人类胚胎干细胞具有自我更新能力，并能分化为体内所有类型的细胞，这表明它们在医学应用以及作为研究发育和疾病基本问题的工具方面具有巨大潜力。本文提供了一种简明的逐步实验方案，通过免疫外科手术法分离内细胞团，从胚胎中获取人类胚胎干细胞。
本文内容
摘要
摘要
人类胚胎干细胞具有自我更新能力，并可分化为体内所有类型的细胞，这表明它们在医学应用以及作为研究发育和疾病基本问题的工具方面具有巨大潜力。本文提供了一种简明的逐步操作方案，通过免疫外科手术法分离内细胞团，从胚胎中获取人类胚胎干细胞。
方案
用于获取人类胚胎干细胞（hES细胞）的冷冻人类胚胎，是在哈佛大学人类受试者使用委员会和胚胎干细胞研究监督委员会审查并批准的研究方案下，经适当知情同意后捐赠用于科研的。
以下书面方案基于 Cowan 等人 2004 年报道的已发表参数，并进行了轻微修改。
胚胎培养
使用Quinn's Advantage解冻试剂盒解冻人类胚胎，并在添加了15% Plasmanate的Global培养基液滴中培养，直至发育至扩张囊胚阶段。
基于免疫手术法分离内细胞团
准备：
- 为去除透明带和进行免疫手术（见下文），在10 cm培养皿中制备各溶液液滴。用矿物油覆盖以防止蒸发。为每个拟用于建系的胚胎准备单独的一行。
- EmbryoMax 酸性 Tyrode 溶液，直接使用。
- 人胚胎干细胞（hES）建系培养基：75% KO-DMEM，10% KO-血清替代物，10% Plasmanate，2.5% 经胚胎干细胞测试的胎牛血清（FBS），2 mM Glutamax-I，1% 非必需氨基酸，50 单位/mL 青霉素，50 µg/mL 链霉素，0.055 mM β-巯基乙醇，5 ng/mL bFGF。
- 兔抗人红细胞一抗，按制造商建议重悬，用hES细胞建系培养基按1:10稀释。
- 豚鼠补体血清，按制造商建议重悬，用hES细胞建系培养基按1:10稀释。
- 使用前将所有培养皿在组织培养孵育箱中平衡至37°C。
- 拉制50 µL–100 µL毛细移液管（VWR），用于转移胚胎。用钻石笔切割管端，并与带有0.2 µm滤器的口吸管连接使用。
免疫手术程序：
注意事项：
- 在此操作中，滋养外胚层细胞通过短暂暴露于针对人类细胞的抗体并联合补体活性而被破坏。因此，该方案最适合用于滋养外胚层完整的高质量胚胎，因为只有囊胚的结构完整性才能防止内细胞团同样受到免疫反应的影响。
- 所有操作均在配备加热载物台的解剖显微镜下进行。
步骤：
- 使用胎牛血清（FBS）冲洗将用于胚胎移植的移液管，以防止胚胎粘附。
- 将囊胚从培养皿转移至含人胚胎干细胞（hES）的AT培养皿中的 holding 液滴中。
- 开始操作：将囊胚从hES液滴依次通过一系列AT液滴。在第三个液滴中观察透明带（zona pellucida）的溶解情况（通常为5–30秒）。注意避免过度处理，以免影响胚胎完整性。
- 将囊胚依次通过一系列人胚胎干细胞（hES）分离培养基液滴，以洗去AT。建议预先在移液管中吸入培养基，以便立即中和AT反应。所有囊胚完成AT处理前，可暂时存放于此处。
- 将囊胚依次通过一系列一抗液滴，并在第三个液滴中于37°C组织培养箱中孵育30分钟。
- 将囊胚依次通过一系列人胚胎干细胞（hES）分离培养基液滴，以洗去未结合的一抗。
- 将囊胚依次通过一系列补体液滴，并在第三个液滴中观察滋养层细胞的裂解情况。将培养皿置于显微镜载物台上，最初30秒内观察滋养层细胞裂解时是否出现“起泡”现象。若在此期间观察到裂解，应将培养皿保留在显微镜下继续监测，直至反应完成。若前30秒内未见起泡，则放回培养箱，每隔5分钟检查一次，直至大部分滋养层细胞发生裂解（通常需5–15分钟）。需密切监测反应过程，以尽量缩短反应时间并减少对内细胞团的潜在损伤。
- 将囊胚依次通过一系列人胚胎干细胞（hES）分离培养基液滴，以清除残留的补体活性。
- 使用玻璃移液管（其直径略小于囊胚，由10µl VWR毛细管拉制而成），将囊胚反复吹打数次，以去除大部分已裂解的滋养层组织。
- 将分离得到的内细胞团（ICM）接种至经有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）饲养层上。MEFs应于分离前一天制备，并在分离当天更换为人胚胎干细胞（hES）分离培养基。4孔NUNC培养皿适用于分离的初始步骤。
- 接种后最初1–2天内勿扰动培养皿。此后每日观察是否有胚胎干细胞集落向外生长（通常在1–2周内可见）。从第3天开始，每隔一天更换一半体积的培养基。
胚胎干细胞的生长与传代
当人胚胎干细胞集落生长至约0.5 mm或更大时，即可通过机械挑取进行扩增。
- 机械分散一半的生长物，并转移至含有新鲜饲养层的新培养板中。胚胎干细胞团块应约为30–50个细胞大小。保留另一半生长物作为首次传代（p1）的备用。随着生长物持续扩展，原始生长物（p0）可多次挑选使用。
- 次级克隆可同样分散并扩增至更大的培养皿中，直至第3-5代，此时新建立的细胞系可逐渐适应使用胰蛋白酶进行酶法传代。在最初的几代传代过程中，培养基中的血清含量也应逐步降低至1%和0%，以最大限度减少胚胎干细胞的分化。
- 所有已建立的胚胎干细胞系都应通过冻存早期传代的部分细胞，以备将来扩增使用。
- 此外，每种细胞系均应通过核型分析进行表征，并通过多能性及分化研究加以验证 体外 和 体内.
讨论
本文提供的实验方案为研究人员简明扼要地概述了如何通过免疫外科手术法分离内细胞团来建立人类胚胎干细胞系。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
A.E.C. 是 Jane Coffin Childs 医学研究纪念基金会和默克研究实验室的会士。我们感谢 D. Egli 和 C. Cowan 在实验设计和讨论方面提供的建议。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Quinn’s Advantage Thaw Kit | Sage | ART-8016 | |
| Global 培养基 | Life Global | GMGB-050 | |
| Plasmanate | Talecris | 61325 | |
| EmbryoMax 酸性 Tyrode 溶液 | Chemicon International | MR-004-D | |
| KO-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KO-血清替代物 | Invitrogen | 10828-028 | |
| 经胚胎干细胞验证的定义型胎牛血清 | Hyclone | SH30070.03 | |
| Glutamax-I | Invitrogen | 35050-079 | |
| 非必需氨基酸 | Invitrogen | 11140-076 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15070-063 | |
| 重组人碱性成纤维细胞生长因子 | Invitrogen | 13256-029 | |
| Beta-mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 兔抗人红细胞一抗 | Rockland Immunochemicals | 109-4139 | |
| 豚鼠补体血清 | Sigma-Aldrich | S-1639 | |
| 10 µL、50 µL、100 µL 规格的毛细吸管 | VWR international | ||
| 带管路的口吸移液器 | VWR international | 与 VWR 提供的毛细吸管配套供应 | |
| 0.2 µm Acrodisc 注射式滤器 | Pall Corporation | PN4192 | |
| 0.5% 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 25300-120 | |
| 组织培养皿 | VWR international | ||
| 组织培养皿 | Nalge Nunc international | ||
| 配备 Nikon Tokai Hit ThermoPlate 加热载物台的 Nikon SMZ1500 解剖显微镜 | |||
| 小鼠胚胎成纤维细胞（E12.5） |
参考文献
- Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).
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