本文介绍了部分胆管结扎术，作为一种用于啮齿类动物肝脏损伤与再生研究的外科模型。
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本文内容
摘要
摘要
在啮齿类动物中，对总胆管进行完全性胆管结扎（cBDL）是一种研究阻塞性胆汁淤积和胆管增生的成熟外科技术。然而，长期实验可能导致发病率和死亡率升高。在某些具有基础肝病的小鼠品系中，即使仅结扎肝脏的一个叶段，也能获得有意义的比较结果，同时减少动物损耗和实验成本。本文介绍小鼠的部分胆管结扎术（pBDL），该方法仅结扎左侧肝胆管，导致左叶发生胆道梗阻，而其余肝叶不受影响。通过精细的显微外科技术，pBDL 实验具有较高的成本效益，因为未结扎的肝叶可在同一动物体内作为结扎叶段的内部对照，在相同条件下进行比较。与 cBDL 不同，该方法无需设置单独的假手术对照组。pBDL 非常适用于直接比较胆汁淤积及其他滞留性胆汁成分的局部效应与全身效应。此外，pBDL 还可被重新用于研究与药物作用机制及细胞迁移相关的生物学过程的新方法。
引言
数十年来，研究人员一直使用啮齿类动物的急性肝损伤与修复手术模型（如部分肝切除术或胆总管结扎术（cBDL））来研究肝脏再生及病理生物学过程1,2。在cBDL模型中，胆总管（负责引流肝脏产生的全部胆汁）被结扎，导致术后前2-3周内出现阻塞性胆汁淤积、炎症和纤维化，并最终进展为肝硬化3。胆管增生、胆管细胞转分化以及肝内肝祖细胞的激活也是cBDL模型的特征表现4,5。尽管cBDL能够揭示阻塞性胆管病的特定机制，且在野生型小鼠及肝脏功能正常的小鼠品系中具有明确的表型和可重复的结果6,7,8，但在某些肝脏疾病转基因小鼠模型中，该手术技术难度较高，且由于胆道梗阻随时间推移导致更高的发病率和死亡率，往往需要使用比预期更多的动物。该技术同样适用于研究本身存在基础肝病的转基因小鼠，因为这类小鼠可能无法耐受cBDL术后长期实验过程中的生理应激。
pBDL 可提供一种合理的替代方法，有助于克服上述部分挑战。早期在野生型小鼠中开展的 pBDL 研究旨在区分局部作用与全身性的炎症介质9。在 pBDL 操作中，于肝门处仔细暴露位于胆总管上方的左右肝管主要汇合部，仅结扎左肝管以诱导局部梗阻性胆汁淤积。与 cBDL 相比，pBDL 具有多项优势。在 pBDL 中，未结扎的右肝叶可作为与结扎的左肝叶完全匹配的内部对照，二者经历相同的全身性影响，例如营养状态或循环因子。尽管存在全身性促炎介质，Osawa et al. 观察到未结扎肝叶中的纤维化和坏死程度较轻，而结扎肝叶中炎症细胞浸润增多且转化生长因子-β 表达升高9。
最近，pBDL 被重新定义用于研究胆汁潴留对肝实质的影响10。通过在同一动物体内设置未结扎的假手术（"sham"）作为内部对照和实验组，pBDL 可有效将每项实验所需的动物数量减少一半，从而更具成本效益。小鼠对 pBDL 的耐受性更好，因此可在结扎叶实现理想的实验时间过程（≥2 周）。最重要的是，pBDL 能够区分阻塞性胆汁淤积及结扎叶内胆汁成分潴留所引起的直接肝内效应，与未结扎的对照叶进行比较。总体而言，pBDL 是一种研究肝脏局部胆汁淤积所致叶特异性效应的有吸引力的方法。
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方案
所有操作均遵循匹兹堡大学机构动物照护与使用委员会的伦理指南进行。
1. 基本技术与常见操作步骤
- 使用前对所有显微外科器械进行高压灭菌。
- 为避免麻醉导致小鼠死亡，需仔细检查其呼吸模式。
- 尽量减少对器官和肠道的触碰，以避免造成器官损伤和出血。出血部位应用湿棉签或无纺纱布海绵按压止血。
- 使用湿棉签轻柔操作器官。湿的无纺纱布海绵有两种规格：3.5 × 3.5 cm 和 6.0 × 6.0 cm。较小的用于牵拉整个肝脏，较大的用于包裹小肠和大肠。
2. 术前准备
- 采用8至12周龄的雄性C57/B6小鼠（体重约为20-35 g）进行部分胆管结扎术。
- 在麻醉诱导前，让小鼠自由饮水和进食。
3. 部分胆管结扎手术
- 将小鼠放入诱导室中，使用含1.5-2.0%异氟烷和1 L/min氧气的混合气体进行麻醉。通过观察呼吸频率密切监测动物状态。当小鼠呼吸频率降至每秒一次时，表明已充分麻醉。 由于前肢回缩反射消失较快，应同时轻捏后肢足部以确认回缩反射完全消失。 应用眼用润滑剂涂抹眼睛，防止角膜溃疡。 注意可在术前给予首剂镇痛药，以预防疼痛受体被激活。
- 使用毛发修剪器剃除腹部体毛，将小鼠置于手术显微镜下的手术台上，并用胶带固定四肢。通过吸入异氟烷维持全身麻醉状态。
- 调节异氟烷挥发罐，诱导阶段使用2.0-3.0%异氟烷。
- 使用无菌棉签首先局部涂抹0.3-0.5 mL聚维酮碘进行腹部皮肤消毒，随后使用70%乙醇。 动物体表应覆盖无菌手术巾。
- 使用剪刀和Adson镊从剑突至耻骨做一条长的腹正中切口。完成腹腔切口后，将异氟烷浓度降低至0.8-1.0%以维持麻醉。
- 使用微型牵开器暴露腹腔。用蚊式钳夹住剑突并向小鼠头部方向牵拉，使用软黏土固定蚊式钳位置。
- 向腹腔内注入1-2 mL预热至37 °C的无菌磷酸盐缓冲液（PBS），以避免损伤腹腔器官。用湿润棉签轻轻托起小肠并向头部方向牵拉。剪开小肠与后腹膜之间的韧带，以防损伤小肠（图1A）。
- 用湿润的无纺纱布包裹小肠和大肠，并将其置于腹腔尾侧。 包裹在无菌纱布中的肠管可放置于无菌铺巾区域，以防污染。
- 使用一小块湿润的无纺纱布轻轻将整个肝脏向剑突方向牵拉，以暴露肝门及肝十二指肠韧带（图1B）。
- 检查并确认肝门解剖结构。胆总管位于门静脉腹侧。确认左右肝管的位置，二者汇入肝门处的主要胆管汇合部。
- 辨认引流左肝叶的左肝管，使用缝针钝面将10-0尼龙线环绕其周围（图2A）。操作时避免损伤门静脉、肝动脉及肝脏表面。
- 用10-0尼龙线结扎左肝管（图2B）。
- 使用湿润棉签将小肠和大肠复位至术前位置。
- 确认无肠扭转及腹腔内出血后，使用4-0薇乔线分两层连续缝合肌肉和皮肤。 皮肤缝合使用编织缝线（Vicryl），但为降低感染风险，更推荐使用单股缝线。
注：从剑突至耻骨行连续缝合关闭筋膜，从耻骨至剑突行连续缝合关闭皮肤。 - 缝合切口后停止麻醉。
4. 术后治疗与随访
- 手术后立即轻轻捏住小鼠背部皮肤，皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg）和头孢唑林（100 mg/kg），随后每12小时注射一次布托啡诺，连续3天；每24小时注射一次头孢唑林，连续3天11,12,13。 注意：可在术前给予首剂镇痛药，以预防疼痛受体被激活。头孢唑林及其他围手术期抗生素仅适用于免疫抑制动物，例如用于移植研究的动物。
注意：若手术成功，小鼠通常在30分钟内恢复。其活动能力将几乎与术前状态相同。 - 每日检查小鼠是否有任何痛苦迹象。
- 在全身麻醉下通过颈椎脱位法处死小鼠，于pBDL术后特定时间点（即第7、14、21天）采集肝脏及其他组织样本。
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结果
在此典型实验中，对三只PiZ转基因小鼠进行了pBDL手术，这些小鼠可重现α-1抗胰蛋白酶（A1AT）缺乏症中所见的人类肝脏疾病。PiZ小鼠过表达一种转基因，该转基因由多个基因组DNA片段组成，包含突变型人A1AT基因及其启动子的编码区，以及内含子和约2千碱基的上下游侧翼区域14,15。正常的A1AT是一种由肝脏产生的分泌型血清蛋白。突变型A1AT会形成不溶性蛋白聚集体，自发在肝脏中积累，导致毒性应激。实验采用3月龄雄性PiZ小鼠，此时该疾病的表型最为严重，且蛋白聚集体达到峰值16。
比较了部分胆管结扎（pBDL）和完全胆管结扎（cBDL）的PiZ小鼠的血清肝功能生化指标（表1）10。肝酶丙氨酸氨基转移酶（AL...
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讨论
虽然结扎共同胆管（cBDL）是研究阻塞性胆汁淤积最常用的实验技术，但在啮齿类动物中可能面临多种挑战。根据达到实验终点所需的术后天数不同，随着时间推移，动物可能会出现显著的病态和死亡率。当使用某些肝脏疾病转基因小鼠模型时，由于这些模型在基线状态下即存在肝实质结构和功能的异常，组织损伤和胆道坏死的程度会进一步加重。与cBDL相比，关于部分胆管结扎（pBDL）的报道较少，但该技术可在特定实验中作为替代方法，以减少不良结果和动物损耗。
关于pBDL方法的多种改良方案已有报道。Heinrich 等 采用的方法中，将一根外部弯曲的针置于胆总管旁，随后对胆总管和针一起进行结扎17。在关闭腹壁前移除该针，从而在胆管内形成狭窄的管腔（即，不完全性阻塞），使胆汁流量受限17。在此操作过程中，同时切除胆囊以预防胆囊炎17。作者认为，该方法更适用于研究急性胆汁淤积，而非慢性病变17...
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致谢
Khan 博士感谢美国国立卫生研究院/国立儿童健康与人类发育研究所（NIH/NICHD K12HD052892）、Alpha-1 基金会、Hillman 基金会以及匹兹堡肝脏研究中心提供的资助支持。Michalopoulos 博士感谢美国国立卫生研究院/国立糖尿病、消化与肾脏疾病研究所（NIH/NIDDK P01DK096990）提供的资助支持。我们非常感谢 Anne Orr 提供的出色且无私的技术协助。我们还感谢 David A. Geller 博士提供使用移植/啮齿类动物显微外科实验室的机会。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 显微镜-Leica Wild M650，6–40× 放大倍数 | Leica Microsystems | n/a | |
| Tec 3 异氟烷麻醉蒸发器（漏斗加液型） | General Anesthetic Services | n/a | |
| 史蒂文斯肌腱剪 | Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation | ASSI.9193 | |
| 阿德森镊 | Fine science tools | 11006-12 | |
| 蚊式精细止血钳 | Codman | 30-4472 | |
| 微型牵开器 | Murdock; Roboz Surgical Instrument | RS-6550 | |
| 无纺纱布海绵 | Fisherband | 870-PC-DBL | |
| Puritan 6” 小型棉签（带木柄） | Puritan Medical Products Company | 868-WCS | |
| Dumont SS 镊子 - 标准头/直头/不锈钢/13.5 cm | Fine science tools | 11203-23 | |
| Dumont SS 镊子 - 标准头/45°弯头/不锈钢/13.5 cm | Fine science tools | 11203-25 | |
| Vannas 弹簧剪 - 3 mm 刃口 | Fine science tools | 15000-00 | |
| 微针持针器 | Aesculap Surgical Instruments | FD231R | |
| Micro AROSuture，无菌 10-0 尼龙缝线，70 µm，TAP 针尖 | AROSurgical Instruments Corporation | T4A10N07 | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J662H | |
| 5 ml 注射器 | BD | 309646 | |
| Falcon 组织培养皿，60 × 15 mm | Corning | 353002 | |
| 异氟烷，美国药典（USP）吸入用液体，250 ml | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | |
| Buprenex 注射液（盐酸丁丙诺啡） | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496-0757-1 | |
| 注射用头孢唑林，USP | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-238-61 | |
| 聚维酮碘擦洗液（聚维酮–碘 7.5%） | Medline | NDC 12496-0757-1 | |
| 70% 乙醇 | Decon Labs | 2716 | |
| 不含钙和镁的磷酸盐缓冲液 | LONZA | 17-516F | |
| Sirius 红染料 | Sigma | 365548 | |
| 苏木精 | Fisher (Richard-Allan Scientific) | 22-050-111 (7211) | |
| 伊红 | Anatech (Fisher) | 832 (NC9686037) | |
| 福尔马林 | Fisher | SF100-20 |
参考文献
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