用于追踪和成像冷冻固定细胞中病毒蛋白相关结构的关联光镜与电镜显微技术

摘要

采用相关联的光学显微镜与电子显微镜（CLEM）方法，通过电子显微镜（EM）对先前经光学显微镜（LM）筛选出的细胞中病毒诱导产生的细胞内结构进行成像。将LM与EM结合为一种混合成像技术，以实现对病毒与宿主相互作用的整合性观察。

摘要

由于其高分辨率，电子显微镜（EM）是病毒学家不可或缺的工具。然而，通过电子显微镜分析病毒感染或转染细胞时面临的主要困难之一是感染或转染效率较低，从而阻碍了对这些细胞的观察。为克服这一难题，可首先进行光学显微镜（LM）观察，以定位感染或转染的细胞亚群。因此，利用与病毒蛋白融合的荧光蛋白（FPs），在此通过光学显微镜记录表达荧光蛋白、并在带有字母数字编码图案的载物支持物上生长的“阳性转染”细胞的位置。随后，细胞经高压冷冻（HPF）、冷冻置换（FS）和树脂包埋等步骤进一步处理用于电子显微镜分析。超快速冷冻步骤可确保所选细胞的膜结构得到优异保存，从而可在超微结构水平上通过透射电子显微镜（TEM）进行分析。本文提供了一套逐步的光镜-电镜关联显微技术（CLEM）工作流程，详细描述了样品制备、成像及关联过程。该实验设计也可应用于解决多种细胞生物学问题。

引言

将两种显微技术结合以更全面地观察特定生物过程的想法由来已久。早在1960年，就有两篇独立发表的研究首次利用“关联显微技术”对病毒进行了研究^1,2。在该研究中，作者通过两种显微技术分析了腺病毒诱导的细胞核形态变化。第一篇论文报道了利用电子显微镜（EM）观察腺病毒感染相关的形态学细节的结果¹；第二篇论文则将电子显微镜下观察到的不同结构与组织化学染色的光学显微镜（LM）图像进行关联，以确定此前在电子显微镜下观察到的结构的性质²。

然而，在这些早期研究中，他们的观察是利用作为独立实验制备的不同感染细胞进行的。这种“关联”实际上是指结合来自两种成像方式的信息，以理解某一特定现象，通过比较不同检测方法所获得的全部发现，来阐明特定的生物学过程。

如今，相关显微技术（也称为相关光镜与电镜技术，CLEM）正被应用于越来越多的方法中（参见文献^3,4,5的综述），其共同点在于两种成像技术（光镜LM和电镜EM）均在同一份样品上进行。这两种方法的结合从而实现了对样品的多模态、多尺度和多维度分析³。其优势在于，光镜可提供大量不同细胞的广泛概览，有助于在异质性细胞群体中识别出表达特定蛋白或多种目标蛋白的细胞亚群；而电镜则突破了光镜的分辨率限制，能够对特定的细胞内事件提供更高分辨率的图像。此外，电镜还能可视化非荧光性的亚细胞结构背景，包括所有膜包被的细胞器、大型大分子复合物（例如核糖体、中心粒、等）以及细胞骨架成分，从而提供额外的空间信息，即所谓的“参考空间”⁶，为光镜检测到的荧光信号提供结构背景。

近年来，CLEM 不仅成为细胞生物学家的有力工具⁵，也受到病毒学家的广泛关注（参见文献⁷综述），用于研究导致病毒成功增殖的复杂病毒-细胞相互作用。因此，了解病毒如何改造细胞膜和细胞器以利于自身增殖，对于开发抗病毒药物以根除致病性病毒至关重要。

本文描述了一种关联显微技术（CLEM），该方法可通过光镜（LM）检测表达与荧光蛋白（FP）融合的病毒蛋白的细胞。随后对这些细胞进行冷冻固定，并进一步制备用于透射电子显微镜（TEM）的超微结构分析，以深入了解这些蛋白的表达如何重塑细胞内膜结构（图1）。迄今为止，大多数已发表的病毒学研究中的关联显微技术均采用化学固定的细胞^{8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19}。这主要是出于生物安全考虑，需在生物安全二级和三级（BSL-2 和 BSL-3）实验室中对具有感染性的材料进行灭活处理，而这些实验室通常无法进行细胞的冷冻固定。然而，对于需要最佳保存细胞膜结构的研究问题，强烈推荐采用高压冷冻（HPF）实现玻璃态固化²⁰。在此类情况下，可应用本文所述的关联显微技术流程。有趣的是，尤其是在处理具有感染性的样本时，可在先前已通过化学方法灭活的样品上执行高压冷冻，例如在 BSL-2 和 BSL-3 实验室中完成化学灭活后，再进行高压冷冻。化学固定后接高压冷冻的组合方式，能够在一定程度上获得冷冻保存方法的优势^21,22。

图1：通过 CLEM分析细胞的工作流程示意图。 生长在图案化蓝宝石圆片上的细胞首先通过光学显微镜（LM）分析，以定位表达荧光蛋白（FPs）的细胞，随后进行电镜（EM）制样处理。定位后，立即采用高压冷冻（HPF）和冷冻置换（FS）对细胞进行固定，然后包埋于树脂中。树脂聚合完成后，需将细胞生长的支撑材料（即蓝宝石圆片）从树脂块上移除。含有包埋细胞的树脂块被修整为小型梯形，随后用钻石刀对表达荧光蛋白的剩余细胞进行超薄切片。超薄切片收集于载网槽上，再通过透射电子显微镜（TEM）进一步观察，以获得这些细胞的超微结构信息。本图经参考文献²⁹许可改编和修改。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

1. 细胞培养用图案化蓝宝石圆片的制备

1. 将带有字母数字图案的图案化蓝宝石圆片（见材料表）转移至15 mL锥形离心管中，其中图案蚀刻在其一个表面上。
   注意：也可使用无字母数字图案的传统0.05 mm厚蓝宝石圆片，通过在其表面镀碳并覆盖定位网格来创建参考图案。为此，应在施加碳图案前用乙醇清洗蓝宝石圆片。
2. 用乙醇彻底清洗蓝宝石圆片，将其平铺于含有滤纸的培养皿中并使其干燥。使用细长镊子将它们分别放置在玻璃载片上，彼此分开。
3. 使用倒置显微镜（4倍放大）检查每个蓝宝石圆片上的坐标图案是否可读。
   注意：若不可读，可借助镊子翻转蓝宝石圆片。
4. 将蓝宝石圆片存放于培养皿中。
   注意：此步骤可暂停实验流程。

2. 带有图案蓝宝石圆片的细胞培养

1. 使用紫外（UV）交联仪对图案化蓝宝石圆片进行5分钟的灭菌处理。
2. 将蓝宝石圆片转移至细胞培养生物安全柜中。在生物安全柜内用乙醇对长柄镊子进行灭菌。
3. 将细胞培养基（参见材料表）的一半加入细胞培养皿中。用长柄镊子小心地将蓝宝石圆片转移至培养皿中。
4. 将1 × 10⁵个稳定表达T7聚合酶的Huh7-Lunet细胞重悬于另一半培养基中，接种至培养皿中。
   注意：计算接种细胞数量时，应确保实验终点时细胞融合度不超过20–30%。细胞密度过高将影响后续电镜观察时细胞的定位；此外，过度融合可能导致细胞从蓝宝石圆片上脱落。
5. 检查蓝宝石圆片是否仍位于培养皿底部，并通过倒置显微镜确认其上的字母数字坐标仍清晰可读。
   注意：若圆片在培养基中漂浮，可用长柄镊子将其轻压至底部，必要时翻转至正确朝向。
6. 次日按照文献^21,23中所述方法并结合转染试剂生产商的说明书对细胞进行转染。

3. 在图案化蓝宝石圆盘上生长的细胞的显微成像

1. 在实验终点时，将蓝宝石圆片转移至含有 30–50 µL/位点无 pH 指示剂培养基的金属成像板中，以减少非特异性背景荧光。
   注意：此处所述金属板（图 2）由欧洲分子生物学实验室（EMBL）车间设计。若无此类或类似金属板，也可使用玻璃底细胞培养皿进行光镜（LM）观察。重要的是需将常规细胞培养基更换为不含 pH 指示剂的培养基。还需注意避免长时间曝光，因其可能导致光漂白，进而引起活性氧（ROS）积累并对细胞造成生理损伤^24,25。
2. 在倒置宽场荧光显微镜下对细胞进行成像。
   注意：如代表性结果所示，当使用绿色荧光蛋白（GFP）标记的蛋白时，应分别采用 450–490 nm 和 500–550 nm 的激发与发射滤光片。
3. 首先获取细胞的低倍图像（10–20X），以定位表达荧光蛋白（FPs）的细胞。利用微分干涉差（DIC）显微镜记录目标细胞所在图案化蓝宝石圆片的位置坐标。
   注意：拼接多个区域图像有助于更全面地了解目标细胞的位置。此外，此处也可选择性地使用相差显微镜。
4. 对同一细胞/细胞群获取高倍（荧光和 DIC）图像（63–100X，油浸物镜），以更清晰地区分目标蛋白在细胞内空间中的亚细胞定位。
   注意：DIC 图像提供上下文信息，这些信息对于后续将光镜图像与电镜显微照片进行关联分析至关重要，因为利用细胞的“解剖学”标志物可实现更精确的关联。由于部分蓝宝石圆片可能在冷冻固定过程中破裂，强烈建议每种条件准备三份重复样本。此外，在高压冷冻（HPF）及本方案后续步骤中，部分细胞可能从圆片上脱落，而另一些细胞的超微结构可能因冷冻损伤而出现假象。因此，应通过光镜至少对圆片上的两个区域进行成像，以确保最终有足够的细胞可供分析。重要的是，这两个区域应位于圆片的相对两侧，以便将包埋细胞的树脂块切成两半，并分别获取这两个区域的切片。

图2：在图案化蓝宝石圆片上生长的细胞进行LM成像的示意图。（A） 使用精细镊子将蓝宝石圆片转移至成像板上。（B-C） 该成像板由海德堡EMBL车间专门设计，可适配于光学显微镜，使蓝宝石圆片可在不含pH指示剂的细胞培养基中进行成像。该成像板为一块尺寸为75 mm × 25 mm × 1 mm的金属载片，其上使用3 mm钻头铣出四到五个孔，以匹配蓝宝石圆片的尺寸。此外，在每个孔的两侧以90°角铣出小凹槽，便于操作时用镊子夹取圆片。为实现最佳成像条件，在孔的下方使用紫外胶粘附0号玻璃盖玻片（厚度为0.085至0.13 mm），并置于紫外光下固化。（D） 图案化蓝宝石圆片的高倍放大图像，显示其表面刻蚀的字母数字坐标。图案化蓝宝石圆片为市售产品（见材料表）。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 通过高压冷冻技术对生长在图案化蓝宝石圆盘上的细胞进行冷冻固定

1. 将用于高压冷冻（HPF）的“A”和“B”型铝制载具（参见材料表）放入含有经1-十六碳烯浸润的滤纸的培养皿中。将带有细胞的图案化蓝宝石圆片浸入盛有1-十六碳烯的培养皿中。
   注意：轻微移动圆片以洗去细胞培养基。
2. 按照以下方式将蓝宝石圆片夹在HPF样品架中的“A”和“B”型铝制载具之间（图3B）。底部放置“B”型载具，使其平面朝上。将蓝宝石圆片置于该平面上，细胞面朝上。然后在上方添加“A”型载具，使其0.1 mm深度的一面朝向细胞。
   注意：由于图案化蓝宝石圆片比常规蓝宝石圆片更厚，因此需在EMBL车间将市售的“A”型载具（原设计用于非图案化的0.05 mm蓝宝石圆片）在0.2 mm深度的一侧切割至0.05 mm，以便适配HPF样品架（图3A）。为此，将“A”型载具插入金属管末端，使0.2 mm一侧暴露并保持固定以便切割。切割后对该侧面进行打磨，使其表面平整。或者，也可使用专用于图案化蓝宝石圆片上方的特殊铝制载具（可商业获取，参见材料表），此时HPF“三明治”结构仅由蓝宝石圆片和该载具组成。
3. 关闭HPF仪器的样品架并冷冻细胞。
   注意：本方案针对特定型号的HPF仪器。也可使用其他HPF仪器^6,26。无论如何，请注意供应商提供的新一代仪器。
   警告：使用护目镜和听力保护耳机。
4. 将冷冻后的“三明治”结构置于装有液氮的聚苯乙烯盒中进行临时储存。
   警告：佩戴护目镜，并联系当地安全负责人，了解操作液氮时可能存在的危险。
   1. 为避免混淆，将每个“三明治”结构分别放入已编号的0.5 mL微量离心管中（置于聚苯乙烯盒内）。
      注意：本方案可在此暂停。若无法立即进行冷冻置换（FS），样品可储存于带孔的冻存管（顶部打孔）中，放入盒子后置于液氮杜瓦罐的架子上（参见材料表）。该液氮容器应放置在配备氧气传感器的房间内，以防缺氧导致窒息。
      警告：以下所有操作（步骤5和6）必须在生物安全柜中进行。此外，所用大多数试剂具有危害性。使用前必须仔细阅读制造商提供的材料安全数据表（MSDS），并向安全负责人咨询当地操作规范，以确保安全操作。对于这些耗材的正确处置以及下文所述设备的规范使用，还需查阅所在机构的健康与安全规程。

图3：高压冷冻（HPF）过程中将图案化蓝宝石圆盘组装于两个铝制载具之间的示意图。（A）传统“A”载具的剖面图，其较深一侧需从0.2 mm切割至0.05 mm。（B）将表面蚀刻有字母数字图案、厚度为0.16 mm的蓝宝石圆盘组装到两个铝制载具中用于高压冷冻，具体步骤如下：将蓝宝石圆盘放置在“B”载具的平坦面上，细胞面朝上；再将一个切短的“A”载具（其深度为0.1 mm，面向细胞）置于其上，形成封闭的“高压冷冻三明治”结构。铝制载具和图案化蓝宝石圆盘均可商业获取（见材料表）。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 冷冻固定细胞的FS

1. 加注FS仪器（参见 材料清单用液氮冷冻。将温度设置为 -90 °C，并等待仪器达到该温度。
2. 制备含有0.2%四氧化锇（OsO₄）的FS溶液₄)（体积比），0.1% 醋酸铀（UA）（质量体积比）溶于玻璃蒸馏丙酮中，同时使 FS 仪器降温。
   注意：配制（例如）12 mL FS培养基时，将600 µL 4% OsO₄₄在小型玻璃容器中加入0.012 g UA，置于超声波清洗仪中溶解5分钟。用移液管加入11.4 mL玻璃蒸馏丙酮，充分混匀。
3. 用200–500 µL FS培养基填充1.5 mL微量离心管，盖紧管盖后转移至FS仪器中。静置10分钟，使FS培养基冷却。
4. 使用预冷的长镊子将含有细胞的蓝宝石圆盘的冷冻“三明治”转移至液氮中的含FS培养基的管中。
   警告：请使用防冻手套和护目镜。
   注意：在操作过程中，HPF“三明治”结构可能会自发解体。此时，请确保将冷冻的蓝宝石片转移至微量离心管中，铝制载体可丢弃。
5. 按照以下步骤运行FS，直至第二天²⁷：从 -90 °C 升至 -80 °C，持续 8 小时；从 -80 °C 升至 -50 °C，持续 8 小时；从 -50 °C 升至 -20 °C，持续 2 小时；从 -20 °C 升至 0 °C，持续 2 小时。

6. 冻干替代样品的树脂包埋

警告：以下所述所有操作必须在生物安全柜中进行。此外，所使用的大多数试剂均具有危险性。使用前必须仔细阅读生产商提供的材料安全数据表，并咨询安全管理人员有关当地安全规定，以确保安全操作。对于这些使用过的材料的正确处置，以及下述设备的规范使用，还须参照当地机构的健康与安全规程。

1. 从FS机器中取出替代的样品，并将其置于冰上20分钟。
2. 将样品在室温下放置20分钟，然后用玻璃蒸馏丙酮彻底清洗（每次10分钟，共清洗3次）。若FS处理后铝制载体仍留在微量离心管中，需用长镊子将其丢弃。
3. 将细胞（保留在蓝宝石圆片上）用四步环氧树脂系列进行渗透处理：分别在含25%、50%和75%树脂的玻璃蒸馏丙酮溶液中各孵育1小时，随后在100%树脂中过夜孵育。次日更换为新鲜的100%树脂并孵育1小时。
4. 小心地将蓝宝石圆片放入安装在试剂浴中的流通式环内，环内已充满100%树脂。这些环用作10个蓝宝石圆片的聚合模具。
   注意：必须将蓝宝石圆片完全推至底部，且坐标面朝上，确保可清晰读取。可通过连接在通风橱上的双目显微镜进行检查，也可改用生物安全柜内的双目显微镜。重要的是，试剂环底部刻有编号（1-10），有助于样品识别。此外，可在树脂块中加入纸质标签以辅助样品鉴定。
5. 将样品置于烘箱中，在60 °C下聚合48小时。

7. 从聚合树脂块中取出图案化蓝宝石圆片

1. 从烘箱中取出含有细胞的硬质树脂块。
   注意：此处可暂停实验流程。若不暂停，则在切片前让包埋块冷却至室温。
2. 用剃刀片切割包埋模具，以暴露树脂块。使用镊子取出圆柱形树脂块。
   注意：如果在聚合前未将纸质标签放入树脂块中，请使用永久性记号笔对树脂块进行编号，并将其存放于1.5 mL微量离心管中。此处可暂停实验流程。
3. 将含有蓝宝石圆盘的树脂块尖端浸入装有液氮的聚苯乙烯盒中，直至不再产生“气泡”。随后，将树脂块尖端浸入沸腾的H₂O.
4. 根据需要重复前两个步骤，直至蓝宝石圆盘从树脂块上脱落。
   警告：请佩戴护目镜和防冻手套。
   注意：如果此步骤无效，可使用剃刀刀片去除圆片周围部分已聚合的树脂，然后再次尝试。本方案可在此处暂停。

8. 透射电镜用靶向修块与超薄切片

1. 使用超薄切片机的双目显微镜观察树脂块表面，确定目标细胞所在的位置。
   注意：图案化蓝宝石圆盘的坐标图案负像会保留在块面上，从而有助于识别目标细胞所在区域，以便进行定向修块。为便于在块面上找到相同位置，必须将光学显微镜图像垂直翻转。
2. 使用锋利的剃刀将包埋的含有目标细胞的单层细胞修整为一个呈梯形的小型平整金字塔状结构（平均尺寸约为 200 µm × 250 µm）。
3. 使用 35° 金刚石刀对包埋的细胞进行 70 nm 的超薄切片。
4. 借助超细镊子将切片转移至电镜载网槽格上。
   注意：: 应避免使用网状载网，因为切片可能被载网的金属条遮挡。
5. 将载网放入载网盒中保存。
   注意：此步骤可作为暂停点。

9. 超薄切片的透射电子显微镜分析

1. 将载网槽插入透射电子显微镜的样品 holder 中。获取低倍率（概览）图像，使目标细胞的完整细胞轮廓可见。
   注意：: 可通过细胞轮廓以及细胞间的相对位置作为参考，与之前光学显微镜下获得的微分干涉差（DIC）图像进行比对，从而重新定位目标细胞/细胞群。
2. 对目标细胞/细胞群获取高倍率图像，尝试在超微结构水平上识别出与先前光学显微镜观察到的荧光信号相对应的结构特征。
   注意：可在高倍率下获取拼接图像，以获得目标细胞/细胞群的高分辨率整体视图。此外，通常需要连续采集同一细胞的连续超薄切片图像，以便在与荧光图像比对前进行三维重建。

结果

采用本文所述方法（图1），将稳定表达T7-RNA聚合酶的Huh7-Lunet细胞接种于带有图案的蓝宝石圆片上，随后转染表达丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS5A两个结构域并带有GFP标签的质粒（pTM_AH-D1-GFP）（图4）。次日，将生长有细胞的图案化蓝宝石圆片从细胞培养皿中取出，利用光镜（LM）进行成像（图4，图2）。通过细胞质中绿色荧光的存在识别表达AH-D1-GFP的细胞，并记录其在蓝宝石圆片坐标图案中的位置（图5A、图5B）。在完成光镜观察后，立即将含有目标细胞的蓝宝石圆片装配在两个铝制载片之间（图3），并通过高压冷冻（HPF）进行低温固定。随后对细胞进行冷冻置换，并最终包埋于环氧树脂中。

从聚合的树脂块上取下蓝宝石圆盘后，可在树脂块表面观察到字母数字图案的印痕，从而能够找回目标细胞所在区域。随后修去树脂块的其余部分，保留包含目标细胞的小梯形区域。从此梯形区域切取连续超薄切片，收集于电镜载网槽上，并进一步通过透射电子显微镜（TEM）进行分析（图5C）。需要注意的是，尽管手动获取连续超薄切片是可行的²⁸，但该过程耗时耗力，且需要经过良好训练并具备熟练技能的操作人员。此外，在进行此CLEM实验流程时（图5A），细胞密度应保持较低，以确保在LM下先前识别的同一细胞能够被快速定位。否则，若细胞密度过高，将显著延缓在电镜水平成功定位目标细胞的过程。

对表达AH-D1-GFP的目标细胞的多个超薄切片进行透射电镜（TEM）分析（图5D、图5E），结果显示其细胞内存在大量囊泡聚集，这些囊泡形态各异，由单层脂质双分子层与周围细胞质分隔（图5E）。

图4：执行图5所示CLEM示例所遵循的工作流程示意图。 稳定表达T7 RNA聚合酶的Huh7-Lunet细胞被转染了一种DNA质粒，该质粒编码丙型肝炎病毒（HCV）NS5A蛋白的两亲性螺旋（AH）和结构域1（D1），并在其C末端标记了GFP（pTM_AH-D1-GFP）。该NS5A蛋白片段的表达在转录水平上由T7启动子（T7 Pm）调控，在翻译水平上由脑心肌炎病毒（EMCV）的IRES（内部核糖体进入位点）元件调控，后者以二级结构形式表示。转染后24小时（24 hpt），生长在图案化蓝宝石圆片上的表达AH-D1-GFP的细胞通过光镜（LM）检测，并立即进行高压冷冻-冷冻替代（HPF-FS）处理。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：CLEM 实验流程示例。（A） 稳定表达 T7 聚合酶的 Huh7-Lunet 细胞，在转染质粒 pTM_AH-D1-GFP 后 24 小时，通过荧光显微镜分析生长于图案化蓝宝石圆片上的 GFP 阳性细胞。（B） 白色虚线矩形内选定用于 CLEM 分析的单个细胞的高倍放大图像。（C） 同一细胞经高压冷冻（HPF）、冷冻置换（FS）及树脂包埋后，超薄切片的透射电子显微镜（TEM）图像。（D） 含有目标细胞的连续 70 nm 超薄切片在载网 EM 格栅上的示意图。（E） 左侧：目标细胞两个切片的 TEM 概览图；右侧：左侧黄色矩形框选区域的高倍 TEM 图像，显示大量由单层膜与细胞质分隔的囊泡。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文所介绍的用于研究病毒蛋白表达对细胞膜影响的CLEM方法，此前已成功用于阐明丙型肝炎病毒（HCV）复制相关结构，主要是双层膜囊泡（DMVs）²¹，并确定形成这些HCV诱导结构所需的关键组成成分²³。需要注意的是，在我们首次使用CLEM研究HCV复制的论文中²¹，采用的是此处所述方案的一个略微修改版本。在该研究中，使用了传统的厚度为0.05 mm、无字母数字图案的蓝宝石圆片，并通过在其表面覆盖碳层并叠加定位网格的方式创建参考图案（见材料表）。当前方案的这一版本仍可继续使用，其优势在于可直接使用"A"型HPF载具，无需像图3A所示那样进行切割。或者，如方案中所述，也可使用更厚的"A"型载具（见材料表）与带有图案的蓝宝石圆片配合使用，从而无需使用"B"型载具。

有趣的是，该方案不仅可用于研究 BSL-1 样本（例如此处及其他文献中所述的转染病毒蛋白的细胞^19,23），还可用于研究病毒感染的细胞。尽管操作人类病原体通常仅限于 BSL-2 和 BSL-3 实验室，但在某些国家，仍有可能在这些生物安全条件下进行冷冻固定。在因当地法规限制或缺乏高压冷冻仪（HPF）而无法实施玻璃化冷冻的 BSL-2 和 BSL-3 实验室中，若预先使用醛类试剂对病毒感染的细胞进行化学固定（即在离开 BSL-2 或 BSL-3 设施前完成固定），仍可采用本方法进行样品制备。此外，为保留荧光信号，醛类固定后需立即淬灭，其余步骤与本文所述方案完全相同。该技术可能被认为存在重复，因为细胞经历了化学固定和玻璃化冷冻两次固定。然而，与仅接受化学固定的细胞相比，这种双重固定方案确实显著改善了丙型肝炎病毒（HCV）诱导的双层膜囊泡（DMVs）的保存效果²¹。

有关进一步的修改和故障排除，读者可参考本手稿方案部分中的各项说明。这些说明描述了需要避免的常见问题，以及在实施本方法时可能遇到的潜在困难的替代解决方案。

应用该技术的主要要求是具备高压冷冻（HPF）仪。当无法通过高压冷冻对细胞进行冷冻固定（由于缺乏HPF仪器）或无需进行此操作（当膜结构的保存无需达到最佳状态）时，可采用化学固定法，随后进行电镜制样与分析^{8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19}。该方案无需使用蓝宝石载片，但需使用带有网格图案的细胞培养皿，以便重新定位细胞或细胞簇。此类培养皿的主要优势在于其直径大于蓝宝石载片，可实现更大面积表面的筛选。因此，本CLEM方案已成功应用于研究抗病毒化合物对丙型肝炎病毒（HCV）的作用¹⁵ ，或用于可视化诺如病毒非结构蛋白诱导的膜结构重排¹⁹。可能限制该方法应用的另一个问题是缺乏商用的冷冻取代（FS）设备。在此情况下，可使用基本的自制FS系统替代。尽管自动化的FS设备可能减少操作失误，但自制设备同样可成功应用，例如在Kent McDonald³⁰ 和Paul Walther的实验室中即有使用。

关于化学固定，此处所述方案可实现细胞内结构的最佳保存²⁰。因此，若具备上述高压冷冻（HPF）和冷冻替代（FS）设备，则优先推荐对目标细胞进行玻璃化冷冻处理。

未来对这种CLEM方法的改进可能不仅限于在超微结构水平上获取二维信息，还包括获得关于病毒引起的膜和细胞器结构改变的三维信息。三维电子显微技术（3D-EM），包括电子断层扫描（ET）和聚焦离子束-扫描电子显微镜技术（FIB-SEM）（详见文献²⁹），也可应用于按照本实验方案制备的细胞样品^21,31。此外，在荧光显微镜（LM）水平上也可获取三维信息，尤其是在使用共聚焦显微镜获取z轴层扫图像（z-stacks）时。事实上，当需要实现荧光显微镜与电镜数据集之间的精确定位关联时，强烈推荐采用此方法（例如参见文献¹⁷）。三维z轴层扫图像所提供的信息有助于提升其与二维透射电镜（TEM）图像之间的关联精度。因此，在此类情况下，可选择最匹配的荧光显微图像与电镜图像，并利用现有的关联软件进行叠加分析，例如ICY平台的ec-CLEM插件（http://icy.bioimageanalysis.org/）³² 或ImageJ的Landmark Correspondences插件（http://imagej.net/Landmark_Correspondences），最终生成荧光显微-电镜融合图像。

当需要时间信息以了解特定事件的动力学时，可结合电子显微镜（EM）采用延时成像来监测活细胞的动态变化。在目标事件发生过程中，立即固定细胞，从而获得一个"冻结的瞬间快照"，随后可通过电子显微镜对其进行分析，以获取固定时刻的详细超微结构信息。为了获得该"冻结的瞬间快照"，在实时观察后，可对细胞进行化学固定³³ 或冷冻固定⁶。由于许多细胞过程的发生速度超过化学固定中试剂扩散的速度，因此在条件允许的情况下，应进行超快速冷冻。然而，需要注意的是，不同高压冷冻（HPF）设备在有效时间分辨率上存在差异³⁴。

此外，尽管本实验方案是为将细胞包埋于环氧树脂而设计的，但细胞也可包埋于低黏度树脂中，例如 Lowicryls、LR White 或 LR Gold。使用这些包埋介质可保留抗原性^35,36，以及荧光信号^37,38 ，因此这些介质主要用于包埋后切片上的免疫标记^39,40 和切片上的关联显微成像（CLEM）^41,42,43,44，其中光学显微镜（LM）在包埋后进行。这两种方法（免疫电镜和包埋后切片 CLEM）对于那些可通过透射电镜（TEM）轻松识别非典型结构的实验，或作为光学显微镜与电镜信号之间错误关联的对照实验尤为重要。同样，也可使用可在两种成像模式（LM 和 EM）下可视化的抗体进行标记⁴⁵ ，例如，在 LM 中（包埋前阶段）识别转染细胞，并通过免疫电镜（包埋后阶段）对 GFP 信号进行特异性标记，从而实现更精确的定位。然而需要注意的是，为使抗体能够进入细胞内空间，需在 LM 前进行透化处理，这可能导致细胞超微结构在电镜水平上的保存效果次优。有趣的是，本方案也适用于多色实验，可通过使用除 GFP 以外的其他荧光标签（如本研究中所示）来实现。总之，根据所研究的具体科学问题，可在光学显微镜和/或电子显微镜环节对本方案进行多种可能的调整与优化。有关其他替代方案的全面描述，读者可参考文献^5,46。无论显微技术如何组合，联合应用的结果都将增加信息量，使我们能够更深入地理解病毒及其蛋白在真实生命环境中如何与宿主相互作用。

该方法中最关键的步骤是从目标细胞中收集连续切片。正如代表性结果部分所强调的，此步骤需要经验丰富的技术人员以及极大的耐心。重要的是，这一步骤对于在透射电镜（TEM）水平上重新定位目标细胞至关重要，原因有二。首先，在此类采用包埋前荧光显微镜（pre-embedding LM）的关联显微成像（CLEM）实验流程中，定位坐标仅在荧光显微镜水平以及包埋后的树脂块表面可见；然而，这些坐标在透射电镜切片上将不可见。因此，必须使用刀片仔细对树脂块表面进行靶向修块，以确保后续获得的切片包含表达特定荧光蛋白（FP）的细胞。第二， "扫描" 需要多个切片才能找到光学显微镜（LM）与电子显微镜（EM）成像之间的最佳重叠。与在包埋后阶段进行LM的方法不同，本方法中的LM-EM重叠精度较低。重叠准确度较低的原因在于LM与EM在轴向分辨率上的差异、EM样品处理过程中的收缩以及切片过程中的压缩。⁴²然而，使用标志点等高效追踪方法有助于重新定位细胞，包括细胞间的相对位置以及细胞及其细胞核的形态。在这方面，如本方案所述，微分干涉差（DIC）图像提供了 "解剖学的" 对改善相关性至关重要的细胞信息。或者，可在透射显微镜观察前对细胞核或其他易于识别的细胞器（如线粒体或脂滴）进行染色，用作定位标志。

最后值得指出的是，尽管本文主要关注该技术在病毒学研究中的应用，但此实验设计的应用范围可拓展至更广泛的生物学问题研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
紫外交联剂	Stratagene	400072	Stratalinker 1800,230 Vac，配备 254 nm 紫外灯泡，每个 8 瓦。
图案蓝宝石圆盘	工程办公室 M. Wohlwend， Sennwald， Switzerland	627	它们的直径为 0.3 毫米，厚度为 0.16 毫米，还有一个蚀刻的字母数字图案，允许重新定位电池。它们只能通过电子邮件订购：martin-wohlwend@bluewin.ch。
细长镊子	Electron Microscopy Sciences， Hatfield， PA， USA	72919-SS	"Style SS"，用于处理蓝宝石盘。
细胞培养基	Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA	41965-062	Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM），补充有 2 mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、100 单位青霉素/毫升、100 &微量;g 链霉素/mL 和 10% 胎牛血清（DMEM 完全，见下文）。每包 10 瓶，每瓶 500 mL。
L-谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific， Waltham， MA， USA	25030-123	包装包含 20 瓶 100 mL/瓶。
非必需氨基酸	Thermo Fisher Scientific， Waltham， MA， USA	11140-068	包装包含 20 瓶 100 mL/瓶。
青霉素/链霉素	Thermo Fisher Scientific， Waltham， MA， USA	15140-163	包装包含 20 瓶 100 mL/每瓶。
胎牛血清	Sigma Aldrich， St. Louis， MI， USA	F7524	瓶装 50 mL
倒置显微镜	Olympus Deutschland， Hamburg， Germany	CKX41	这是一款具有三目头选项和荧光升级功能的倒置显微镜。
稳定表达 T7 RNA 聚合酶的 Huh7-Lunet 细胞	可在 Ralf Bartenschlager 教授实验室获得	不可用	联系 Bartenschlager 教授： ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.
Mirus TransIT-LT1 转染试剂	Mirus Bio LLC，美国麦迪逊	MIR 2304	广谱、低毒性、DNA 转染试剂。0.4 mL
倒置宽场荧光显微镜	Carl Zeiss Microscopy GmbH，德国	Zeiss Observer.Z1	用于涉及活细胞培养物的实验的倒置荧光显微镜。
1-十六烯	默克，德国达姆施塔特	8220640100	瓶装 100 mL
"A" 铝制支架，用于高压摩擦 （HPF）工程	办公室 M. Wohlwend，Sennwald，瑞士	241	这是用于此协议的支架，有 2 种不同的深度，分别为 0.1 和 0.2 毫米。它只能通过电子邮件订购：martin-wohlwend@bluewin.ch。
"B" 铝制支架，用于 HPF	工程办公室 M. Wohlwend， Sennwald， Switzerland	242	这是用于本协议的支架。它的厚度为 0.3 毫米。它们只能通过电子邮件订购：martin-wohlwend@bluewin.ch。
用于 HPF 的 "A" 铝制支架（专门用于处理图案蓝宝石圆盘）	工程办公室 M. Wohlwend， Sennwald， Switzerland	737	这是一个可以与图案蓝宝石圆盘单独使用的支架（作为当前协议的替代品），不需要 "B" 支架或 "A" 支架的版本。它的厚度为 0.84 毫米。它只能通过电子邮件订购：martin-wohlwend@bluewin.ch。
蓝宝石圆盘	工程办公室 M. Wohlwend， Sennwald， Switzerland	405	这些蓝宝石圆盘是"传统"的蓝宝石圆盘，直径为 0.3 毫米，厚度为 0.05 毫米。它们也可以用于 CLEM 作为替代品，而不是带图案的蓝宝石光盘。
取景器网格	Electron Microscopy Sciences， Hatfield， Philadelphia， USA	LF135-Cu	这 135 个网格用于通过碳涂层在"传统"蓝宝石盘（如上所述）上创建字母数字图案，以便它们可用于 CLEM。100 个网格/小瓶。
HPF 机器	ABRA Fluid AG， Widnau， Switzerland	HPM 010	该 HPF 机器已用于此协议。
HPF 机器	Leica Microsystems，维也纳，奥地利	EMPACT 2	"EMPACT 2"，作为使用本协议中使用的 HPM 机器的替代品（如上所述）。
冷冻管	Thermo Fisher Scientific， Waltham， MA， USA	Z763667-500EA	用于在液氮中长期储存冷冻固定化样品。包含 500 个冻存管的包装。
液氮杜瓦	瓶 Cole-Parmer GmbH，德国韦特海姆	GZ-05094-60	用于在液氮中长期储存冷冻固定样品，配备可容纳 1600 个冷冻管的冷冻架。
自动冷冻替代 （AFS） 机器	徕卡显微系统公司，奥地利维也纳	EM AFS2	该机器执行冷冻替代和渐进式降温 （PLT） 技术，并允许树脂的低温包埋和聚合。
四氧化锇 （OsO4）	Electron Microscopy Sciences， Hatfield， PA， USA	19150	4% 水溶液，一盒包含 10 x 2 mL 安瓿瓶。
乙酸铀酯 （UA）	Serva， Heidelberg， Germany	77879.01	装有 25 克 （UA）-2 H2O 的瓶子。
Sonicator	Bandelin Electronic，德国柏林	329	"Sonorex Super RK 31"是一种用于水性清洗液的高功率超声波清洗槽，在该方案中用于在制备 FS 培养基时混合 OsO4 和 Ua。
玻璃蒸馏丙酮	电子显微镜科学，美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德	10015	瓶装 100 mL
立体显微镜	徕卡显微系统公司，奥地利维也纳	徕卡 M80	用于日常检查的常规立体显微镜，配备用于捕捉图像的摄像头。
环氧树脂	Electron Microscopy Sciences， Hatfield， PA， USA	14120	Embed 812 是一个包含多种组分的套件，这些组分必须按照制造商给出的比例混合在一起。
流通环	Leica Microsystems， Vienna， Austria	16707157	每包包含 100 件。
试剂槽	Leica Microsystems，奥地利维也纳	16707154	包装包含 100 件。
超薄切片机	Leica Microsystems，奥地利维也纳	Leica EM UC7	超薄切片机，用于在室温下制备半薄切片和超薄切片。
Ultra 35 ° 金刚石刀	Diatome Ltd.， Nidau Switzerland	AGG339-735	这把刀的刀刃长度为 3 毫米。
超细镊子	Electron Microscopy Sciences， Hatfield， PA， USA	E78318	"Style 3X"，用于处理 EM 网格。
EM 槽网格	Electron Microscopy Sciences，美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德	G2010-Cu	100 网格/小瓶。
EM 网格存储盒	Electron Microscopy Sciences， Hatfield， PA， USA	71155	它的容量为 100 个网格。