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利用血管环张力测定法测量小鼠肠系膜动脉的等长收缩力

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DOI：

10.3791/58064

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2018年8月20日

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1Model Animal Research Center and MOE Key Laboratory of Model Animal and Disease Study, Nanjing University, 2School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine

本文内容

摘要

血管环张力测定技术用于研究血管平滑肌功能并筛选新药。本文报道了一种详细方案，用于测定小鼠肠系膜动脉的等长收缩力，并用于筛选血管平滑肌新的舒张剂。

摘要

血管环张力测定技术用于评估血管平滑肌在去极化、G蛋白偶联受体激动剂/抑制剂及药物作用下的收缩性. 它在多种关于血管平滑肌生理功能、高血压等血管疾病发病机制以及平滑肌松弛药物开发的研究中被广泛应用。小鼠是一种广泛使用的模式动物，具有大量疾病模型和基因修饰品系。本文详细介绍了用于测定小鼠肠系膜动脉等长收缩的方法。分离一段1.4 mm长的小鼠肠系膜阻力动脉，将两根钢丝穿入其管腔并固定于肌动图装置的腔室中。经过平衡和标准化步骤后，采用高K⁺溶液对血管段进行预刺激+ 在进行收缩实验前，用该溶液冲洗两次。作为该方法在药物开发中应用的一个示例，我们测定了从中药莲子胚芽中分离得到的一种新型天然物质——新莲心碱的舒张作用。莲（Nelumbo nucifera） Gaertn.) 对小鼠肠系膜动脉的作用。安装在肌动图腔室中的血管段用高K⁺溶液进行刺激。+ 溶液。当张力达到稳定持续阶段后，逐步累积加入新莲心碱。我们发现新莲心碱对平滑肌收缩具有剂量依赖性的舒张作用，提示其可能具有抗高血压的活性。此外，血管段在安装后至少可存活4小时，并维持由高钾诱导的收缩功能。+ 我们建议，对于需要多次更换溶液的耗时药物筛选过程，可采用血管环张力测定系统。

引言

本实验所用的小血管肌动描记系统用于测量内径在100至400 µm范围内的小阻力血管的等长收缩。将分离出的小血管（长约2 mm）穿入两根直径为40 µm的金属丝，随后依次固定在微米侧和换能器侧的夹具上。该肌动描记技术最早于1972年提出1，随后主要由Mulvany及其同事进一步发展2,3,4,5,6。目前该技术已趋于成熟，设备稳定，操作简便，并具有标准化的归一化流程7,8,9。我们对该方法进行了部分改进，用于小鼠肠系膜动脉的测量。

血管平滑肌几乎分布于所有血管的管壁中，其基本功能是通过收缩对各种刺激产生力学响应。血管平滑肌正常的收缩功能对于血压调节和营养供应至关重要10。血压调节异常可导致多种疾病，包括高血压、心力衰竭和缺血。 多项研究表明，血压异常通常与血管平滑肌收缩功能障碍密切相关7,11,12,13。肌张力测量法可用于研究由血管收缩剂、抑制剂和药物等多种刺激诱导的小鼠血管等长收缩功能。成功测定血管收缩反应将有助于阐明血压维持的机制、血管平滑肌相关疾病的发病机制，并探索新的治疗策略。

许多中草药已广泛用于血管性疾病的临床治疗，但其有效成分通常尚不明确。因此，分离和鉴定有效成分对于新药研发具有重要意义。多丝肌动图技术为筛选中草药中的活性成分提供了一种简便的方法。我们已报道了多项利用小血管肌动图系统研究小鼠肠系膜动脉收缩的研究，并鉴定了具有抗高血压活性的天然化合物12,13,14。本文中，我们详细描述了肌动图方法的操作流程，并评估了从莲子胚芽（Nelumbo nucifera Gaertn.）中分离得到的去甲莲心碱（neoliensinine）的舒张血管作用14。

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方案

动物操作已获得南京大学模式动物研究所机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 溶液配制

  1. 使用 137.0 mM NaCl、2.7 mM KCl、1.8 mM CaCl2、1 mM MgCl2∙6H2O、5.6 mM D-葡萄糖和 10 mM HEPES 配制 HEPES-Tyrode 溶液（H-T），pH 值为 7.3–7.4。
  2. 使用 140.6 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2∙6H2O、5.6 mM D-葡萄糖和 10 mM HEPES 配制无钙 HEPES-Tyrode 溶液（Ca2+-free H-T），pH 值为 7.3–7.4。
  3. 使用 15.7 mM NaCl、124.0 mM KCl、1.8 mM CaCl2、1 mM MgCl2∙6H2O、5.6 mM D-葡萄糖和 10 mM HEPES 配制含 124 mM KCl 的 HEPES-Tyrode 溶液（高 K+），pH 值为 7.3–7.4。

2. 实验准备

  1. 使用 37 °C 水浴预热 H-T 和 High-K+ 溶液。
  2. 打开肌动描记系统、数据采集硬件和计算机。
  3. 小心地向每个肌动描记室中加入 5 mL 的 H-T 溶液。
  4. 分别在两个培养皿中加入 20 mL 的 4 °C H-T 溶液和无 Ca2+ 的 H-T 溶液，并置于冰上保存。
  5. 在一个 10 cm 的包被培养皿中加入 20 mL H-T 溶液，并在室温下维持。

3. 小鼠肠系膜动脉分离

  1. 通过颈椎脱位法处死一只8至12周龄的C57BL/6J雌性或雄性小鼠。将小鼠固定，使其腹部朝上。
  2. 用70%乙醇润湿腹部。然后用剪刀沿腹侧中线从腹股沟开始剪开皮肤，并从第一条切口起始处分别向下在两侧向腿部做切口。将两侧皮肤向后拉开；以类似方式切开腹膜。
  3. 使用剪刀剪断食管、结肠及其他结缔组织，将胃肠道及其供血血管完全从体内分离出来。
  4. 用镊子将分离的组织段转移至步骤2.4中准备好的含冷H-T溶液的培养皿中，并在H-T溶液中轻轻冲洗数次，以去除血液。
  5. 将分离的组织段转移至步骤2.5中准备好的包被培养皿中，在室温下进行肠系膜动脉解剖。
  6. 顺时针方向展平胃、空肠、回肠和盲肠，并分别将胃和盲肠固定在左侧和右侧。
  7. 拉伸肠系膜血管床，并用大头针固定肠道，以暴露待解剖的肠系膜动脉。
    注意：在此状态下，动脉位于静脉上方。
  8. 打开体视显微镜的透射光源，在显微镜下进行动脉解剖。确保整个组织完全浸没在溶液中。
  9. 用镊子夹住动脉周围的脂肪组织，使用解剖剪剪除所有结缔组织以分离动脉。注意避免损伤动脉。

4. 动脉安装

  1. 将肠系膜动脉树转移并浸入冷的 Ca2+用镊子夹住多余的动脉，以无H-T溶液（在步骤2.4中配制）冲洗。
  2. 在肠壁近端的肠系膜弓处截取一段1.4 mm的动脉，用两把镊子小心打开该动脉段的两侧。
  3. 准备两段长度为2.5 cm的不锈钢丝，并将其放入同一培养皿中。
  4. 用镊子轻轻夹住动脉的一端，在另一把镊子的辅助下，将两根导线依次小心插入动脉管腔内。确保导线保持平直，且不接触血管内皮。
  5. 使用两把镊子同时夹住螺纹血管外部的两根钢丝，小心地将血管从培养皿转移至预先充满H-T溶液的肌动图仪腔室（步骤2.3）。
  6. 将夹子的钳口拧开以留出安装空间。用两把镊子分别夹住两根插入导线中的一根的两端，并将血管置于钳口间隙中（图1A).
  7. 将夹紧的导线两端缠绕在与千分尺相连的颚部螺丝上图1B).
  8. 用右手镊子将导线拉直，然后顺时针旋转固定右侧螺丝。图1C确保容器始终位于钳口间隙内，但不要触碰钳口，以免造成损坏。
  9. 使用千分尺闭合两个钳口图1D确保两个夹爪足够接近但不相互接触，且未固定的导线位于已固定导线的上方。
  10. 使用右手镊子，小心地将连接到力传感器的下颌角处未拧紧的导线折叠，并顺时针缠绕在右侧螺钉上图1E）。然后拧紧螺丝。在导线左侧重复此步骤，并拧紧左侧螺丝（图1F).
  11. 通过小心旋转千分尺，将钳口略微分开图1G）。避免拉伸血管。使用镊子将微米计侧的钢丝移动至与传感器侧钢丝处于同一水平面。小心旋转微米计，使两侧钳口之间的间隙恰好能容纳两根钢丝。
  12. 重复步骤 4.2 – 4.11，将动脉安装到其他腔室中。将所有腔室连接至设备，盖上腔室盖，接通 100% 氧气供应并连接温度探头，开始加热至 37 °C。打开记录软件并按下 开始 按钮 图表视图 开始录制窗口。
  13. 平衡约 20 分钟。

5. 归一化

注意：为了标准化实验条件并获得血管可靠的生理反应性，必须进行归一化处理。15根据血管的活性收缩力与内周长之间的关系， wire myograph 系统具有标准的归一化程序，用于评估所安装血管的内周长（IC）。5,8,9简而言之，为计算 IC（µm），读取显微测微计的数值，并将该值作为 X 值输入，同时输入换能器输出的力， 即， 静息壁张力（mN/mm）作为Y值。程序将返回一条（X，Y）拟合曲线，并计算对应于100 mmHg跨壁压的IC（IC100）。将血管设定至归一化的内周长（IC1当主动响应性达到最大时。

  1. 将设备上所有通道的力设为零，并再平衡1-2分钟。
  2. 从“DMT菜单”中选择归一化设置，并按如下方式设置参数：
    目镜校准（mm/div）：0.36；目标压力（kPa）：13.3；IC1/IC100：0.9；在线平均时间（秒）：2；延迟时间（秒）：60。点击确定按钮关闭DMT归一化设置窗口。
  3. 从DMT菜单中选择感兴趣的通道，以打开对应通道的DMT归一化窗口。按如下方式在窗口中输入常数值：组织端点a1：0.1；组织端点a2：4；钢丝直径（µm）：40。窗口将显示计算出的血管长度为1.40 mm。
  4. 读取相应组织腔室的千分尺数值。将该值输入到千分尺读数框中，然后点击添加点按钮。此值即为X的初始值（X0）。经过60秒延迟时间后，窗口将显示与此千分尺读数相对应的力和有效压力（ERTP）。同时，千分尺读数框将变为可用状态。
  5. 通过逆时针旋转千分尺来拉伸正在归一化的血管。将千分尺读数输入到千分尺读数框中，然后点击添加点按钮。再次等待60秒的延迟时间。
  6. 重复步骤5.5，继续拉伸血管，并持续添加千分尺读数，直至窗口显示“千分尺X1”的数值，该值即为将血管拉伸至其IC1所需的计算千分尺设定值。
  7. 将千分尺设定为X1 值。
    注：归一化张力通常为1-2 mN。

6. 动脉收缩记录

注意：本节中使用的所有溶液，包括 H-T 溶液和 High-K+ 溶液，均在步骤 2.1 中配制。

  1. 归一化后，将血管在浴槽中平衡 15–20 分钟。
    注意：此步骤无需更换溶液。
  2. 用高 K+ 溶液对血管进行两次刺激。
    1. 刺激时，用 5 mL 高 K+ 溶液替换 H-T 溶液，诱导血管收缩 10 分钟，随后用 5 mL H-T 溶液冲洗 3–4 次。
      注意：典型的收缩反应最大张力应超过 3 mN，持续张力稳定在约 2.5 mN12。若第一次刺激产生的最大张力低于 2.5 mN，或持续张力随时间下降，或第二次刺激的张力显著低于第一次，则该血管应弃用，不再用于后续实验。
  3. 加入 5 mL 高 K+ 溶液刺激血管以诱导收缩。5 分钟后，向浴槽中加入 0.5 µL 新莲心碱储备液（10 mM，溶于 DMSO）14，使终浓度达到 1 µM，以诱导血管舒张。
  4. 当张力稳定后（通常需数分钟），再次向浴槽中加入 0.5 µL 新莲心碱储备液，使浓度升至 2 µM。随后每次加入 1 µL 储备液，使浓度依次升至 4、6、8 和 10 µM，以绘制剂量-反应曲线。
    注意：不同药物的储备液浓度和工作浓度可能不同。

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结果

我们采用多丝肌动图系统测量了小鼠肠系膜动脉的等长收缩力，并评估了从莲子胚芽中纯化的去甲莲心碱的舒张作用莲（Nelumbo nucifera） Gaertn.)14小鼠肠系膜阻力动脉被分离，清除结缔组织后切成1.4 mm长的血管段。将血管段插入两根钢丝中，置于含Ca2+-无H-T溶液的培养皿中，然后将该组织段固定在肌张力测定室的两个夹具上（图2A）。安装片段后，将两根导线调整至相互平行，靠近但不接触。图2B）。在进行力测量之前，血管段先经过高钾溶液两次校正和增强处理+ 溶液以稳定血管。在标准化过程中，血管被多次拉伸，直至达到IC值100, 每个拉伸周期均包含一次强烈的收缩、快速的舒张以及持续60秒的力维持（图3）。高钾诱导的血管平滑肌收缩+ 溶液...

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讨论

高血压是一种常见的公共卫生挑战，因其可导致严重并发症，包括心血管疾病和肾脏疾病16。阐明高血压的发病机制并探索更多抗高血压药物已成为该领域的紧迫任务。血压的产生和维持依赖于循环系统的外周阻力。根据泊肃叶定律（Poiseuille's Law），较小的动脉产生大部分循环阻力，是血压形成的主要来源3,10。因此，相较于大动脉，对小阻力动脉的研究更适用于血压相关研究。血管张力测定技术（wire myograph technology）是研究小阻力动脉生理功能及血管疾病发病机制的最佳方法之一。

小血管丝状肌动图系统已在其他文献中得到充分记载，本研究采用该系统测量大鼠肠系膜动脉的收缩反应8 以及小鼠动脉（如主动脉）9利用基因操作技术，小鼠已成为多种疾病模型和药物筛选模型中广泛使用的模式动物。因此，本文提供了一种改良的小鼠肠系膜动脉收缩...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢中国苏州大学的何卫启博士和中国西安陕西师范大学的乔艳宁博士提供的技术支持。本研究得到国家自然科学基金（项目编号 31272311、81373295 和 81473420）以及江苏省高校优势学科建设工程资助项目（项目编号 ysxk-2016）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
多丝肌动描记系统DMT610-M
不锈钢丝DMT400447
Geuder 解剖剪DMT400431
Dumont 镊子DMT300413
PowerLab/8SPADInstrumentsML785
软件ADInstrumentsLabChart 5
NaClSigmaAldrichS5886
KClSigmaAldrichP5405
CaCl2SigmaAldrichC4901
MgCl2·6H2OSigmaAldrichM2393
D-葡萄糖SigmaAldrichG6152
HEPESSangon BiotechA100511-0250
NaOHSigmaAldrichS8045
DMSOSigmaAldrichD2650

参考文献

  1. Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents and Actions. 2 (5), 257-260 (1972).
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