管肺泡灌洗（BAL）样本
来自墨尔本大学药理学系的小鼠 BAL 样本及肺组织
名称公司货号备注
培养基
RPMISigma-Aldrichr8758
胎牛血清Sigma-AldrichF0926
L-谷氨酰胺Sigma-AldrichG7513
名称公司货号备注
其他试剂
苏丹黑Sigma-Aldrich199664
多聚甲醛/高碘酸/赖氨酸（PLP）固定液Sigma-Aldrich27387
二甲苯Sigma-Aldrich214736
氯胺酮Sigma-AldrichK2753
天然甲醛Sigma-Aldrich42904
石蜡Sigma-Aldrich327204
琼脂糖Sigma-AldrichA2576
溶剂 3BHi-Chem2026
盖玻片 12 mmSigma-AldrichS1815
盖玻片 60 × 24 mmSigma-AldrichC6875
名称公司货号备注
小鼠品系
C57 黑色 6莫纳什动物研究平台（Monash animal research platform, MARP）
BALB/cMARP

参考文献

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