利用保持植株在顶空环境中的静态密闭箱法评估稻田甲烷和氧化亚氮通量

摘要

本实验方案的总体目标是利用静态密闭箱法测定稻田的温室气体排放。由于稻田中存在持续的水层，且箱体内含有植物，因此测量系统需要进行特定调整。

摘要

本方案描述了利用静态密闭箱法测定稻田土壤温室气体（GHG）排放的方法。该方法基于扩散理论。在特定时间段内，将覆盖在确定面积土壤上方的已知体积空气用长方体形罩（称为"箱体"）密闭。在此密闭期间，气体（甲烷（CH₄）和氧化亚氮（N₂O））会沿着自然浓度梯度，从土壤孔隙空气（靠近其微生物来源处，即产甲烷菌、硝化菌、反硝化菌）扩散至箱体顶空。随后，通过在密闭期间以固定时间间隔采集顶空气体样品，并利用气相色谱法进行分析，从而估算气体通量。在现有的多种温室气体测定技术中，静态密闭箱法适用于小区试验，因其不需要大面积均一处理的土壤区域。此外，该方法资源需求较低，易于操作，尤其在结合温室气体驱动因子测量时，能够揭示生态系统属性、过程与通量之间的关系。然而，与微气象法相比，该方法虽仅造成轻微但不可避免的土壤扰动，且时间分辨率相对较低。方法实施的关键环节包括：i）箱体设计与布设；ii）样品处理与分析；iii）通量估算。在稻田中成功应用该技术，需针对作物生长周期中大部分时间处于淹水状态的特点，以及在测量期间箱体顶空内水稻植株的管理进行相应调整。因此，相较于非淹水农田土壤的常规应用，还需额外考虑以下两个方面：i）配备防止任何非预期水体扰动的装置，以避免通量高估；ii）将水稻植株纳入箱体顶空，以充分考虑通过通气组织运输所排放的气体。

引言

农业是一个生产部门，与林业及其他土地利用方式一起，产生了约21%的全球温室气体排放¹准确测量农业土壤温室气体排放量，不仅对正确认识农业生态系统在气候变化中作为排放源和碳汇的双重作用至关重要²，还能在《巴黎协定》目标框架内制定适当且有效的减缓策略。

农业土壤产生的两种最重要温室气体的排放通量（即，N₂O 和 CH₄可通过微气象学方法或密闭箱法进行测量³在过去三十年中，绝大多数报告土壤温室气体排放数据的研究均采用了密闭箱法。^4,5 于1926年首次被描述⁶已有多项努力致力于优化该技术，并消除所有实验假象和偏差的来源。^{7,8,9,10,11,12,13,14}特定方案在不同时间汇编而成，旨在标准化相关方法学^{15,16,17,18,19}，目前仍在进行科学研究，以建立该技术的最佳应用实践并尽量减少通量估算中的偏差。

静态密闭箱法是一种基于扩散理论的技术，本文描述了其在稻田土壤中的应用。该方法通过将已知体积的空气密闭在部分土壤表面之上一段精确的时间来实现测量。在密闭期间，CH₄ 和 N₂O 分子沿着自然浓度梯度通过扩散作用，从土壤孔隙空气中（分别由产甲烷菌产生 CH₄，硝化菌和反硝化菌产生 N₂O）迁移至密闭箱的顶空部分，迁移路径可能经过淹水层或植物通气组织。两种气体在箱体顶空中的浓度随时间逐渐升高，通过测定这种浓度的增加情况，即可估算气体通量。

在研究地块尺度的温室气体通量时，相对于微气象学方法，密闭箱法通常更适用于不同的土地利用类型和生态系统，因为它不受大面积均质区域²或高昂的后勤与投资成本²⁰的限制。此外，该方法允许同时分析经过人为操控的实验，例如不同的农艺措施或其他田间处理^12,21。最后，该技术有助于识别生态系统属性、过程与通量之间的关系。然而，该方法也存在两个主要缺点：一是对空间和时间异质性的探测效率相对较低，二是箱体布设引起的土壤扰动效应²²。但这些问题至少在一定程度上可通过以下方式部分克服：优化箱体设计（以最小化土壤扰动）、设置足够数量的重复（以探究空间变异性），以及采用自动化系统以提高每日测量频率（以反映昼夜变化）或进行定时（每天相同时段）测量（以消除温度对残余变异的影响）。

该方法首次应用于稻田可追溯至20世纪80年代初²³，与旱地田间应用相比，其主要特点在于土壤表面存在淹水层，以及在密闭箱测量过程中需要将植物纳入顶空空间。本文详细指出，第一个特点意味着必须采用特定装置，以防止测量过程中对水体造成扰动，避免因湍流增强气体在淹水层中的扩散而高估通量。第二个关键特点是需考虑甲烷通过水稻通气组织的传输，这部分贡献了高达90%的CH₄排放量²⁴，因此在测量过程中必须使用适当的装置将植物纳入测量系统。

方案

1. 反应室设计

1. 将每个腔室由三个主要部件组装而成：一个锚定件、一个盖子和至少四个延伸件。
2. 制作一个由不锈钢制成的锚固装置，其外形为长75 cm、宽36 cm、高25 cm（长×宽×高）的长方体。在锚固装置顶部矩形边缘焊接一个可注水的通道，通道宽度为10–13 mm，高度为13–20 mm。在锚固装置四个侧面的顶部注水通道下方5 cm处，各钻两个直径为1 cm的孔。
   注意：锚固装置可隔离测定室下方的土柱，防止侧向扩散。通道的设计有助于锚固装置与顶盖之间形成有效密封。孔洞可确保在野外排水过程中，测定室内积水迅速排出。
3. 用不锈钢制作一个矩形箱体结构的盖子，尺寸为75 cm × 36 cm × 20 cm（长×宽×高），内部容积为54 L。确保其与可注水通道完全贴合。
4. 用一层4厘米厚的闭孔泡沫覆盖盖子，泡沫表面再覆盖一层具有反光性（类似铝质）的涂层。
   注意：必须为腔室配备温度控制系统，以避免因关闭腔室期间温度意外升高而人为促进微生物活性。
5. 为每个盖子配备一个通风阀，该阀由一段弯曲的塑料管（直径 × 长度：1.5 cm × 24 cm）制成，其尺寸需根据培养室体积和风力条件进行调整²⁵. 在盖子两个36厘米侧边面之一的中心钻一个1.5厘米的孔，将通气阀连接到盖子上，然后使用螺纹接头固定塑料管。
   注意：建议使用通气阀，以使封闭空气体积能够响应任何大气压变化，并补偿在舱体封闭和空气采样抽取过程中，或因不受控制的封闭空气温度变化所引起的体积变化。通气阀应为管状结构，而非简单的孔洞，以便在外部压力下降时，从封闭空间排出的空气可被收集在管内，并在压力再次升高时返回舱体。其弯曲形状可最大限度减少因风流经外部开口而导致舱体减压的风险。 即，文丘里效应²⁶.
6. 在细胞泡沫中挖一个 7 cm × 7 cm 的凹槽，并在盖子顶部中央开一个直径 1 cm 的孔，作为气体取样口。用可插入聚四氟乙烯（Teflon）管（内径 3 mm，长 20 cm）的橡胶塞封住该孔。确保橡胶塞放入凹槽后，聚四氟乙烯管向外延伸 3 cm，向内伸入 17 cm。将管子外露端连接至一个单向旋塞阀，以控制取样口的开启与关闭。
7. 在每个盖子内侧顶部安装一个由12V-7Ah可充电便携式电池供电的12V PC风扇，以确保空气混合均匀 通过固定在腔室内侧的两个钢制紧固件。
   注意：在封闭过程中，必须进行空气混合，以防止腔室顶空中出现任何气体分层，尤其是在存在大量植被的情况下。
8. 建造多个扩展部分，以便在植物完全生长后能将其容纳在培养室内。例如，如果植物最终高度不超过80 cm，则为每个培养室建造4个扩展部分。确保每个扩展部分均为由不锈钢制成的矩形箱体，尺寸为75 × 36 × 25 尺寸为 cm（长 × 宽 × 高），并具有上部可注水通道，结构与锚定装置所述相同。根据作物生长阶段，在密封腔室时将这些扩展部件添加至锚定装置与顶盖之间。

2. 防止土壤扰动系统的锚固部署与布置

1. 在田间准备完成后将锚钉插入土壤中（即在所有耕作操作完成后、水稻播种前进行。若条件允许，在整个测量期间应避免移除锚点，除非因两个连续种植季之间的耕作操作等必要情况。在开始通量测量前数天（至少提前2天）插入锚点，以便土壤在安装扰动后重新达到平衡状态。
2. 在将任何锚点分布于裸露土壤之前，先铺设30 cm × 3 m（宽 × 长）的木板，并在后续操作中仅在木板上行走，以避免土壤压实。木板应放置在距离每个锚点至少0.5 m的位置。
3. 将锚钉插入犁底层以下40 cm深处，以固定锚钉，并防止田间淹水后发生意外的侧向弯曲，尤其是在使用延长杆的情况下。在指定田块区域将锚钉放置于土壤表面后，将定制组装的钢架放置在锚钉顶部，同时保持两部件的正确对齐。用锤子将锚钉打入土壤，注意应敲击钢架而非锚钉本身，以避免损坏锚钉。插入完成后，使用气泡水平仪确保锚钉完全水平。
4. 每种监测处理至少插入三个锚点（即，重复）。若同一实验单元内需使用多个培养室，相邻培养室之间应保持至少1米的最小间距。
5. 所有锚点插入后，暂时移走步行木板，然后从田地两侧边缘搭建起一套猫道系统，重新布置田地。具体操作为：在距离锚点至少0.5 m的位置放置足够数量的混凝土块，以支撑木质走道系统。
   注意：过道桥是必要的，以防止在后续温室气体（GHG）测量过程中对土壤造成扰动。混凝土块的数量取决于锚点与田块侧边之间的距离。每块3米长的木板需要两个混凝土块以确保稳定性。

3. 气室封闭与温室气体测量

1. 每天在相同时间进行测量，以尽量减少昼夜节律带来的变异性。
   注意：最能代表日平均通量的时刻是温度接近日均温时。 即上午10点进行测量。这是通过一天中单次测量估算每日累积值的最佳方法。²⁷.
2. 到达野外现场后，将木板放置在混凝土块上以接近锚点。随后，向锚点上部周边放置的槽道内注水。根据需要小心添加延伸部件，以确保所有植物均被封闭在气室的顶空范围内。
   注意：为避免造成作物损伤，此操作应由两名操作人员共同完成。每个已使用的延伸管道也需注满水。
3. 关闭每个腔室，将盖子置于上部延伸部分的注水通道中。在关闭期间（通常为15–20分钟，可根据实验需求调整），以相等的时间间隔至少采集三个气体样品例如，关闭后立即取样，以及关闭后10分钟和20分钟取样。取样时，将一个带有单向止流阀的50 mL注射器连接至取样口，然后打开两个止流阀（一个在注射器上，另一个在取样口上）， "冲洗" 通过上下移动活塞三次，使注射器充分平衡，然后抽取35 mL培养室顶空气体，最后关闭两个旋塞。将注射器从取样口断开，并单独存放。
   注意：在田间淹水期间靠近观测箱操作时，应避免对积水造成扰动或产生湍流，因为这可能导致异常的气体气泡，从而影响温室气体通量估算的准确性。
4. 添加若干适合容纳水稻植株的延伸部件。将延伸部件置于底座与顶盖之间，填满所有可注水的通道。当水稻植株高出土壤表面20–40 cm（用折叠尺测量）时，使用一个延伸部件；当植株高度为40–60 cm时，使用两个延伸部件，依此类推。
5. 在密闭腔室期间，使用温度数据记录仪每隔3-5分钟测量一次顶空温度。
6. 在封闭期结束后，视为采样事件完成。取下盖子，随后移除所有已使用的延长装置。
   注意：为了缩短监测多个腔室所需的时间并避免昼夜变异带来的偏差，可同时测量一个以上的腔室。例如，由两名操作人员组成的团队可在30分钟内完成最多10个相邻腔室的取样。
7. 每次采样后，使用折叠尺测量每个腔室从土壤表面（田间排水时）或从积水水面（田间淹水时）到顶空的高度。

4. 样品处理与分析

1. 每次前往稻田之前，在实验室中为每个田间箱体准备三个（或更多）12 mL 玻璃小瓶，并用丁基橡胶隔垫密封。
   注意：小瓶可重复使用。每次重新使用前，必须更换橡胶隔垫并重新抽真空。
2. 从箱体顶空中取气后，应迅速将注射器中的样品转移至已抽真空的小瓶中，因为即使关闭了旋塞，塑料注射器也无法保证完全不泄漏²⁸。转移时使用25号皮下注射针头。首先将针头插入旋塞，打开旋塞并用5 mL样品冲洗针头；随后将针头插入隔垫，将剩余的30 mL样品推入预先抽真空的小瓶中，然后拔出针头。
   注意：小瓶内样品的压力高于> 2 atm，以确保可进行多次分析，并防止外界环境中的气体向样品扩散，从而避免改变其温室气体浓度。使用5 mL样品冲洗针头可使其重复用于其他样品。
3. 每次采样结束后，将小瓶转移至实验室进行分析。
   注意：尽管样品在20 °C条件下可稳定保存四个月以上²⁸，但仍建议尽快完成分析。
4. 使用配备电子捕获检测器（用于N₂O测定）和火焰离子化检测器（用于CH₄测定）的自动气相色谱仪测定所采集样品中的气体浓度²⁹。除样品外，还需测定若干已知浓度的N₂O和CH₄标准气体样品，以实现准确校准。
   注意：标准气体的浓度应覆盖样品预期浓度的范围。

5. 通量估算

1. 用于通量估算的模型应能够预测箱体布设时刻的通量。 即，即真实交换速率不受腔室存在影响的理想时刻。
2. 在通过气相色谱分析及后续校准确定以体积为基准的气体浓度后，计算物质的绝对量（N₂O 或 CH₄）存在于顶空中的含量，依据由理想气体定律推导出的空气摩尔体积计算。
   注意：强烈建议为每次采样事件制作相应的标准曲线，因为气相色谱仪的信号可能随温度发生轻微变化，从而导致误差。
3. 根据发射模式选择线性或非线性模型。在可用的非线性模型中，选择 HM 模型²⁵，最终依赖 HMR 软件包⁹如果具有三个时间点（时间0、时间1和时间2），则根据两个区段斜率的情况进行选择：若时间0与时间1之间的斜率在绝对值上大于时间1与时间2之间的斜率，且两个斜率方向一致，则采用HM模型；其他所有情况下均采用线性模型。如果具有三个以上的时间点，则使用HMR拟合两个模型，随后根据对模型趋势拟合效果的视觉评估自行选择最合适的模型。
4. 将低于最小可检测通量的通量设为零，该值根据气相色谱仪的检测限及操作条件（温度、压力、顶空体积）计算得出。
5. 为准确描述通量的季节性变化，应在全年进行至少40次采样（涵盖作物生长周期和轮作期），并在作物生长周期的关键事件（如耕作、施肥、排水、淹水条件建立、水稻幼苗从淹水层中露出等）前后增加采样频率，最高可达每日一次。例如，在排水期、施肥时 等等。) 至少每两周一次（例如，冬季期间）。

结果

每次测量事件都会为每个被监测的腔室产生一系列随时间变化的温室气体浓度，这些数据是估算温室气体通量的基础。原则上，通常无需舍弃数据，但若出现大量偏离单调函数（严格递增或递减）理论模型的情况，则需关注实验操作规程执行的准确性以及可能存在的未预期误差。例如，小瓶泄漏）。

图1 展示了一整年正确的CH₄通量示例。如误差棒所示，此类结果可能存在较大变异，主要原因是产生温室气体的微生物过程具有显著的空间异质性。对于观测到较高变异性的用户而言，此类结果并不一定意味着数据质量差。若变异度过高导致无法检测出处理间的差异，只需增加重复次数即可解决。

在图2中，展示了对季节变异性研究不足的一个示例：由于测量次数不足，导致对年通量的低估。

每日通量可进一步合并，用于计算一个太阳年、一个作物生长季或特定作物生长阶段的累积排放量。通常，累积通量的计算基于两次连续测量事件之间通量的线性变化。图 3 展示了 CH₄ 累积通量的一个示例。

图1。一年中淹水稻田CH₄日通量的季节性变化示例，涵盖一个完整的种植周期（5月至9月）以及非种植期。误差棒表示标准误差。请点击此处查看该图的放大版本。

图2。一年内淹水稻田CH₄日通量季节性变化的示例，测量次数不足，未能充分覆盖温室气体排放的关键时刻。误差棒表示标准误差。请点击此处查看该图的放大版本。

图3. 一个生长季内CH₄累积排放量的示例。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4。方法应用的主要阶段及其对应的关键点和成功指标。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在水稻田中应用静态密闭箱法包括五个基本阶段，对应于方案中所述的主要部分。每个阶段都包含需要注意的关键点以及用于检查阶段实施是否成功的指标，如图4所示。

在图4中描述的大多数关键点已在本实验方案中予以说明，只需遵循文中提供的建议即可轻松解决。本方案中最棘手的关键点是根据密闭箱内温室气体浓度随时间的变化来计算通量。此外，在使用HMR软件包进行计算时，建议根据可视化评估结果自主选择最合适的模型，而不应完全依赖HMR软件的推荐，这一点在浓度随时间变化偏离预期的持续上升或下降趋势时尤为重要。

在主要原则的框架内，所述技术存在多种可能的变体，尤其涉及腔室几何形状（腔室也可为圆柱形）、腔室材料（任何对所研究气体分子不具渗透性、无化学反应性、不产生或吸收气体且易于使用的材料均适用，例如特氟龙，但成本较高）以及温室气体分析仪的类型（已有便携式系统，无需通过注射器和小瓶进行气体转移）。然而，测量土壤温室气体通量是监测气候变化源、理解导致排放过程、研究可能减排策略的有效性以及为预测未来情景的模型提供依据所必需的关键步骤。采用统一的实验方案比以往任何时候都更为重要，这将有助于建立一致的知识体系，以监测全球温室气体预算中的农业生态系统。

此处应用理想气体定律来计算实际气体的摩尔体积。这一应用在相关文献中被广泛使用并得到认可，且理想气体近似可在合理准确度范围内使用³⁰。

最后，根据温室气体测量背景下拟解决的实验问题，应考虑测量驱动 CH₄ 和 N₂O 排放的主要因素，例如土壤温度、氧化还原电位、土壤孔隙中溶解性有机碳浓度、土壤孔隙中硝酸盐以及铵浓度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
锚点/腔室	-	-	自制
5 cm 厚闭孔泡沫材料	-	-	为一种隔热材料，可在建筑材料商店购买。
反光涂层（类似铝箔）	-	-	我们使用反光保温毯，但也可使用食品级铝箔。
弯曲塑料管（直径 1.5 cm，长度 24 cm）	-	-	我们使用电工导管，可在五金店购买。
螺纹连接件	-	-	我们使用电工导管连接件，可在五金店购买。
橡胶塞（直径 1 cm）	-	-	可在实验室设备商店购买。
聚四氟乙烯管（内径 3 mm）	-	-	可在实验室设备商店购买。
单向旋塞阀	-	-	我们使用输液用旋塞阀，可在医疗设备商店购买。
12 V 电脑风扇	-	-	可在电脑配件商店购买。
12 V-7 Ah 可充电便携式电池	-	-	可在电工材料商店购买。
钢制紧固件	-	-	可在五金店购买。
30 cm × 3 m（宽×长）木板	-	-	可在建筑材料商店购买。
钢制框架	-	-	自制
水平仪	-	-	可在五金店购买。
混凝土砌块	-	-	可在建筑材料商店购买。
50 ml 注射器	-	-	可在医疗/兽用设备商店购买。
折叠尺	-	-	可在五金店购买。
温度数据记录仪	Onset	HOBO U23 Pro v2 外置温度数据记录仪
12 ml 平底样品瓶（Exetainer）	Labco UK	736 W
瓶用丁基橡胶隔垫	Labco UK	VW101
25 号皮下注射针头	-	-	可在医疗设备商店购买。
CH4 和 N2O 标准气体	-	-	可在气体钢瓶供应商处购买。