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方法文章

深部真皮注射作为模型 白色念珠菌 用于组织学分析的皮肤感染

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DOI：

10.3791/57574

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2018年6月13日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology and Biosciences, University of Milano-Bicocca, 2Harvard Medical School and Division of Gastroenterology, Boston Children's Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种在白色念珠菌（Candida albicans）皮内注射后对皮肤样本进行组织学和分子分析的实验方案。该方案可保持皮肤结构的完整性，便于定位组织驻留或新募集的免疫细胞，以及病原体的分布情况。

摘要

皮肤是人体一个极为延展的器官，由于其表面积巨大，皮肤持续暴露于各种微生物之中。皮肤损伤很容易导致真皮层感染，进而可能引发病原体扩散至血液。了解免疫系统如何在感染早期阶段对抗病原体，以及宿主如何清除这些病原体，是为未来治疗干预奠定基础的重要一步。本文描述了一种Candida albicans感染模型，可用于可视化感染早期发生的过程，包括病原体穿透上皮屏障的阶段，以及由C. albicans侵入所引发的免疫反应。我们利用该感染模型进行组织学分析，以显示浸润皮肤的免疫细胞，以及病原体的存在与定位情况。感染后采集的样本可用于RNA提取处理。

引言

人体表面覆盖着数量极多的微生物。皮肤表面每平方厘米栖息着近一百万细菌1。然而，这一数字并未反映出定植于皮肤的微生物的全部多样性。除了细菌外，人体还定植有多种真菌，包括C. albicans，该真菌能够在黏膜和皮肤水平均存活2。

近年来，被诊断出患有真菌感染的人数比例大幅增加。这主要是由于免疫功能低下人群的数量增多所致。 即，HIV 阳性患者以及接受过化疗或移植后使用免疫抑制药物的患者3在美国进行的一项监测研究中，Wisplinghoff 等 表明9.5%的医院内血流感染是由 假丝酵母 物种4由于真菌感染的发生率不断上升，尤其是由于其较高的百分比 假丝酵母 在血流感染中发现的物种，了解该病原体如何逃逸免疫系统的控制极为重要。

C. albicans 是一种双相型真菌，可根据环境条件以不同的形态形式生长，如酵母相、芽生孢子、假菌丝和菌丝相5。在菌丝相状态下，C. albicans 表现出最强的侵袭能力，并具有穿透上皮组织的能力6。

C. albicans 通过多种实验方法对感染进行了研究。最常见的感染模型是静脉注射 C. albicans 酵母7然而，该模型并未考虑真菌扩散至血液之前所发生的全部过程。另一种模型则利用了 C. albicans 侵入上皮。该方法也称为砂纸模型8由 Gaspari 开发 等 1998年9，并通过使用砂纸摩擦皮肤以去除表层 角质层 在应用之前 C. albicans该方法可使真菌侵入上皮组织，从而能够分析该病原体的侵袭能力。最后，其他用于胃肠道感染的模型10 和呼吸道11 已在不同的研究中被使用。

伤口的形成（如砂纸模型中所示）会激活多条信号通路，包括免疫细胞的募集与活化，以促进愈合过程12。这可能会改变或掩盖针对病原体特异性引发的免疫反应，从而导致结果混杂。

本文介绍了一种避免初始伤口形成以及基底炎症环境诱导的皮肤感染方法。为了保持上皮结构的完整性，我们直接将白色念珠菌（C. albicans）的菌丝形态注射至深层真皮。尽管单次注射可能引发轻度炎症，但与砂纸损伤模型中开放性伤口的形成相比，其炎症程度有限且局限。本文所述方法可在避免机械损伤所致过度及预先存在炎症环境的前提下，用于研究真菌感染及其扩散过程中的免疫应答。

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方案

所有实验程序均经波士顿儿童医院儿童医院动物资源部（ARCH）动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并在其监督下进行；或由意大利卫生部批准，并在米兰比可卡大学动物护理委员会的监督下实施。

1. C. albicans 的制备

  1. 在含有丰富培养基（酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YEPD），1% (w/v) 酵母提取物，2% (w/v) 蛋白胨，2% (w/v) 葡萄糖）并补充尿苷（50 mg/L）的试管中，于 25 °C 培养 C. albicans 菌株 CAF3-113。在此条件下，C. albicans 以酵母形式生长。
    注意：也可使用其他 C. albicans 菌株，例如临床分离株 C. albicans 菌株 SC531413。由于我们最近已证明溃疡过程是由先天免疫系统的激活所诱导的14，理论上，任何保持其细胞壁组分与结构完整，并具有形成菌丝突起能力的 C. albicans 菌株均可使用。
  2. 使用细胞计数分析仪计数细胞浓度，监测培养物生长情况。
  3. 当培养物浓度达到约 8 x 106 个细胞/mL 时收集培养物。或者，可使用分光光度计测定 OD600。
    注意：通常，OD600 = 1 对应于约 3 x 107 个酵母细胞/mL，但建议进行滴定校准。
  4. 将培养物重悬于含尿苷的 YEPD 培养基中，并以 HEPES（50 mM，pH 7.5）作为缓冲剂，在 37 °C 下孵育以诱导菌丝形成。在显微镜下以 100 倍放大观察菌丝形成情况。培养于 37 °C 约 5 小时后可见菌丝形成；然而，建议在 37 °C 孵育 16 小时后使用细胞，此时菌丝比例接近培养物总数的 95%。
  5. 为进一步提高菌丝浓度，取培养物等分试样在 3,300 x g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于无菌 PBS 中，浓度为 1 x 108 条菌丝/mL。

2. 深层真皮注射

  1. 感染操作前24小时，通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（80 - 100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉，然后使用电动剪刀剃除小鼠侧腹部的毛发。
    注意：任何涉及麻醉的操作后，应将小鼠置于加热灯下，直至其完全恢复。
  2. 让小鼠休息24小时，以避免因剃毛过程引起炎症。
  3. 剃毛操作24小时后，通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（80 - 100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉。
  4. 检查小鼠足垫反射，以确认其处于深度麻醉状态。通过用力捏压足垫来评估反射反应。若麻醉成功，动物无痛觉且不发生移动。
  5. 使用0.3 mL胰岛素注射器（配备30 G × 8 mm针头）将C. albicans菌丝以每注射点50 µL的终体积注入真皮深层，相当于每注射点含5 × 106条菌丝。
    1. 用两根手指拉紧已剃毛侧腹的皮肤，以便将液体直接注入真皮深层。进针时针头与皮肤呈10 - 15°角，针尖斜面朝上。
    2. 采用此角度，病原体将被注入约300 - 500 µm的深度。为确保注射操作正确，应观察到注射部位形成隆起，该隆起在注射后数分钟内逐渐被吸收。
      注意：注射后形成的隆起面积约为1 cm2。此区域将在预定时间点被切除，用于分子或组织学分析。
    3. 对于少于24小时的时间点（推荐），应使用记号笔标记感染区域，因为注射形成的隆起仅持续数分钟，随后即被吸收。对于24小时或更长时间点，此步骤无需执行，因为此时将出现明显可见的溃疡或囊肿。

3. 组织学染色样品的采集与制备

  1. 根据机构规定的程序对小鼠实施安乐死。
  2. 使用手术镊夹住已用记号笔标记的注射部位边缘的皮肤，用手术剪沿标记线剪下感染部位。
    注意：请小心使用圆头剪刀将皮肤与腹膜分离。
  3. 将皮肤组织放入盛有最佳切割温度（OCT）包埋剂的一次性底模中，使皮肤内侧朝上。将样本浸入液氮中，直至包埋剂变为白色。在样本完全冻结前，切勿让液氮淹没样本，否则会损坏样本。
    注意：警告！在步骤3.3中，需佩戴面罩以防止液氮溅伤。
  4. 若样本不立即用于切片制备，应迅速保存于-80 °C条件下。
    注意：样本可在-80 °C长期保存。

4. 载玻片的制备

  1. 从样本中心开始，将样本切成两半，以制备用于组织学的切片。
  2. 使用冷冻切片机切出厚度为 5-µm 的切片。
    注意：对于皮肤样本，冷冻切片机的温度不应高于 -25 °C。温度过高会导致 H-OCT 部分融化，从而在切片过程中无法保持样本的正确位置。
  3. 使用带正电荷的载玻片收集切片。
  4. 若制备的切片未立即使用，应将其储存在 -20 °C。在此条件下，切片可于 -20 °C 长期保存。

5. 苏木精 & 伊红染色

  1. 将切片浸入吉氏苏木精染液中染色 4 分钟。用流动的自来水冲洗切片 5 分钟。
  2. 将切片浸入伊红 Y 溶液中染色 1 分钟。用流动的自来水冲洗切片 5 分钟。在继续后续操作前，用蒸馏水漂洗切片。
  3. 依次浸入浓度递增的乙醇溶液（50%、70%、80%、95%、100%）中进行脱水。每种乙醇溶液中浸泡 15 秒。
  4. 将切片浸入组织学透明剂中至少透明 2 分钟。
  5. 使用封片剂和盖玻片对切片进行封片。
  6. 使用显微镜切片扫描仪以 40X 放大倍数获取切片图像。

6. 过碘酸-雪夫（PAS）染色

  1. 用浓度 ≥99.5% 的丙酮在室温下固定载玻片，持续 1 分钟。随后用流动的自来水冲洗载玻片 1 分钟。
  2. 将载玻片浸入过碘酸溶液（1 g/dL）中染色 5 分钟。用三次蒸馏水更换洗涤载玻片。
  3. 将载玻片浸入希夫试剂（Schiff's reagent）中染色 15 分钟。用流动的自来水冲洗载玻片 5 分钟。
  4. 将载玻片浸入吉氏苏木精（Gill's hematoxylin）中染色 5 分钟。用流动的自来水冲洗载玻片 30 秒。
  5. 将载玻片浸入三次 100% 乙醇中进行脱水，每次浸泡 15 秒。
  6. 将载玻片浸入组织学透明剂中至少透明 2 分钟。
  7. 使用封片介质和盖玻片对载玻片进行封片。
  8. 使用显微镜载玻片扫描仪采集载玻片的图像。

7. RNA 提取的样品采集与制备

  1. 根据机构规定的程序处死小鼠。按照步骤 3.2 取出皮肤样本。
  2. 将样本浸入含有 1 mL 酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取试剂的 2 mL 带盖离心管中。
    注意：此步骤可暂停，样本可在 -80 °C 下保存。
  3. 使用手术镊子将样本切成约 0.2 cm2 的小块。
    注意：小心！用于 RNA 分离的大多数试剂具有毒性和致突变性。步骤 7.3 和 7.4 必须 在通风橱内操作。
  4. 使用珠磨机以每秒 20 次振荡的速度研磨样本 20 分钟。也可使用机械匀浆器替代。
  5. 通过观察是否存在完整的皮肤组织碎片来检查样本是否充分匀浆。若样本未完全均质化，需重复此步骤。
  6. 将样本在 16,000 x g 条件下离心 1 分钟。保留上清液用于 RNA 提取，弃去沉淀。此步骤旨在去除可能堵塞提取柱的毛发和碎片。
  7. 使用 RNA 纯化柱进行 RNA 提取14。
  8. 使用分光光度计检测 RNA 的纯度和浓度。若 RNA 提取物不立即用于 cDNA 合成，请将样本储存在 -80 °C。

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结果

通过将病原体直接注射到深层真皮，组织的结构形态保持完整（图1A）。

皮肤结构完整性的维持有助于检测免疫细胞并确定其在感染部位的定位。图1B 所示的更高倍镜下观察显示，脓肿主要由多形核白细胞（PMCs）构成，这些细胞通过将病原体限制在感染部位来阻止其扩散。多形核白细胞（如中性粒细胞）的募集促进了脓肿的形成，从而防止真菌在组织内扩散14。更高倍镜下（图1C、D）可见，脓肿周围区域也富含多形核白细胞。

通过保持组织结构的完整性，可以确定病原体在感染过程中的定位。利用C. a...

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讨论

在此我们描述了一种方法 C. albicans 感染以研究真菌进入真皮深层后引发的炎症过程。

尽管在白色念珠菌（C. albicans）感染过程中皮肤脓肿的形成相对罕见15，但将真菌直接注射至深层真皮层不仅可研究真菌诱导的脓肿形成过程，还能分析参与限制真菌扩散的特定免疫细胞。通过本文所述方法，可在避免机械损伤或伤口形成所引发的炎症反应的前提下，研究免疫细胞之间的相互作用，以及对控制真菌扩散具有重要作用的免疫细胞的募集过程。事实上，保持表皮结构完整，对于避免因机械刺激（如擦伤）引发的炎症环境至关重要。正如Polly Matzinger于1994年首次提出的“危险理论”所述16，损伤信号确实能够激活免疫反应，从而强烈影响病原体所诱发的免疫应答。

损伤相关分子模式（DAMPs）可来源于死亡细胞，也可在应激条件下释放。由于这些信号可在组织损伤情况下产生，因此即使在尚未发生感染时，伤口的形成也会导致过度炎...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

FG 获得了意大利癌症研究协会（Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro，IG 2016Id.18842）、Cariplo 基金会（资助号 2014-0655）以及伦巴第生物医学研究基金会（Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica，FRRB）的支持。
IZ 获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助 1R01AI121066-01A1、1R01DK115217、HDDC P30 DK034854 资助、哈佛医学院 Milton 基金、克罗恩病与结肠炎基金会（CCFA）高级研究奖（412708）、Eleanor 和 Miles Shore 50 周年奖学金项目以及 Cariplo 基金会（2014-0859）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
PBSEurocloneECB4053L使用前在 37 °C 水浴中预热
H-OCT 包埋剂histo-line laboratoriesR0030
Gill 苏木精染液histo-line laboratories09-178-2
醇溶伊红 Y 溶液histo-line laboratories09-209-05
无水乙醇scharlauET00232500
柠檬酸组织透明剂（Citro-HISTOCLEAR）histo-line laboratoriesR0050
Eukitt 封片介质bio-optica
丙酮sigma-aldrich179124
PAS 染色试剂盒sigma-aldrich395B-1KT
胰蛋白胨（Bacto Peptone）BD211677
酵母提取物（Bacto Yeast Extract）BD212750
分子生物学级无水 D(+)-葡萄糖Applichem PanReac50-99-7
尿苷（Uridine）Merck Millipore8451
HEPESApplichem PanReacA1070,0500
2 mL 带盖离心管（Safe-Lock tubes）eppendorf30121597
TRIzol 试剂Life Technologies15596018有毒、具腐蚀性且为致突变物。使用时需采取一切必要防护措施
RNeasy Mini 试剂盒QIAGEN74104
液氮佩戴眼部防护装备
仪器
库尔特计数器（Coulter Counter-Particle Count）Beckman Coulter
5415 R 离心机eppendorf
MC 3000 冷冻切片机histo-line laboratories
TissueLyser 组织研磨仪QIAGEN
材料
0.3 ml 胰岛素注射器，配 30G × 8 mm 针头 BD324826
手术镊
手术剪
一次性底模（Base mould disposable）histo-line laboratories2781
带正电荷的生物显微镜载玻片bio-optica09-2000
盖玻片 24 × 50 mmthermo scientific11911998

参考文献

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