静脉内和羊膜腔内 子宫内 小鼠模型中的移植

摘要

我们描述了一种用于执行的实验方案 在子宫内 通过静脉和羊膜内注射途径在小鼠模型中进行宫内移植（IUT）。该方案可用于将细胞、病毒载体及其他物质导入具有独特免疫耐受性的胎儿环境中。

摘要

在子宫内 宫内移植（IUT）是一种独特且多用途的治疗方法，可用于在妊娠早期引入干细胞、病毒载体或任何其他物质。IUT用于治疗的理论基础在于胎儿体积小、免疫系统尚未成熟、胎儿干细胞或前体细胞具有可及性和增殖能力，以及在出生前治疗疾病或阻止症状出现的潜力。利用胎儿这些正常的发育特性，可实现造血干细胞（HSC）的递送 通过 宫内造血干细胞移植（IUT）有望治疗镰状细胞病等先天性血液系统疾病，且无需出生后造血干细胞移植所必需的清髓性或免疫抑制性预处理。类似地，由于发育过程中多个器官中前体细胞易于接近，宫内移植病毒载体进行基因治疗或基因组编辑时，可能更高效地靶向干细胞/前体细胞。此外，IUT还可用于研究包括免疫耐受形成在内的正常发育过程。小鼠模型为理解IUT的潜力与局限性提供了经济且有效的手段，有助于在开展大型动物临床前研究及最终临床应用之前积累必要知识。本文描述了一种通过静脉和羊膜内途径在小鼠胎儿中实施宫内移植的实验方案。该方案已成功用于阐明相关必要条件及作用机制 在子宫内 造血干细胞移植，耐受诱导，以及 在子宫内 基因治疗

引言

产前筛查与诊断技术的最新进展揭示了在产前治疗多种先天性疾病的可能性，这些疾病在出生后缺乏有效的治疗手段，并会导致显著的发病率和死亡率。具体而言，in utero 造血干细胞移植（IUHCT）以及基因治疗/基因组编辑技术可利用胎儿正常的发育特性，比出生后的造血干细胞移植和基因治疗/基因组编辑更高效地治疗先天性血液、免疫及遗传性疾病^1,2。具体来说，由于胎儿体积较小，可按受体体重最大化供体细胞或病毒载体的剂量。此外，胎儿免疫系统尚未成熟，使得供体造血干细胞可在无需清髓性和免疫抑制性预处理的条件下进行移植，而这类预处理在出生后移植方案中是必需的。同样，携带治疗性转基因或基因组编辑工具的病毒载体也可在无显著免疫反应的情况下注射，从而避免对转基因产物或病毒载体本身产生限制性免疫应答。最后，胎儿干细胞/祖细胞易于接近且具有高度增殖能力，使得靶向祖细胞的转导效率更高，并有利于某些依赖细胞周期的基因组编辑方式（如同源定向修复）高效进行。小鼠模型作为一种深入且经济的研究手段，可在开展临床前大动物模型实验之前，用于解答干细胞生物学与免疫学中的关键问题，因此一直是研究 IUHCT 和 in utero 基因治疗的主要模型系统^1,2,

方案

实验方案已获得费城儿童医院机构动物照护与使用委员会的批准。

1. 注射移液管的制备

1. 使用垂直微量移液器拉制仪，拉制一支100 µL的微毛细移液管（图 1A - 1C）。校准微量移液器拉制仪，使拉制出的锥形末端为 > 1 厘米长。
   注意：最初应调整拉制仪的参数以获得最佳长度。较高的加热设置会使尖端更长，较高的拉力设置会使尖端直径更窄。
2. 将锥形末端剪裁至长度≥1 cm。确保针尖处的内径在70 µm至100 µm之间，且与锥形末端的长度成反比。
   注意：内径还取决于微电极拉制仪的校准情况。请参阅垂直微电极拉制仪或任何其他所选类型微电极拉制仪制造商提供的使用说明。
3. 在确保针头具有正确内径后，使用带金刚石磨轮的微管斜面仪将针尖磨出15 - 20度的斜面。图 2A - 2C）。确保将尖端轻轻靠在轮子上，避免施加过大压力，以降低尖端断裂或开裂的风险。
   注意：可使用画笔刷去针尖上积聚的任何碎屑。
4. 在显微镜下评估尖端，确保尖端呈圆形，无任何缺损或裂纹。重新评估内径，确保其在70 µm至100 µm之间（....

结果

存活与植入是评估宫内造血干细胞移植（IUHCT）实验成功与否的重要指标。根据实验具体终点的不同，接受 IUHCT 的胎儿可通过剖宫产进行产前分析，或在出生后进行分析。静脉注射后的平均存活率范围为 75 - 100%。羊膜内注射的存活率通常优于静脉注射，约为 85 - 100%。

在我们的实验室中，掌握这些技术的培训过程大约需要8至12个月。为了评估培训人员是否已获得可重复执行此类注射所需的技术能力，我们通过在宫内移植（IUT）后较短时间点监测胎儿存活率和供体细胞植入情况来对其进行考核。以下质量控制实验即展示了该评估方法。具体而言，1 × 10⁶⁷ 从C57BL/6TgN(act-EGFP)OsbY01（“B6 GFP”）小鼠中按先前所述方法分离全骨髓细胞⁵ 并进行注射 通过 将细胞注射至妊娠第14天的Balb/c胎鼠的卵黄静脉中。其中一组由经验丰富的指导教师进行宫内.......

讨论

子宫内移植是治疗许多在妊娠早期即可诊断的先天性疾病的潜在疗法。小鼠的子宫内移植模型可让研究人员探索胎儿环境，或尝试不同的治疗方法。根据注射物质及靶向部位的不同，经静脉或经羊膜腔的子宫内移植可将注射物可靠地递送至目标区域。

在靶向特定器官时，选择合适的胚胎发育时期以及注射技术至关重要。虽然在E14时期进行静脉注射最适合靶向造血微环境，而在E16时期进行羊膜腔内注射最适合肺部靶向，但这些并非唯一可选方案。例如，在超声引导下，早在E8时期即可对胚胎进行羊膜腔内注射⁸。在E9至E10时期，通过超声引导的心内注射也可实现E14之前的系统性递送¹¹。在胚胎发育的不同阶段实施注射的可行性，为研究基因转移和细胞移植的安全性与效率，以及探讨发育生物学中的基础科学问题，提供了广阔的研究潜力。

此外，除了静脉内和羊膜腔内给药途径外，还可根据治疗目的或所研究的科学问题选择其他靶向部位。在体 肌内注射方法.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
手套	Cardinal Health	2D73DP65
带齿Adson镊	Fine Science Tools	11027-12
无齿Adson镊	Fine Science Tools	11006-12
弯头剪刀	Fine Science Tools	14075-11
粗剪刀	Fine Science Tools	14002-13
持针器	Fine Science Tools	12005-15
Vicryl 2.0	Ethicon	JB945
移液管	Medline	GSI135010
棉签	Medline	MDS202000
50 mL 锥形管	Fischer Scientific	14-432-22
胶带	3M	1527-1
眼用润滑剂	Major LubriFresh	0904-6488
加热垫	K&H	3060
体视显微镜	Leica	MZ16
注射器	Narishige	HI01PK01
玻璃毛细管	Kimble	71900-100
垂直微量移液器拉制仪	Sutter Instruments	P-30
微电极斜面研磨仪	Sutter Instruments	BV-10
IM-300 气动微量注射器	Narishige	IM-300
胰岛素注射器	BD	305935
滤器	Genesee Scientific	25-244
Compac5 麻醉机	VetEquip Compac5	901812
异氟烷	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
N2 气体	Airgas	NI 125
O2 气体	Airgas	OX 125
Ad-GFP 病毒载体	Penn Vector Core	H5'.040.CMV.eGFP