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CRISPR介导的染色质环结构重排

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DOI：

10.3791/57457

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2018年9月14日

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1Department of Dermatology, Program in Epithelial Biology, Stanford University School of Medicine, 2Program in Cancer Biology, Stanford University School of Medicine, 3Canary Center for Cancer Early Detection, Department of Radiology, Stanford University School of Medicine, 4Department of Biology, Bridgewater State University, 5System Biosciences, 6Veterans Affairs Healthcare System

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

染色质成环在基因调控中起着重要作用；然而，目前尚无技术能够实现对染色质环的选择性且可逆的修饰。本文介绍了一种利用CRISPR-dCas9进行染色质环重排的强大系统（CLOuD9），该系统已被证明可选择性且可逆地调控靶向位点的基因表达。

摘要

近期研究表明，远距离的三维染色质环化相互作用在基因表达调控中发挥着重要作用，但目前尚不清楚染色质环化是基因表达改变的原因还是结果。直到最近，染色质环化如何影响基因活性和细胞功能的机制仍相对模糊，而现有技术在操控这些结构方面的局限性也阻碍了对这类相互作用的深入探究。为解决这一不确定性，我们开发了一种利用CRISPR-dCas9实现选择性且可逆的染色质环重排方法（CLOuD9）。CLOuD9系统的动态性已通过成功将CLOuD9构建体定位至目标基因组位点并调控局部染色质构象得到验证。尤为重要的是，该系统能够逆转诱导形成的染色质接触，并恢复内源性染色质构象的能力也已得到证实。利用该方法调控基因表达，不仅证明了其调控细胞基因表达的能力，也凸显了该技术在癌症和发育背景下创建稳定de novo染色质环并显著影响基因表达方面的巨大应用潜力。

引言

近年来，细胞核内染色质折叠与基因组特定空间组织之间的关系引起了广泛关注，因为已发现其与基因表达密切相关1,2。尽管基因活性与染色质结构调控之间的精确关系尚不明确，但已有假说认为，染色体接触位点之间因动态三维染色质结构而产生的相互作用具有基因调控功能3。事实上，人类珠蛋白基因位点的研究已充分证实了这一效应：位点控制区（LCR）通过与珠蛋白基因区域形成染色质环，以发育阶段特异性的方式调控珠蛋白基因的活性4。然而，无论是在该位点还是其他区域，目前仍不清楚染色质成环是基因表达改变的原因还是结果。

迄今为止，研究这一现象所面临的挑战仍未得到解决。例如，其他诱导染色质环的尝试均涉及对线性DNA序列的修饰，或需要大量有关促进成环特定元件的背景知识的复杂操作流程5,6,7,8。此外，尽管先前的研究表明染色质环在特定且有限的背景下可驱动基因表达7,8，但染色质成环在全基因组范围内影响转录的程度仍不明确。尽管近年来人们对长距离成环对基因表达影响的兴趣持续增长，但关于如何建立并维持染色质接触以改变基因活性的问题仍未得到解答。

我们所研发的技术利用了核酸酶缺陷型的规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）-CRISPR相关蛋白9（dCas9），从而实现对任意基因组位点的广泛适用性靶向9。该技术避免了对线性DNA序列进行修饰所带来的一系列复杂问题，且无需对特定的成环元件具备深入的前期知识即可使用。尤为突出的是，该工具具有普适性，可广泛应用于发育过程以及多种疾病（如癌症）中所识别的染色质环结构。CLOuD9的强大之处在于能够可逆地改变染色质环的结构，从而有效调控基因表达。

方案

1. gRNA 设计

  1. 选择一个标准的gRNA设计工具来设计向导RNA10使用先前开发的 CLOuD9 载体的互补配对9 （即至少 1 S. aureus （CSA）和1 S. pyogenes （CSP）构建体）用于每次实验。
    1. 在选定的在线设计工具中，使用原间隔序列邻近基序（PAM）序列 "NGG" 引导序列长度为20 bp，针对CSP及PAM序列 "NNGRRT" 引导序列长度为21，适用于CSA。
    2. 根据特异性评分选择向导，并在两条链上设计向导，以最大化获得有效向导的可能性。
    3. 每个向导从寡核苷酸制造商处订购两条寡核苷酸：对于正向寡核苷酸，添加 "caccg" 在向导序列的5'端添加，对于反向寡核苷酸，添加 "aaac" 到5'端 "c" 在订购前添加到3'端。
  2. 首先，针对每个目标区域设计3-5个gRNA，分布于250-1000 bp的范围内。gRNA靶向效率的评估方法如下：
    1. 将鉴定出的gRNA克隆至具有活性的Cas9质粒中（见步骤3），并瞬时转染至293T细胞（见步骤4）11.
    2. 在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（pen strep）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养细胞2–3天，随后收集细胞并提取基因组DNA12.
    3. 通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目标区域。将产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，并纯化相应条带。
    4. 按照 Guschin 所述的方法进行 T7 核酸内切酶实验， 等. 实验方案13,14.
      注意：高效向导序列是指被确定能够在靶位点切割DNA的向导序列。

2. 细胞培养

  1. 保持细胞处于健康且活跃分裂的状态。
    1. K562细胞培养于含10% FBS和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中。
      1. 在25 cm²培养瓶中培养K562细胞2 倾斜颈烧瓶用于 每天维持细胞并调整细胞密度至400,000个细胞/mL。
      2. 在K562细胞转导CLOuD9载体后，向维持培养基中添加2 µg/mL嘌呤霉素和100 µg/mL潮霉素。
    2. 对于293T细胞，使用含10% FBS和1%青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）进行培养。
      1. 在10 cm培养皿中培养293T细胞2 培养皿中的细胞在汇合时进行传代和分瓶。

3. 质粒制备与gRNA插入15

注意：质粒图谱见附录，示例实验中使用的引物见补充表1。

  1. 将5 µg慢病毒CRISPR质粒与3 µL BsmBI、3 µL碱性磷酸酶、6 µL 10x缓冲液以及0.6 µL新鲜配制的100 mM DTT混合。用ddH2O补至总体积60 µL，37 °C孵育30分钟，以完成质粒的消化和去磷酸化。
  2. 对消化后的质粒进行凝胶纯化，并用ddH2O洗脱。
  3. 取每条成对向导RNA（100 µM）各1 µL，加入1 µL 10x T4连接酶缓冲液、6.5 µL ddH2O和0.5 µL T4多核苷酸激酶（T4 PNK），总体积为10 µL。37 °C孵育30分钟，然后95 °C孵育5分钟，再以5 °C/min的速率降温至25 °C。
    注意：此步骤可使成对向导RNA退火配对。
  4. 将步骤3.3中退火后的向导RNA用ddH2O稀释1:200。
  5. 取步骤3.2中消化后的质粒1 µL，加入步骤3.4中稀释后的连接产物0.5 µL、2.5 µL 2x缓冲液、1 µL ddH2O和0.5 µL连接酶，总体积为5.5 µL。室温孵育10分钟，使向导RNA连接至经BsmBI消化的质粒上。
  6. 将步骤3.5中连接完成的新质粒转化至Stbl3细菌中，并采用任意质粒制备方法进行扩增。

4. 慢病毒生产

  1. 使用血细胞计数板，按照每孔750,000个的数量将293T细胞接种于六孔板中，每孔加入含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基。每个质粒构建体使用一个孔。
  2. 接种后24小时，更换为新鲜的不含抗生素的DMEM培养基，其中含10% FBS。
  3. 在一个离心管中，每反应体系加入11 µL脂质体转染试剂，并用150 µL OptiMEM培养基稀释11。
  4. 在另一个离心管中，每反应体系加入步骤3.6中获得的2 µg CLOuD9慢病毒载体质粒、0.35 µg pMDLg/pRRE、1 µg pRSV-Rev和0.65 µg pMD2.G，并用150 µL OptiMEM培养基稀释11。
  5. 对于每个反应体系，将稀释后的慢病毒质粒混合物以1:1的比例加入到稀释后的脂质体转染试剂中，混匀后室温孵育5分钟11。
  6. 将步骤4.5中形成的每种混合复合物全部加入步骤4.2中对应的不含抗生素的293T细胞孔中。
  7. 48小时后，用移液器收集病毒上清液至新的离心管中，于300 × g离心5分钟。离心后，将上清液转移至新的离心管中，以去除残留的细胞碎片。
  8. 立即使用病毒上清液对靶细胞进行转导，或将其在-80 °C保存以备后续使用。

5. 细胞的慢病毒转导

  1. 将每种感兴趣的病毒构建体（包含互补的 CLOuD9 质粒）各 250 µL 加入含有 80,000 个细胞的 15 mL 圆锥管中，用于 CLOuD9 实验。
  2. 用不含抗生素的培养基将每个圆锥管中的培养基总体积补至 1 mL，并加入聚凝素（polybrene），使其终浓度为 1–8 µg/mL（所用细胞类型可耐受的 polybrene 最大浓度需通过实验确定）。
  3. 在室温下以 800 × g 离心 30 分钟，然后通过移液重悬细胞，不移除病毒上清液。将全部细胞悬液转移至细胞培养板中。
  4. 转导后 24 小时，在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。
  5. 吸除病毒上清液，并将细胞重悬于常规细胞培养基中。
  6. 次日，在细胞培养基中加入嘌呤霉素（293T 细胞使用浓度为 1 µg/mL）和潮霉素（293T 细胞使用浓度为 25 µg/mL），以筛选双转导细胞。在开始实验前，需通过实验确定特定细胞类型适用的嘌呤霉素和潮霉素浓度。
  7. 在进行任何后续实验前，至少维持细胞在筛选培养基中培养 3 天，并在整个实验过程中持续使用筛选培养基。

6. 细胞二聚化与洗脱

  1. 向细胞培养物中加入 1 mM 脱落酸（Abscisic Acid, ABA）或等体积的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）作为对照，以诱导经筛选并转导的 CLOuD9 细胞发生二聚化。ABA 须在收到后 6 个月内使用，保存时需低温避光。如有需要，可使用 2 mM ABA。
    1. 实验期间每天更换培养基，以提供新鲜的 ABA（或对照组的 DMSO）。
      注意：目前尚未观察到二聚化持续时间的上限。
  2. 通过移除含 ABA 的培养基，并用足量磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline, PBS）洗涤细胞两次（每次覆盖培养板表面），以逆转二聚化。随后将细胞培养于不含 ABA 的培养基中，以维持其非二聚化状态。

7. 免疫沉淀与共免疫沉淀

注意：所有缓冲液均需新鲜配制，并在使用前立即准备。

  1. 二聚化实验完成后，收集细胞并离心，然后吸除上清液。
  2. 交联并冻存细胞
    1. 使用新鲜材料在室温下配制1%多聚甲醛的PBS溶液。每200万细胞，加入1 mL室温的1%多聚甲醛溶液，轻轻重悬细胞，在旋转仪上室温孵育恰好10分钟。
      注意：交联少于1000万细胞时，使用体积不少于10 mL的溶液。
    2. 加入甘氨酸至终浓度为0.125 M以终止交联反应，室温下旋转孵育5分钟。
    3. 离心收集细胞，并用预冷的PBS洗涤1-2次。细胞沉淀可立即使用，或在液氮中速冻后于-80 °C保存。
      注意：加热会逆转甲醛交联。若时间紧迫，细胞可直接储存于 -80 °C，无需速冻。
  3. 制备抗体/磁珠偶联物
    注意：优化所选抗体的实验条件（例如，测试不同的细胞裂解缓冲液并进行免疫沉淀）可能是必要的。两种常用的缓冲液，Farnham 裂解缓冲液和改良 RIPA 缓冲液，可能对免疫沉淀效率和超声处理效率产生显著影响。所有缓冲液的组成均可在下文中找到 材料表此外，请注意染色质超声处理可能需要数小时才能完成。
    1. 根据所选抗体的要求，通过短暂涡旋振荡重悬磁珠。
    2. 将适量的磁珠转移至1.5 mL离心管中。作为起始参考，每1 µg抗体使用20 µL磁珠。此时暂不加入抗体。
      注意：以每毫克总裂解液使用10 µg抗体和200 µL磁珠作为起始条件，除非已知该抗体的效率显著高于或低于此水平。对于低丰度蛋白，可能需要调整此比例。
    3. 若使用Farnham裂解缓冲液，则用免疫沉淀稀释缓冲液洗涤3次；若使用RIPA裂解缓冲液，则用RIPA裂解缓冲液洗涤3次。
    4. 将珠子重悬于步骤 7.3.3 中使用的相同缓冲液（IP 稀释缓冲液或 RIPA 缓冲液）中，最终体积为 >1x 和 <5倍初始体积。 即 对于100 µL的初始珠子体积，最终重悬体积应使用100至500 µL。
    5. 将抗体以适当浓度加入已洗涤的磁珠中。对于用于免疫沉淀CLOuD9构建体的良好HA或Flag抗体，建议抗体用量为1:50（µg 抗体: µg 蛋白裂解液），在4 °C下旋转孵育8小时以上或过夜；也可在室温下孵育2–4小时。
    6. 去除珠子上的上清液并弃去。
    7. 用洗涤缓冲液洗涤磁珠3次。
    8. 用用于抗体过夜孵育的缓冲液（IP稀释缓冲液或RIPA缓冲液）以最小体积重悬，保持低温直至与蛋白裂解液混合。
  4. 超声处理染色质
    1. 首先在冰上向细胞沉淀中加入膨胀缓冲液，裂解细胞，孵育10分钟，每隔几分钟轻弹管壁以防止细胞沉淀。
      注意：通常将500 µL膨胀缓冲液加入2500万细胞中，并依此比例放大，但所用缓冲液体积不得少于500 µL <2500万个细胞
    2. 手动使用Dounce匀浆器顺时针和逆时针方向各研磨13次。
    3. 然后在4 °C、1,500 x g条件下离心5分钟，使细胞核沉淀。彻底吸除上清液，并重复一次以去除残留上清液，随后称量细胞沉淀的重量（单位为mg）。
    4. 向核裂解缓冲液（上述的 Farnham 缓冲液或 RIPA 缓冲液，选择其中一种）中加入蛋白酶抑制剂。
    5. 向沉淀的细胞核中加入10倍体积的细胞核裂解缓冲液以重悬（例如，向100 mg沉淀中加入1 mL细胞核裂解缓冲液）。短暂涡旋混匀，冰上裂解10分钟。
      注意：请考虑超声处理管的尺寸。理想体积通常为 <1 mL，因此如果沉淀物过大，可能需要将样品分装。
      1. 进行共免疫沉淀（Co-IP）时，短暂超声处理细胞核以溶解物质，并通过加入2-3倍体积的稀释缓冲液将SDS淬灭至可进行免疫沉淀的水平，然后进入步骤7.4.6。对于非常敏感的抗体，可添加更多稀释缓冲液以进一步降低SDS浓度。
        注意：当裂解液变澄清时即停止超声处理；裂解液将从不透明或半透明的白色变为完全透明。保持样品尽可能低温，避免过度超声。
      2. 对于染色质免疫沉淀（ChIP），需充分超声处理DNA，以获得150-1000 bp的DNA片段，随后进行步骤7.4.6。
    6. 在4 °C下以最大速度离心10分钟，沉淀不溶物。
    7. 将可溶性物质转移至新离心管中。
    8. 进行免疫共沉淀（Co-IP）时，测定蛋白质浓度，并继续执行第7.5步的下拉操作。
    9. 进行染色质免疫沉淀（ChIP）时，取10 µL澄清裂解液，加入40 µL免疫沉淀洗脱缓冲液和6 µL 5 M NaCl，总体积为56 µL。在95 °C下煮沸15分钟，加入5–10 µL 3 M NaOAc（pH 5），然后使用PCR纯化柱进行纯化。通过测量260 nm处的吸光度测定DNA浓度，并对各样品进行标准化。随后进入步骤7.5进行下拉实验。
      注意：多余的裂解液可快速冷冻于 -80 °C 保存以备后续使用，但新鲜裂解液效果最佳。若需冷冻，避免反复冻融，裂解液冻融次数不应超过一次。
  5. 下拉
    1. 将适量的蛋白裂解液转移至新的离心管中。如果使用Farnham裂解缓冲液，则用2.1倍体积的免疫沉淀稀释缓冲液（见上文）进行稀释。
    2. 留出100 µL上清液作为输入对照，4 °C保存至次日。
    3. 将第7.3.8步中的磁珠/抗体偶联物加入样本中。
    4. 在4 °C下旋转孵育样品过夜，并确保1.5 mL离心管中有足够的液体体积以利于转动。
  6. 洗涤与洗脱
    1. 过夜旋转孵育后，保留上清液作为非结合组分。随后用免疫沉淀稀释缓冲液洗涤磁珠3至5次。
    2. 在室温下配制不含抑制剂的免疫沉淀洗脱缓冲液。
    3. 用50 µL洗脱缓冲液在67 °C下涡旋振荡15 min以洗脱复合物。将洗脱液转移至新离心管中，并用另外50 µL洗脱缓冲液重复洗脱一次。合并两次洗脱液，共得100 µL洗脱液。
      注意：如果此洗脱步骤中背景过高，可在振荡/孵育过程中降低或省略加热步骤。这通常会减少目标蛋白的得率，但可显著降低背景。
  7. 67 °C 下加热以逆转交联 >4 小时
    注意：这对于共免疫沉淀（Co-IP）并非严格必需，但可能有所帮助。
    1. 对于共免疫沉淀实验，为确保目标蛋白之间完全形成二聚体，将洗脱液在SDS-PAGE凝胶上电泳，并按指示以1:1,000稀释度使用抗HA标签或抗Flag标签抗体进行检测。随后继续进行第8步。
    2. 对于ChIP-qPCR，为确保每个CRISPR-dCas9组分的正确定位和靶向，使用柱纯化法对洗脱产物进行纯化，并用10 µL洗脱液洗脱。对纯化后的DNA进行实时定量聚合酶链式反应（qPCR）。本文数据所用引物列于 补充表1然后继续执行步骤8。

8. RNA 提取与定量 PCR

  1. 为研究 CLOuD9 诱导的基因表达变化，首先从对照细胞沉淀和二聚化细胞沉淀中分离并纯化总 RNA。
  2. 通过逆转录17将纯化的 RNA 反转录为互补 DNA（cDNA），并进行 qPCR 分析。引物信息见补充表 1。

9. 染色体构象捕获实验

  1. 为了观察由 CLOuD9 诱导的基因组位点接触频率的变化，进行染色体构象捕获（3C）实验8。
  2. 通过定量实时 PCR，对三个生物学重复样本中的两组重复样本分别定量 3C 连接产物。将样品的 3C 信号以微管蛋白基因座的信号作为参照进行归一化处理。引物信息见补充表 1。

结果

CLOuD9 可诱导 β-珠蛋白启动子与 LCR 之间可逆的染色质成环。 在细胞培养基中添加或去除 ABA，可适当利用 CLOuD9 系统诱导互补的 CSA 与 CSP CLOuD9 构建体之间发生可逆性结合（图 1a）。通过标准的 CRISPR gRNA，可将 CSA 和 CSP 构建体靶向定位至基因组的特定区域（图 1b）。鉴于人类珠蛋白基因座已有大量研究报道，且该区域在发育过程中频繁发生染色体折叠与重排，因此选择该区域以展示 CLOuD9 系统的应用价值。此外，选用 K562 细胞系的原因在于，该细胞系被证实能够持续高水平表达胎儿期的 γ-珠蛋白基因，而非健康成体红系细胞中通常表达的 β-珠蛋白基因。通过使用 K562 细胞，可尝试恢复该细胞系中 β-珠蛋白基因的表达，从而检验 CLOuD9 系统调控基因表达的能力。

在诱导二聚化之前，采用染色质免疫沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）验证了每个CLOuD9组分的准确定位与靶向结合（补充图1）。此外，无论是否存在脱落酸（ABA），通过共免疫沉淀（Co-IP）实验验证了CSA与CSP在配体存在下的二聚化以及在配体缺失时的可逆性（图1c 和 补充图2）。加入ABA 24小时后，在同时表达两种二聚化组分的细胞中，染色体构象捕获技术（3C）检测到β-珠蛋白基因与LCR之间的相互作用增强，而在仅含有两个CSA或CSP构建体的对照组中则未观察到该现象，从而证实了染色质结构变化在靶向位点的特异性（图1c 和 补充图3,4）。构建LCR与β-珠蛋白之间的相互作用并未完全取代内源性的LCR-珠蛋白接触，而是叠加于原有的相互作用之上，这与先前报道一致8。无论靶向区域位于LCR或β-珠蛋白启动子区的具体位置如何，在二聚化持续72小时内均可观察到β-珠蛋白/LCR相互作用的增加（补充图5,6）。最后，通过移除ABA后进行3C实验，证实了该系统的可逆性，结果显示内源性染色体构象完全恢复（图1d 和 补充图3-6）。

我们考虑到，在K562细胞中观察到的成功结果可能是由于珠蛋白基因座位于常染色质区域所致图1d），因此采用第二种细胞系来探究这一设想。将CLOuD9系统应用于HEK 293T细胞中处于异染色质状态且不表达珠蛋白基因的区域（图1e）。结果与在K562细胞中观察到的相似；经ABA处理24小时后，通过3C检测到更多的β-珠蛋白LCR关联图1e 和 补充图3)，表明CLOuD9具有强大的功能稳健性，能够在不同的细胞环境中发挥作用，而不论其原始的染色质状态或构象如何。

为验证CLOuD9的广泛适用性，还检测了其他基因位点，包括293T细胞中的Oct4启动子及一个远端5'增强子。此前，该细胞系中未检测到Oct4表达，且未报道存在内源性染色质相互作用。由于已有研究发现，在胚胎干细胞中，Oct4的表达与其远端5'增强子的接触有关，且在β-珠蛋白位点也观察到类似结果18，因此开展了本实验。在CLOuD9激活的细胞中检测到Oct4远端增强子与启动子之间的相互作用，而在对照细胞中则未检测到该相互作用（图1f）。此外，还观察到Oct4启动子与远端5'增强子的相互作用进一步促使3'增强子与Oct4启动子发生接触。该现象与已有证据一致，即在内源性基因激活过程中，3'增强子会与Oct4启动子/5'远端增强子复合物发生相互作用10。

CLOuD9 在基因位点处诱导产生特定于环境的改变。 在确认 CLOuD9 系统确实可在基因位点处诱导染色体接触后，我们进一步探究这些染色质环对基因表达的影响。已有文献报道，珠蛋白基因和 Oct4 基因的转录分别依赖于 LCR 与珠蛋白基因位点之间、远端 5' 增强子与 Oct4 启动子之间的相互作用1,11。因此，我们假设，利用 CLOuD9 系统驱动上述每个区域形成染色质环，将导致显著的基因表达变化。

在两个位点中，RT-qPCR 结果显示，ABA 诱导的染色质环在 293T 细胞中促进了 Oct4 表达水平的升高，在 K562 细胞中促进了 β-globin 表达水平的升高，但在 293T 细胞中未观察到 β-globin 表达的增加图2a）。尽管在细胞培养中添加 ABA 仅 24 小时即可显著增加 β-珠蛋白的表达，但其表达水平在 72 小时内持续稳定上升，且在洗去 ABA 后该效应可逆。图2a）。除对照组外，所有K562细胞均呈现这一趋势，无论二聚化组件位于LCR还是β-珠蛋白启动子区域的哪个位置（图2a 和 补充图 7、8). 支持这些发现的是，在K562和293T细胞中，β-珠蛋白基因座处H3K4me3和RNA聚合酶II的ChIP-qPCR结果与观察到的转录变化一致图 2c- f).

CLOuD9 可建立稳定的染色质环结构。 尽管 CLOuD9 介导的短期成环效应符合预期，但长期诱导成环是否产生差异性影响仍有待观察。为此，将细胞在脱落酸（ABA）存在条件下培养 10 天。结果显示，与对照组相比，K562 细胞和 293T 细胞中 β-珠蛋白基因座与 LCR 之间的染色质接触频率均有所增加（图 3a、b 及 补充图 9,10），但 β-珠蛋白表达水平的改变仅在 K562 细胞中被观察到（图 3c）。有趣的是，在转录显著上调的 K562 细胞中，长期二聚化所诱导的染色质结构变化不再可逆（图 3a 及 补充图 9-11）；而在 293T 细胞中，尽管长期二聚化未引起转录变化，其所诱导的染色质接触改变仍具有可逆性（图 3b 及 补充图 9）。

总体而言，在去除 ABA 10 天后，基因表达仅出现轻微下降，但仍显著高于二聚化前的基因表达水平图3c）。与此一致，与对照组相比，在去除ABA 10天后，K562细胞（而非293T细胞）在β-珠蛋白位点处显示出H3K4me3和RNA Pol-II的持续性改变（通过ChIP-qPCR检测）。图 3d- f因此，我们的结果表明，染色质环的稳定性意味着更持久的基因表达。

CRISPR dCas9 实验方法示意图、基因编辑时间线、交联图、K562、293T。
图 1：CLOuD9 诱导可逆的 β-珠蛋白启动子-LCR 成环。 (a) 添加脱落酸（ABA，绿色）使两个互补的 CLOuD9 构建体（CLOuD9 S. pyogenes（CSP），CLOuD9 S. aureus（CSA），分别为红色和蓝色）靠近，重塑染色质结构；去除 ABA 后可恢复内源性染色质构象。 (b) CLOuD9 构建体结合了来自 S. aureus 和 S. pyogenes 的 CRISPR-dCas9 技术以及可逆二聚化的 PYL1 和 ABI1 结构域。 (c) CLOuD9 二聚化实验的时间线。 (d) 3C 实验检测 K562 细胞在 ABA 处理 24 小时（红色）及随后洗脱（蓝色）后 β-珠蛋白位点范围内的交联频率，显示诱导的 β-珠蛋白/LCR 相互作用具有可逆性（灰色高亮区域）。橙色箭头指示特定 CLOuD9 构建体靶向区域。以包含 LCR 超敏位点 1-4 的 EcoRI 片段（黑色条形）作为锚定区域，检测其与其他指定 EcoRI 片段（图顶部标注名称）的交联频率。图底部展示了人类 β-珠蛋白基因和 LCR 超敏位点及其染色体位置坐标。H3K4me3 和 H3K9me3 的 ChIP-seq 数据表明，该区域在 K562 细胞中为常染色质状态。 (e) 尽管 H3K4me3 和 H3K9me3 ChIP-seq 数据显示珠蛋白区域在 HEK 293T 细胞中为异染色质状态，但仍观察到类似的染色质结构可逆性变化。 (f) 3C 实验检测 293T 细胞在 ABA 处理 72 小时（红色）后 Oct4 位点范围内的交联频率，显示诱导的 Oct4/远端增强子相互作用（灰色高亮区域）。橙色箭头指示特定 CLOuD9 构建体靶向区域。以包含 Oct4 启动子的 MboI 片段（黑色条形）作为锚定区域，检测其与其他指定 MboI 片段（图顶部标注名称）的交联频率。图底部展示了人类 Oct4 区域及其染色体位置坐标。所有 3C 实验结果均来自至少三次独立实验。3C 数据以 tubulin 为归一化对照。对于 β-珠蛋白，将锚定片段与包含 β/HS 片段的区域之间的相互作用频率设为零；对于 Oct4，将锚定片段与 Oct4 相互作用区域外的阴性对照片段之间的相互作用频率设为零。误差线表示标准差（s.d.），n=3。本图改编自 Morgan, Stefanie L., et al.9 中的 图 1。请点击此处查看该图的放大版本。

基因表达分析；qPCR结果；图表与示意图；β-globin, Oct4, H3K4me3, Pol-II
图2CLOuD9 引发基因表达和染色质状态的环境特异性改变。（a）CLOuD9 在 β-珠蛋白位点诱导染色质成环，导致 K562 细胞中 β-珠蛋白表达可逆性激活，但在 293T 细胞中无此效应。显著性相对于对照处理细胞给出。双尾 t 检验 t- 测试 *P<0.05, t = 3.418，df = 5；***P<0.0001, t = 10.42，df = 5；n.s.，无显著性差异。误差条表示标准差。 n = 3. (b) 在CLOuD9诱导的同一基因座成环后，观察到293T细胞中Oct4表达的诱导。显著性相对于对照处理细胞给出。双尾t检验 t-测试 *P<0.05, t = 4.562，df = 2。误差线表示标准差。 (c) β-珠蛋白基因体上ChIP-qPCR引物位置示意图 （d，e） ChIP-qPCR 显示，在 CLOuD9 介导的染色质成环后，K562 细胞中 β-珠蛋白位点的 H3K4me3 发生可逆性改变，而在 293T 细胞中则无此变化。双尾学生 t 检验 t-测试 *P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001。误差线表示标准差。 (f) CLOuD9介导的K562细胞中β-珠蛋白转录改变与整个β-珠蛋白基因区域RNA聚合酶II占据率的增加相对应。双尾t检验 t- 测试 *P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001。误差线表示标准差。该图已根据 图2 in Morgan, Stefanie L., 等.9. 请点击此处以查看此图的放大版本。

ABA 洗脱后 K562 和 293T 细胞中基因表达与交联的 ChIP-qPCR 分析。
图 3：CLOuD9 建立稳定的染色质环，可在长期二聚化后维持强烈的基因表达。(a,b) 3C 实验表明，在 K562 细胞中，CLOuD9 诱导的染色质成环在 ABA 处理 10 天后变为不可逆，即使去除 ABA 长达额外 10 天仍持续存在；而在 293T 细胞中则未观察到该现象。所有 3C 结果均来自至少三次独立实验。3C 数据以微管蛋白（tubulin）为归一化对照，并将锚定片段与包含 β/HS 片段之间的相互作用频率设为零。误差线表示标准差（s.d.），n = 3。(c) 在 K562 细胞中，成环稳定化导致 β-珠蛋白的表达持续存在，即使在 ABA 洗脱 10 天后仍维持表达；而在 293T 细胞中未观察到 β-珠蛋白表达的变化。显著性相对于对照处理细胞给出。双尾学生 t 检验 ***P<0.0001，t = 5.963，df = 5；n.s. 无显著差异。(d) ChIP-qPCR 显示，在 K562 细胞中，CLOuD9 诱导成环后 β-珠蛋白位点处 H3K4me3 修饰水平升高，并在配体洗脱 10 天后仍维持该升高状态。双尾学生 t 检验 *P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001。(e) 通过 ChIP-qPCR 检测，在 293T 细胞中长期二聚化后未观察到 H3K4me3 信号的显著改变。(f) 在 K562 细胞中，长期成环诱导后 β-珠蛋白位点处 RNA 聚合酶 II（Pol-II）的占据增加，并在配体洗脱 10 天后仍维持较高水平。双尾学生 t 检验 *P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001。所有误差线均表示标准差（s.d.）。本图改编自 Morgan, Stefanie L., et al.9 中的 图 3。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：CLOuD9载体定位于其预期靶向区域。 染色质免疫沉淀及针对CLOuD9构建体的定量PCR结果表明，其可正确靶向至预期的基因组位点。该图已根据 补充图1 in Morgan, Stefanie L., 等.9. 请点击此处下载该图片。

补充图2：CLOuD9构建体在ABA处理下可逆性结合。 共免疫沉淀实验表明，在使用 ABA 处理 72 小时后，dCas9 蛋白之间的相互作用在随后的 72 小时配体洗脱后被逆转。该图已修改自 补充图2 in Morgan, Stefanie L., 等.9. 请点击此处下载该图片。

补充图3：对照处理未引起染色质接触的变化。 使用DMSO（一种对照试剂）处理24小时后，无论在K562细胞还是HEK 293T细胞中，通过3C实验均未检测到内源性染色质构象发生改变。3C数值经tubulin归一化处理，锚定片段与包含β/HS片段的区域之间的相互作用频率被设定为零。误差线表示标准差（SD），n = 3。本图改编自Morgan, Stefanie L., et al.9中的补充图3。请点击此处下载该图。

补充图4：对照CLOuD9转导细胞中染色质成环未发生改变。 将两个CLOuD9构建体分别靶向LCR或β-珠蛋白启动子后，经ABA处理与对照处理相比，通过3C检测未观察到染色质结构的显著变化。3C数据经tubulin归一化处理，锚定片段与包含β/HS片段的区域之间的相互作用频率被设定为零。误差线表示标准差（SD），n = 3。该图已修改自 补充图4 in Morgan, Stefanie L., 等.9. 请点击此处下载该图片。

补充图5：CLOuD9染色质成环在二聚化72小时后仍可逆。 K562细胞中的3C实验表明，在ABA处理72小时后，CLOuD9诱导的β-珠蛋白/LCR相互作用具有可逆性。3C数值经tubulin归一化处理，锚定片段与包含β/HS片段的区域之间的相互作用频率被设定为零。误差线表示标准差（SD），n = 3。该图经修改自 补充图5 in Morgan, Stefanie L., 等.9. 请点击此处下载该图片。

补充图6：CLOuD9诱导的β-珠蛋白/LCR成环不受珠蛋白靶位点影响。 将CSA和CSP构建体靶向LCR或β-珠蛋白启动子的不同区域，经72小时ABA处理后，在3C检测中均引起类似的可逆性成环变化。3C数据经微管蛋白（tubulin）归一化处理，锚定片段与包含β/HS片段的区域之间的相互作用频率被设定为零。误差线表示标准差（SD），n = 3。该图改编自 补充图6 in Morgan, Stefanie L., 等.9. 请点击此处下载该图片。

补充图7：无论珠蛋白靶位点如何，CLOuD9诱导的基因表达改变均可持续存在。 将CSA和CSP构建体靶向β-珠蛋白启动子和LCR的不同区域，在二聚化72小时后对基因表达的诱导无影响。然而，在长期（10天）二聚化后，尽管观察到对基因表达强度存在一定程度的影响，但在随后去除配体并继续培养额外10天后，相对于对照处理细胞，β-珠蛋白的表达水平仍维持在较高水平。显著性分析以对照处理细胞为参照。**p < 0.001，t = 10.25，df = 5；***p < 0.0001，从左到右 t = 8.697，df = 6，t = 40.31，df = 7；n.s. 为不显著。所有误差线均表示标准差（SD）。该图已修改自 补充图7 in Morgan, Stefanie L., 等.9. 请点击此处下载该图片。

补充图8：对照CLOuD9转导细胞中β-珠蛋白表达无变化。 将两个CLOuD9构建体分别靶向LCR或β-珠蛋白启动子后，与对照处理相比，在ABA处理后β-珠蛋白表达无显著变化。显著性相对于对照处理细胞给出。n.s. 表示无显著性差异。该图已修改自 补充图8 in Morgan, Stefanie L., 等.9. 请点击此处下载该图片。

补充图9：长期对照处理未引起染色质相互作用的变化。 使用DMSO（对照试剂）处理10天后，通过3C方法检测发现K562细胞和HEK 293T细胞中的内源性染色质构象均未发生改变。3C数据经tubulin归一化处理，锚定片段与包含β/HS片段区域之间的相互作用频率被设定为零。误差线表示标准差（SD），n = 3。该图已修改自 补充图9 in Morgan, Stefanie L., 等.9. 请点击此处下载该图片。

补充图 10：长期 CLOuD9 诱导的 β-珠蛋白/LCR 成环不受珠蛋白靶位点的影响。 将 CSA 和 CSP 构建体靶向 LCR 或 β-珠蛋白启动子的不同区域，均可在 ABA 处理 10 天并随后洗脱配体 10 天后，产生相似的持续成环效应，这一点通过 3C 实验得以证实。3C 数据以微管蛋白（tubulin）为内参进行归一化处理，并将锚定片段与包含 β/HS 片段的区域之间的相互作用频率设为零。误差线表示标准差（SD）。n = 3。本图改编自 Morgan, Stefanie L., et al.9 中的 补充图 10。请点击此处下载该图。

补充图11：CLOuD9构建体在长期ABA处理下发生不可逆结合。 共免疫沉淀实验显示，在经过10天ABA处理及随后10天配体洗脱后，CSA和CSP dCas9蛋白仍存在不可逆结合。该图已修改自 补充图11 in Morgan, Stefanie L., 等.9. 请点击此处下载该图片。

补充表1：gRNA、qRT-PCR、3C和ChIP qPCR引物序列列表 此表格经修改自 补充表1 in Morgan, Stefanie L., 等.9. 请点击此处下载此表格

讨论

CLOuD9染色质成环实验中最关键的步骤包括：1）设计或使用正确的gRNA，2）每天更换CLOuD9转导细胞的培养基，其中需含有ABA或DMSO，3）保持ABA的新鲜度，以及4）对染色质构象进行准确且细致的评估。

CLOuD9 技术的主要局限性在于设计针对目标区域的向导序列的能力。向导 RNA 负责将 dCas9 组分定位至待二聚化的靶 DNA 区域，其效率取决于特定的靶位点。若缺乏适当的 gRNA 组分，CLOuD9 系统将无法形成可逆诱导的染色质环。因此，针对每个感兴趣区域设计多个向导，并将这些向导分布在 250–1000 bp 的范围内，可确保至少有一个向导有效。向导的位置对于获得准确结果也至关重要。应避免将向导设计在转录因子结合位点或其他关键功能区域，以防止产生转录上调或下调等背景效应。此外，CLOuD9 构建体的精确插入位置可能轻微影响靶基因的转录水平。这进一步强调了针对每个靶区域需测试多对向导的重要性，以筛选出实验中最有效的向导组合。此外，在每一对靶区域中，CSA 构建体应使用针对 S. aureus 的 gRNA 进行靶向，而 CSP 构建体应使用针对 S. pyogenes 的 gRNA 进行靶向，以确保靶向特异性。

为了确保结果准确并实现正确的二聚化，转导CLOuD9构建体后维持细胞环境的新鲜性也至关重要。每天更换培养基并添加新鲜的二聚化诱导剂（或对照）可确保互补的构建体保持邻近状态，从而维持染色质构象的改变。此外，必须确保ABA试剂新鲜，并按照生产商的说明妥善保存（开封不超过6个月、低温保存、避光），这是获得真实可靠结果的关键。

值得注意的是，CLOuD9所使用的ABA二聚化诱导剂是与ABI和PYL二聚化蛋白联用，而非更常用的FRB和FKBP系统。由于雷帕霉素类似物（rapalog）对癌细胞具有毒性，若采用FRB/FKBP系统将限制CLOuD9的应用。而替代性的ABI/PYL系统克服了这一限制，从而有效提高了CLOuD9的广泛适用性。

综上所述，我们开发了CLOuD9技术，这是一种独特且稳健的方法，能够强制但可逆地在基因组长距离靶位点之间建立联系。通过诱导染色质成环，我们还证明CLOuD9可在适当的细胞环境中用于调控基因表达。该技术具有良好的适应性，可不受限制地研究任意两个基因组位点之间的相互作用，而无需预先了解成环区域或成环机制。此外，CLOuD9所展现出的独特可逆性，使其能够进一步探究疾病与发育过程中的染色质成环机制。尽管染色质成环的靶向效应已得到明确证实，但目前尚无数据揭示脱靶成环的影响及其对靶向成环的后续作用。

我们的数据仅展示了该工具的少数应用，但揭示了一个核心理念：染色质的排列方式能够反映基因表达状态。我们的技术可用于研究并揭示染色质结构在基因调控中的细微特征，从而加深对染色质折叠在基因转录过程中所起作用的整体理解。对转录动态复杂性的更深入认识，将有助于推动癌症、遗传性疾病和先天性疾病的科研与治疗，因为在这些疾病中，染色质组装的显著改变无疑会影响基因表达20,21,22,23。未来利用CLOuD9技术的进一步研究，将阐明染色质结构域的组织方式与动态变化，以及这些因素如何驱动染色质折叠，以在发育和疾病过程中维持稳定的基因表达。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 H. Chang、T. Oro、S. Tavazoie、R. Flynn、P. Batista、E. Calo 以及整个 Wang 实验室在技术方面提供的支持以及对本文稿的审阅。S.L.M. 的研究工作得到了美国国家科学基金会研究生奖学金（NSFGRF，编号 DGE-114747）、美国国防部国家防御科学与工程研究生奖学金（NDSEGF，编号 FA9550-11-C-0028）以及美国国家癌症研究所（编号 1F99CA222541-01）的支持。K.C.W. 获得了伯勒斯·威康基金医学科学家职业奖的资助，同时也是 Donald E. 和 Delia B. Baxter 基金会的教职学者。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RPMI 1640  培养基Life Technologies11875-119用于 K562 细胞培养
DMEM 培养基Life Technologies11995-0651X，用于 293T 细胞培养
lentiCRISPR v2Addgene 质粒#52961用于 CLOuD9 质粒构建
pRSV-RevAddgene 质粒#12253用于慢病毒生产
pMD2.GAddgene 质粒#12259用于慢病毒生产
pMDLg/pRREAddgene 质粒#12251用于慢病毒生产
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668-019用于慢病毒生产
抗 HA 抗体Cell Signaling3724用于免疫沉淀
抗 Flag 抗体SigmaF1804用于免疫沉淀
DNeasy 血液与组织试剂盒Qiagen69504用于 DNA 提取
TRIzolLife Technologies15596-018用于 RNA 提取
RNeasy 试剂盒Qiagen74106用于 RNA 提取
Superscript VILOLife Technologies11754-050用于 cDNA 
SYBR Green I MasterMixRoche4707516001用于 qPCR 分析
Light Cycler 480IIRoche用于 qPCR 分析
抗 H3K4me3 抗体AbCamab8580用于 ChIP-qPCR
抗 RNA Pol-II 抗体Active Motif61083用于 ChIP-qPCR
无 EDTA 蛋白酶抑制剂Roche11873580001用于蛋白质提取
4-12% Tris 甘氨酸凝胶Biorad任意规格，用于 Western 印迹
抗兔 HRP 抗体Santa Cruzsc-2030用于 Western 印迹
抗鼠 HRP 抗体Cell Signaling7076S用于 Western 印迹
K562 和 H3K293 ChIP-Seq 数据EncodeENCSR000AKU用于 ChIP-seq 分析
K562 和 H3K293 ChIP-Seq 数据EncodeENCSR000APE用于 ChIP-seq 分析
K562 和 H3K293 ChIP-Seq 数据EncodeENCSR000FCJ用于 ChIP-seq 分析
K562 和 H3K293 ChIP-Seq 数据GEOGSM1479215用于 ChIP-seq 分析
用于免疫沉淀的 Dynabeads Protein AThermo Fisher Scientific10001D用于免疫沉淀
用于免疫沉淀的 Dynabeads Protein GThermo Fisher Scientific10004D用于免疫沉淀
RNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchR1015用于 RNA 纯化
Pierce 16% 无甲醇甲醛Thermo Fisher Scientific28908用于交联
PX458 质粒Addgene48138推荐用于 gRNA 克隆的活性 Cas9 质粒，但任何具有活性的 Cas9 质粒均可使用
QIAquick PCR 纯化试剂盒Qiagen28104用于 PCR 产物纯化
FastDigest BsmBIThermo Fisher ScientificFD0454用于克隆向导 RNA
FastAPThermo Fisher ScientificEF0651用于克隆向导 RNA
10X FastDigest 缓冲液Thermo Fisher ScientificB64用于克隆向导 RNA
QIAquick 凝胶回收试剂盒Qiagen28704用于克隆向导 RNA
10X T4 连接酶缓冲液NEBB0202S用于克隆向导 RNA
T4 PNKNEBM0201S用于克隆向导 RNA
2X Quick Ligase 缓冲液NEBB2200S用于克隆向导 RNA
Quick LigaseNEBM2200S用于克隆向导 RNA
缓冲液
Farnham 裂解缓冲液含 1% Tris-Cl pH 8.0、1% SDS、1% 蛋白酶抑制剂水溶液（不含 EDTA）和 1 mM EDTA 的水溶液
改良 RIPA 缓冲液含 1% NP40/Igepal、0.5% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS、1 mM EDTA 和 1% 蛋白酶抑制剂水溶液（不含 EDTA）的 PBS 缓冲液（pH 7.8 或 7.4）
免疫沉淀稀释缓冲液含 0.01% SDS、1.1% Triton-X 100、1.2 mM EDTA、16.7 mM Tris-HCl pH 8.0、167 mM NaCl 和 0.1x 蛋白酶抑制剂
洗涤缓冲液含 100 mM Tris pH 9、100 mM LiCl、1% NP-40 和 1% 脱氧胆酸钠
膨胀缓冲液含 0.1 M Tris pH 7.5、10 mM 醋酸钾、15 mM 醋酸镁和 1% NP-40
稀释缓冲液含 0.01% SDS、1.1% Triton X-100、1.2 mM EDTA、16.7 mM Tris pH 8 和 167 mM NaCl
免疫沉淀洗脱缓冲液含 1% SDS 和 10% NaHCO3  

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