深部真皮注射作为模型 白色念珠菌 用于组织学分析的皮肤感染

摘要

本文介绍了一种在白色念珠菌（Candida albicans）皮内注射后对皮肤样本进行组织学和分子分析的实验方案。该方案可保持皮肤结构的完整性，便于定位组织驻留或新募集的免疫细胞，以及病原体的分布情况。

摘要

皮肤是人体一个极为延展的器官，由于其表面积巨大，皮肤持续暴露于各种微生物之中。皮肤损伤很容易导致真皮层感染，进而可能引发病原体扩散至血液。了解免疫系统如何在感染早期阶段对抗病原体，以及宿主如何清除这些病原体，是为未来治疗干预奠定基础的重要一步。本文描述了一种Candida albicans感染模型，可用于可视化感染早期发生的过程，包括病原体穿透上皮屏障的阶段，以及由C. albicans侵入所引发的免疫反应。我们利用该感染模型进行组织学分析，以显示浸润皮肤的免疫细胞，以及病原体的存在与定位情况。感染后采集的样本可用于RNA提取处理。

引言

人体表面覆盖着数量极多的微生物。皮肤表面每平方厘米栖息着近一百万细菌¹。然而，这一数字并未反映出定植于皮肤的微生物的全部多样性。除了细菌外，人体还定植有多种真菌，包括C. albicans，该真菌能够在黏膜和皮肤水平均存活²。

近年来，被诊断出患有真菌感染的人数比例大幅增加。这主要是由于免疫功能低下人群的数量增多所致。 即，HIV 阳性患者以及接受过化疗或移植后使用免疫抑制药物的患者³在美国进行的一项监测研究中，Wisplinghoff 等 表明9.5%的医院内血流感染是由 假丝酵母 物种⁴由于真菌感染的发生率不断上升，尤其是由于其较高的百分比 假丝酵母 在血流感染中发现的物种，了解该病原体如何逃逸免疫系统的控制极为重要。

C. albicans 是一种双相型真菌，可根据环境条件以不同的形态形式生长，如酵母相、芽生孢子、假菌丝和菌丝相⁵。在菌丝相状态下，C. albicans 表现出最强的侵袭能力，并具有穿透上皮组织的能力^6<....

方案

所有实验程序均经波士顿儿童医院儿童医院动物资源部（ARCH）动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并在其监督下进行；或由意大利卫生部批准，并在米兰比可卡大学动物护理委员会的监督下实施。

1. C. albicans 的制备

1. 在含有丰富培养基（酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YEPD），1% (w/v) 酵母提取物，2% (w/v) 蛋白胨，2% (w/v) 葡萄糖）并补充尿苷（50 mg/L）的试管中，于 25 °C 培养 C. albicans 菌株 CAF3-1¹³。在此条件下，C. albicans 以酵母形式生长。
   注意：也可使用其他 C. albicans 菌株，例如临床分离株 C. albicans 菌株 SC5314¹³。由于我们最近已证明溃疡过程是由先天免疫系统的激活所诱导的¹⁴，理论上，任何保持其细胞壁组分与结构完整，并具有形成菌丝突起能力的 C. albicans 菌株均可使用。
2. 使用细胞计数分析仪计数细胞浓度，监测培养物生长情况。
3. 当培养物浓度达到约 8 x 10⁶ 个细胞/mL 时收集培养物。或者，可使用分光光度....

结果

通过将病原体直接注射到深层真皮，组织的结构形态保持完整（图1A）。

皮肤结构完整性的维持有助于检测免疫细胞并确定其在感染部位的定位。图1B 所示的更高倍镜下观察显示，脓肿主要由多形核白细胞（PMCs）构成，这些细胞通过将病原体限制在感染部位来阻止其扩散。多形核白细胞（如中性粒细胞）的募集促进了脓肿的形成，从而防止真菌在组织内扩散¹⁴。更高倍镜下（图1C、D）可见，脓肿周围区域也富含多形核白细胞。

通过保持组织结构的完整性，可以确定病原体在感染过程中的定位。利用C. a.......

讨论

在此我们描述了一种方法 C. albicans 感染以研究真菌进入真皮深层后引发的炎症过程。

尽管在白色念珠菌（C. albicans）感染过程中皮肤脓肿的形成相对罕见¹⁵，但将真菌直接注射至深层真皮层不仅可研究真菌诱导的脓肿形成过程，还能分析参与限制真菌扩散的特定免疫细胞。通过本文所述方法，可在避免机械损伤或伤口形成所引发的炎症反应的前提下，研究免疫细胞之间的相互作用，以及对控制真菌扩散具有重要作用的免疫细胞的募集过程。事实上，保持表皮结构完整，对于避免因机械刺激（如擦伤）引发的炎症环境至关重要。正如Polly Matzinger于1994年首次提出的“危险理论”所述¹⁶，损伤信号确实能够激活免疫反应，从而强烈影响病原体所诱发的免疫应答。

损伤相关分子模式（DAMPs）可来源于死亡细胞，也可在应激条件下释放。由于这些信号可在组织损伤情况下产生，因此即使在尚未发生感染时，伤口的形成也会导致过度炎.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
PBS	Euroclone	ECB4053L	使用前在 37 °C 水浴中预热
H-OCT 包埋剂	histo-line laboratories	R0030
Gill 苏木精染液	histo-line laboratories	09-178-2
醇溶伊红 Y 溶液	histo-line laboratories	09-209-05
无水乙醇	scharlau	ET00232500
柠檬酸组织透明剂（Citro-HISTOCLEAR）	histo-line laboratories	R0050
Eukitt 封片介质	bio-optica
丙酮	sigma-aldrich	179124
PAS 染色试剂盒	sigma-aldrich	395B-1KT
胰蛋白胨（Bacto Peptone）	BD	211677
酵母提取物（Bacto Yeast Extract）	BD	212750
分子生物学级无水 D(+)-葡萄糖	Applichem PanReac	50-99-7
尿苷（Uridine）	Merck Millipore	8451
HEPES	Applichem PanReac	A1070,0500
2 mL 带盖离心管（Safe-Lock tubes）	eppendorf	30121597
TRIzol 试剂	Life Technologies	15596018	有毒、具腐蚀性且为致突变物。使用时需采取一切必要防护措施
RNeasy Mini 试剂盒	QIAGEN	74104
液氮			佩戴眼部防护装备
仪器
库尔特计数器（Coulter Counter-Particle Count）	Beckman Coulter
5415 R 离心机	eppendorf
MC 3000 冷冻切片机	histo-line laboratories
TissueLyser 组织研磨仪	QIAGEN
材料
0.3 ml 胰岛素注射器，配 30G × 8 mm 针头	BD	324826
手术镊
手术剪
一次性底模（Base mould disposable）	histo-line laboratories	2781
带正电荷的生物显微镜载玻片	bio-optica	09-2000
盖玻片 24 × 50 mm	thermo scientific	11911998