我们介绍了一种使用两种不同荧光染料的体内成像方法，用于追踪成年Sprague-Dawley大鼠脊髓挫伤后脊髓血管的动态变化。
本文内容
摘要
摘要
脊髓损伤（SCI）在损伤部位引起显著的血管破坏。血管病理变化在SCI后立即发生，并持续贯穿急性损伤期。事实上，在挫伤性SCI后，内皮细胞似乎是最早死亡的细胞。早期的血管事件，包括血脊髓屏障（BSCB）通透性增加，可诱导血管源性水肿，并通过复杂的损伤机制促成有害的继发性损伤事件。因此，靶向血管破坏可能是减轻继发性损伤级联反应的关键策略，从而缓解SCI后的组织学和功能障碍。以往的研究大多基于死后样本，无法捕捉血管网络的动态变化。在本研究中，我们开发了一种 在体 一种双色双光子成像方法用于监测挫伤性脊髓损伤后急性血管动态变化。该方法可在同一动物损伤前后，对多个位点的血流、血管直径及其他血管病理变化进行检测。总体而言，该方法为研究血管动态提供了优良的技术平台。
引言
创伤性脊髓损伤（SCI）是一种常见的损伤，可导致运动、感觉和自主功能障碍。根据2016年国家脊髓损伤统计中心（NSCISC）的数据，约有28.2万人受到影响，其中69%主要由交通事故或跌倒引起1。这些患者通常需要重症监护；然而，目前尚无有效的治疗方法。因此，迫切需要开发针对SCI的新有效策略。
脊髓损伤（SCI）主要分为两个阶段：原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤包括造成损伤部位出血性坏死的物理性损害2，随后发生一系列继发性损伤事件，例如炎症反应、细胞凋亡以及残留轴突的脱髓鞘，这些过程逐步导致形态和功能缺陷的扩大3,4,5,6。出血是损伤后最早出现的可见征象，提示在脊髓损伤急性期即发生了血管结构的立即破坏7,8。旨在减轻早期血管损伤的神经保护策略可能改善患者的恢复情况，但这需要对损伤后早期血管事件的病理生理机制有更深入的理解。
尽管以往研究已采用多种方法来研究脊髓血管系统，但仍存在显著局限性。其中最常见的缺点是仅能研究死后样本，例如氢清除法9、自显影术10、微血管造影8、血管腐蚀铸型11以及免疫组织化学12,13。虽然激光多普勒血流仪可无创地实时监测脊髓血流14，但无法区分不同血管系统，也不能检测血管形态学变化。动态对比增强磁共振成像（DCE-MRI）同样具有无创性，但所获得的图像分辨率较低，且需要昂贵的设备支持15。
尽管利用双光子激光扫描显微镜（2P-LSM）进行体内成像已被用于研究大脑皮层的血管动力学16,17,18，但目前仅有少量研究揭示了脊髓损伤（SCI）后血管的变化。Tang 等人曾在半横断模型中报道了损伤灶边缘血流的变化19，但在挫伤性损伤后进行成像面临更大的挑战，原因有二：第一，传统的玻璃光学窗无法承受损伤部位的机械冲击，难以在损伤后保持结构完整并用于成像；第二，由于出血导致示踪剂渗漏至实质组织，使损伤后的成像变得困难。
本文介绍了一种新颖的双色成像方法，可对同一血管个体在损伤前和损伤后的时间点进行成像。此外，该方法能够提供脊髓挫伤后血管动态变化的时间-空间特征。该技术还具备在多个损伤后时间点进行成像的潜力。本方案可直接应用于转基因动物，以研究神经血管相互作用。
方案
所有外科手术和动物操作均依照《实验动物护理与使用指南》（美国国家研究委员会）以及印第安纳大学医学院机构动物护理与使用委员会指南的规定批准后进行。
1. 手术准备
- 对所有手术器械（包括脊柱稳定器）进行灭菌处理。使用70%乙醇清洁手术台及周围所有区域。 为准备非存活性手术操作，将一块洁净的手术垫放置在37 °C加热垫上方。
- 本研究使用六周龄的Sprague Dawley（SD）大鼠 。通过腹腔注射给予氯胺酮（87.7 mg/kg）和赛拉嗪（12.3 mg/kg）混合物进行麻醉，并记录体重。当动物对脚趾夹捏刺激不再产生反应时，确认已达到适当的麻醉阶段。术前皮下注射0.01–0.05 mg/kg丁丙诺啡和5 mg/kg卡洛芬。
- 在两个区域对大鼠进行剃毛：背部的颈椎区域和胸部侧的颈部区域。使用聚维酮碘外科擦洗剂和70%酒精棉片擦拭皮肤。涂抹眼膏以防止手术期间角膜干燥。将动物仰卧位放置于洁净的手术垫上。
2. 颈外静脉插管
- 通过在锁骨附近寻找搏动点来定位颈外静脉，并使用小型弹簧剪在该位置做垂直切口，该位置是三个解剖标志的交汇点：右下颌支尾侧、肱骨大结节和胸骨柄（图1A）。使用弹簧剪和精细镊子分离血管，并用一根无菌外科缝线结扎远端（图1C）20。
- 准备一支1 mL注射器，内含生理盐水，并连接由21号针头制成的专用导管（图1B）。用显微剪在血管上做一个小切口，将导管插入血管。
- 通过结扎近端和远端固定针头（图1C）。该专用导管由21号针头制成，将针尖磨平，并与另一根21号针头截取的2 mm尖端焊接在一起，以防止导管滑出。
注意： 少量血液流入针头表明针头已成功进入血管。
- 通过结扎近端和远端固定针头（图1C）。该专用导管由21号针头制成，将针尖磨平，并与另一根21号针头截取的2 mm尖端焊接在一起，以防止导管滑出。
3. 脊柱固定与C5-C7椎板切除术
- 将动物置于俯卧位。使用15号手术刀片在目标脊髓节段沿中线切开皮肤。从5th 至 7th 双侧颈椎（C5-C7）以暴露侧方关节突图2A)21.
注意： 通过寻找肩胛骨之间的棘突来定位第二胸椎（T2）。从T2椎骨向上计数，以确定第七颈椎（C7）的位置。21,22,23,24. - 使用改良的固定装置稳定大鼠脊柱。在侧方椎骨两侧各做一个切口。将不锈钢臂滑入暴露的横突关节面下方，并拧紧螺钉以确保稳定性。图 2B).
- 仔细切除 C5-C7 椎板（椎板切除术， 图2C).
- 将一小块浸有生理盐水的明胶海绵置于暴露的硬脑膜上，以保持其湿润（图 2D).
4. 双光子（2P）成像窗的安装
- 将明胶海绵小块填入肌肉与椎骨之间的缝隙中，同时在脊髓与椎骨之间填入一条细长的明胶海绵，然后使用组织粘合胶封闭周围肌肉与骨骼区域。等待5分钟以确保完全干燥（图2E）。
注意：此步骤可有效防止后续出血进入成像窗口以及浸没液泄漏。 - 使用去离子水（ddH2O）在微波炉中配制4%琼脂溶液。待琼脂完全溶解后，冷却至可触碰温度。用1 mL无菌注射器吸取琼脂溶液，并沿窗口边缘挤出形成一圈围堰（图2E）。该溶液迅速凝固，但仍保持一定柔韧性，允许镜头或物镜自由移动。
- 准备成像时，移除明胶海绵，并在窗口内加入浸没液以进行双光子（2P）成像（图2F）。将固定好的动物转移至双光子显微镜的暗室中，使2P成像窗口正对物镜下方，小心地将物镜缓慢下降至成像窗口内。
5. 第一种荧光染料的注射及基线成像
- 准备 0.5 mL 罗丹明 B 异硫氰酸盐-葡聚糖（4 mg/mL，平均分子量约 70 kDa）的生理盐水溶液。用无菌 1-mL 注射器吸取该溶液，并将其连接至先前植入的导管。
注意：建议在使用前配制荧光染料溶液。 - 通过缓慢推动注射器注入第一种染料（图 3B）。首先使用目镜确定感兴趣区域。使用电荷耦合器件（CCD）相机在较低放大倍数下获取表面血管模式的明场图像，作为定位参考图像。切换至激光扫描模式，然后打开双光子（2P）成像软件，用于采集图像和线扫描数据。
- 根据所成像组织中使用的荧光探针，选择合适的双光子（2P）激光激发波长、功率和荧光通道（第一种染料使用红色通道），然后进行 in vivo 成像（图 3E）。在整个过程中将动物置于加热垫上。
6. 使用 LISA 设备进行 C7 节段挫伤损伤
- 使用路易斯维尔损伤系统装置（Louisville Injury System Apparatus, LISA）按照先前建立的方案对C7节段进行中线挫伤25,26。
- 简言之，在校准后将动物放置于LISA装置的平台上。选择零点设置并调整组织位移（本实验中为0.800 mm），然后点击软件中的 "Run Experiment" 按钮以触发撞击器释放，造成损伤。
- 损伤后，在暴露的硬脑膜上方再放置一小块浸有生理盐水的明胶海绵，以保持其湿润。
- 重复步骤4.3，并对先前注射红色染料后可见的同一区域重新进行 in vivo 成像（图3C &F）。
- 将动物转移回手术台，并根据IACUC-IUSM方案使用适当的麻醉剂维持其镇静状态。
7. 第二种荧光染料的注射及损伤后成像
- 配制 0.5 mL 荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖（4 mg/mL，平均分子量约 70 kDa）生理盐水溶液，配制方法同 5.1 节。将溶液装入 1 mL 无菌注射器中，并连接至先前安装的导管。
- 将状态稳定的动物重新放回双光子显微镜暗室中，使用红色通道对第一种染料、绿色通道对第二种染料，重新成像同一区域（图 3D & G）。
- 成像结束后，解除大鼠的脊柱固定装置，并清洁琼脂壁。
8. 动物安乐死
- 成像后，按照经心脏灌注方案处死大鼠27。收集脊髓样本并将其固定在4% PFA中。
9. 离线数据分析：血管直径的量化
- 将图像文件传输至工作站以进行离线分析。
- 打开 ImageJ，选择 "file"，然后选择之前保存的原始数据并打开相应的单个图像文件（图 4B）。
- 通过选择 "Analyze"，然后选择 "Set Scale" 来校准图像（图 4C）。在 "Distance in pixels" 中输入的数值由 图 4A 中所示的公式计算得出。双光子光学镜头的校准决定了该公式中的默认值。"opticalZoom" 的数值可在与单个图像文件关联的 Excel 可扩展标记语言文件（XML 文件）中找到（图 4B）。
- 绘制一条垂直于血管长轴的直线（图 4D1 & E1），然后选择 "Analyze"，接着选择 "Measure"。血管直径的测量结果将显示在结果窗口中（图 4D2 & E2）。在血管上重复测量三次，以获得平均值。
10. 离线数据分析：红细胞（RBC）流速的定量分析
- 将线扫描文件传输至工作站以进行分析。
- 启动 ImageJ 软件，选择"文件"，然后选择之前保存的原始数据，并打开所有扩展名为".ome"的关联线扫描文件。
- 打开"图像"，选择"堆栈"，然后选择"图像转为堆栈"。将所有 OME 文件转换为单个图像堆栈 TIFF 文件。
- 启动 Matlab 软件，点击"打开"，选择"LSPIV_parallel.m"代码文件。注意：LS-PIV 的 Matlab 代码可在 https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18 下载
- 依次选择以下操作："运行">"更改文件夹">"动脉"。选择在10.3中生成的图像堆栈 TIFF 文件。
- 输入"Y"，然后按回车键。
- 分别在图像的左侧和右侧放置光标，程序将开始处理数据。
- 程序结束后，输入两个值以计算最终结果："像素-米转换值"和"扫描时间转换值"。这两个值均可在与线扫描数据相关的 XML 文件中找到。最终结果以毫米每秒（mm/s）为单位的速度均值和标准差表示。
结果
该方法能够监测 体内 脊髓损伤前后个体血管的动态脊柱血管变化。首先，通过外颈静脉置入导管，以便后续注射荧光染料（图1A- C, 图3）。在第二步中，使用一种专用装置来稳定暴露的C5-C7（图1D- F, 图2A- B）。此稳定步骤可消除呼吸伪影并提供稳定的成像效果。在椎板切除术之后（图2C），下一步是在C5-C7节段上方安装双光子成像窗（图2D- F). 尽量减少脊髓成像窗口周围外周组织的出血对于成功的血管成像至关重要。下一步是通过上述导管注射罗丹明-葡聚糖荧光染料（Red），以标记并绘制血管网络作为基线图 3A- B, E）。在C7节段中线处造成中度严重程度的挫伤后，在预定的损伤后时间点注入FITC-葡聚糖（绿色）图3A & D）。双色法的优点在于，当第一种染料因组织损伤而渗入实质组织时，仍可使用第二种染料检测血管结构。图3G).
在成像过程中，建议将动物置于加热垫上，以在麻醉诱导后维持其核心体温。
利用我们的双色法，可测量并计算单个血管的直径和红细胞流速（RBC velocity）。对于直径测量，可在校准后使用ImageJ在最大直径处对血管进行3次重复测量（图4）。对于流速测量，使用Matlab程序（MATLAB R2013a）分析线扫描图像以计算红细胞流速（图5）18。根据形态学特征、血流速度和血管直径，可将血管分为两类：动脉和静脉（见表1）。
图1颈静脉插管与脊柱固定
（A） 定位颈外静脉的示意图。 (B由21号针头制成的专用导管。针尖被磨平，并焊接上另一根21号针头截取的2毫米针尖部分。 (C) 导管插入示意图。首先结扎远端，随后固定近端导管，最后将针头与血管一同结扎固定（血管结扎，蓝色箭头）。 (D) 改良后脊柱稳定器的图像。C5-C7节段在椎板切除术前的手术窗 (E) 脊髓切除术后及挫伤性脊髓损伤后 (F) 显示。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图2．光学窗口安装步骤示意图。
（A） 步骤1：沿中线切开皮肤和肌肉，暴露椎骨。（B） 步骤2：固定脊柱。（C） 步骤3：椎板切除术。（D） 步骤4：放置浸有生理盐水的明胶海绵，以保持脊髓湿润。（E） 步骤5：用无菌明胶海绵和Vetbond封闭缝隙。干燥后，在窗口边缘构建一层琼脂糖壁。（F） 步骤6：准备成像时，移除明胶海绵，并在双光子成像窗口内加入浸没液。请点击此处查看该图的放大版本。
图3。该 体内 双色法分步操作流程。
整个过程包括5个步骤 （A）在完成步骤1和步骤2后，使用一对分子量约为70 KDa的葡聚糖示踪剂 依次注射以标记脊髓血管系统 (B 和 C) 以及挫伤性脊髓损伤（SCI）后 (D). (E)-(G) 代表性双光子图像显示了从步骤3到步骤5的脊髓血管结构。白色箭头指示第一波红色染料渗漏区域F 和 G），青色箭头显示第二波绿色染料泄漏 (G)比例尺 = 50 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4脊柱血管直径的获取与量化
制备完成后，在双光子显微镜下采集单个图像文件，同时获取包含校准值的XML文件 （B）. （A） 该方程展示了基于光学变倍值计算“每微米像素数”的方法。在 ImageJ 中完成校准后 (C)，沿纵轴方向在3个点测量血管直径 (D1) 以及之后 (E1) 损伤 (D2) 和 (E2) 显示测量值。 (F) 基线及损伤后30分钟血管直径的量化 比例尺 = 50 µm数据以均值 ± 标准差表示，***p<0.0001，双尾配对 t 检验。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 5．脊髓血管血流速度的采集与定量分析。
在双光子显微镜下获取线扫描图像文件，用于计算单个血管的血流速度。（A） 选定血管的示例及评估血管内红细胞速度的方法。（B） 动脉线扫描图像及其对应的速度计算曲线图示例，以及静脉的示例 （C）。请点击此处查看该图的放大版本。
| 动脉 | 静脉 | |
| 形态 | 笔直、光滑、管壁较厚 | 有分支、边缘粗糙 |
| 血流速度 | 快 | 慢但存在变化 |
| 直径 | 30-80 µm | 100-250 µm |
表1：血管类型鉴定标准
讨论
脊髓损伤后血管研究的一个挑战是技术上的局限性，因为传统技术主要局限于对死后样本中血管结构变化的观察。这种新型方法 体内 上述成像方法利用双光子激光扫描显微镜（2P-LSM）在活体大鼠中实现对血流及相关参数（如流速和血管直径）的动态测量。该方法还允许在挫伤性脊髓损伤（SCI）后的不同时间点对同一组血管进行重复观察。以往的双光子显微成像技术由于单一示踪剂的渗漏，无法清晰捕捉创伤后的血管结构。本研究采用的双色标记设计实现了对创伤模型的动态血管成像。此外，该方法具有良好的灵活性，可为SCI后急性期血管变化提供时空动态特征图谱。
我们的实验中有多个关键步骤 在 活体双色成像方法。首先，在进行延时成像之前，确保脊髓的物理稳定性至关重要，特别是要减少由呼吸引起的运动伪影。我们设计了脊柱夹具的形状，使其在固定过程中轻微抬高脊椎的高度，从而显著降低脊髓随动物呼吸所产生的运动（图1D- F, 2B）。建议在每次成像开始前检查脊髓的稳定性。如果脊髓未能达到稳定状态，应调整脊髓夹的位置和紧固程度。其次，周围组织（骨骼、肌肉层和皮肤）在成像窗口内出血可能污染视野。为确保成像过程顺利，应使用明胶海绵（gelfoam）和组织粘合胶对周围组织进行处理，以有效防止出血。第三，我们选用的荧光染料分子大小与白蛋白（66 kDa）相似，后者是血液中主要的高分子量血浆蛋白。在稳态条件下，这些染料与白蛋白类似，主要保留在血管内部。28损伤后，染料穿过受损的内皮结构渗入实质组织，导致血管周围区域荧光强度显著增强（图3F- G此外，我们选择颈外静脉插管有两个原因。第一，它可以在实验的任何时间提供稳定且易于接近的给药途径。第二，它可作为未来治疗性注射的给药途径。
尽管我们的体内双色方法能够为创伤性血管成像研究提供一种新颖的途径，但该技术仍存在一些需要注意的局限性。目前，该技术旨在评估两个时间点的血管变化（基线和伤后一个时间点），但如果具备更多的荧光染料和检测通道，则可扩展至多个时间点。尽管已有若干研究采用植入式玻璃窗进行慢性活体成像，但这些研究均无法在创伤损伤后对同一血管提供其基线信息19,29,30,31,32。与这些研究不同，我们的窗口为无玻璃窗口。这种方法便于损伤前后成像，但在长期观察中重新建立窗口可能具有挑战性。我们未来的研究将致力于慢性成像技术的改进。血管系统由多种类型的血管（动脉、静脉和毛细血管）组成，它们在形态和功能上各不相同。在成像过程中区分不同类型的血管，有助于明确血管变化的规律。上述方案依赖观察者根据形态和血流速度来识别血管类型；然而，可轻松添加一种动脉特异性染料，以更明确地区分不同类型的血管33。
该技术不仅可用于评估挫伤及其他创伤模型（如挤压伤和辐射损伤），还可用于研究血脊髓屏障（BSCB）破坏以及血管通透性的变化。除了脊髓损伤（SCI）外，该技术还可用于研究其他神经退行性疾病（如肌萎缩侧索硬化症（ALS）和多发性硬化症（MS））后发生的血管变化。此外，该技术可应用于转基因动物模型，以研究神经血管之间的动态相互作用。作为一种强大的筛选工具，未来的研究可利用本文所述的成像技术来评估脊髓损伤治疗方案的有效性。
总之， 体内 双色法是一种可靠、实时的 体内 评估动态血管变化的有效工具，适用于脊髓损伤（SCI）后时空血管特征的表征以及减轻继发性损伤的治疗方案筛选。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）NS059622、NS073636、美国国防部CDMRP W81XWH-12-1-0562、美国退伍军人事务部杰出研究奖I01 BX002356、克雷格·H·尼尔森基金会296749、印第安纳州脊髓与脑损伤研究基金会（ISCBIRF）（印第安纳州卫生部019919）以及玛丽·赫尔曼·乔治捐赠基金的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 普渡产品倍他碘手术擦洗剂 | 菲舍尔科技 | 19-027132 | 皮肤消毒 |
| 氯胺酮（87.7 mg/kg）/赛拉嗪（12.3 mg/kg） | 帕特森兽医 | 07-881-9413, 07-890-5745 | 麻醉剂 |
| 丁丙诺啡（0.03 mg/mL） | 帕特森兽医 | 07-891-9756 | 镇痛剂 |
| 卡洛芬 | 帕特森兽医 | 07-844-7425 | 非甾体抗炎药 |
| 杜卡尔纱布海绵 | 菲舍尔科技 | 22-415-490 | 皮肤消毒 |
| Decon 无水乙醇（200 proof） | 菲舍尔科技 | 04-355-450 | 皮肤消毒 |
| 人工泪液眼膏 | 韦伯斯特兽医 | 07-870-5261 | 防止眼睛干燥 |
| 棉签 | 菲舍尔科技 | 1006015 | |
| 罗丹明B异硫氰酸酯–葡聚糖 | 西格玛-奥德里奇 | R9379 | 平均分子量 70kDa |
| 异硫氰酸荧光素–葡聚糖 | 西格玛-奥德里奇 | 46945 | 平均分子量 70kDa |
| 器械灭菌器 | 精细科学工具 | 18000-50 | 用于手术器械灭菌 |
| 脊柱稳定器套装 | 由诺顿神经科学研究所定制生产 | 详情请联系 Y. Ping Zhang。 (yipingzhang50@gmail.com) | |
| 兽用粘合剂 Vetbond | 3M 动物护理产品 | 1469SB | 组织粘合胶 |
| 明胶海绵（Gelfoam） | 亨利·谢恩 | 9083300 | 止血 |
| Noyes 弹簧剪刀 | F.S.T | 15013-12 | |
| 精细镊子 - Dumont #5 | F.S.T | 11254-20 | |
| 咬骨钳 | 精细科学工具 | 16021-14 | 椎板切除术 |
| 外科牵开器 | 精细科学工具 | 17005-04 | |
| 手术刀 | 精细科学工具 | 10003-12 | 皮肤切口 |
| 手术刀片 #15 | Royal-Tek | BS2982 | 皮肤切口 |
| 微型弯头剪刀 | 世界精密仪器 | 500260 | 可来自任意供应商 |
| 3-0 Vicryl 缝线 | 爱惜康 | J393H | 可来自任意供应商 |
| 黑色编织非吸收性丝线，3-0，C-7，反向切割，18" | LOOK | 786 | 可来自任意供应商 |
| 1 ml 注射器 | Henke Sass Wolf | 4010.200.V0 | 可来自任意供应商 |
| 21 号针头 | BD | 305165 | 可来自任意供应商 |
| 琼脂 | 西格玛-奥德里奇 | A1296 | 可来自任意供应商 |
| 双光子激光扫描显微镜 | Bruker 荧光显微镜 | ||
| LISA 装置 | 由诺顿神经科学研究所定制生产 | 详情请联系 Y. Ping Zhang。 (yipingzhang50@gmail.com) | |
| 多聚甲醛 | 西格玛-奥德里奇 | 158127 | |
| HCImage Live | 滨松公司 | 成像软件 | |
| PrairieView | Prairie Technologies/Bruker | 双光子成像软件 | |
| ImageJ | 图像分析软件 | ||
| Matlab 统计工具箱 | The MathWorks, Inc. | https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle | 图像分析软件 |
参考文献
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