采用相关联的光镜与电镜显微技术（CLEM），通过电子显微镜（EM）对先前经光镜（LM）筛选出的细胞中病毒诱导产生的细胞内结构进行成像。将光镜与电镜结合为一种混合成像方法，以实现对病毒与宿主相互作用的整合性观察。
本文内容
摘要
摘要
由于其高分辨率，电子显微镜（EM）是病毒学家不可或缺的工具。然而，通过电子显微镜分析病毒感染或转染细胞时面临的主要困难之一是感染或转染效率较低，从而阻碍了对这些细胞的观察。为克服这一难题，可首先进行光学显微镜（LM）观察，以定位感染或转染的细胞亚群。通过利用与病毒蛋白融合的荧光蛋白（FPs），本方法中采用光学显微镜记录表达荧光蛋白、并在带有字母数字编码的载物支持物上生长的“阳性转染”细胞的位置。随后，细胞经高压冷冻（HPF）、冷冻置换（FS）及树脂包埋等步骤进一步处理用于电子显微镜分析。超快速冷冻步骤可确保所选细胞的膜结构得到优异保存，从而可在超微结构水平上通过透射电子显微镜（TEM）进行分析。本文提供了一套详细的关联光学与电子显微镜（CLEM）工作流程，涵盖样品制备、成像及定位关联的各个步骤。该实验设计也可应用于解决多种细胞生物学问题。
引言
将两种显微技术结合以更全面地观察特定生物过程的想法由来已久。早在1960年，就有两篇独立发表的研究首次利用“关联显微技术”对病毒进行了研究1,2。在该研究中，作者通过两种显微技术分析了腺病毒感染引起的细胞核形态变化。第一篇论文报道了利用电子显微镜（EM）观察到的与腺病毒感染相关的形态学细节1；而在第二篇论文中，研究人员将电子显微镜下观察到的不同结构与光学显微镜（LM）下的组织化学染色图像进行关联，以确定此前在电子显微镜下观察到的结构的性质2。
然而，在这些早期研究中，他们的观察是利用作为独立实验制备的不同感染细胞进行的。这种“关联”实际上是指结合来自两种成像方式的信息，以理解某一特定现象，通过比较不同检测方法所获得的全部发现，来阐明特定的生物学过程。
如今，相关显微技术（correlative microscopy），也称为相关光学与电子显微技术（correlative light and electron microscopy, CLEM），正被应用于越来越多的方法中（详见参考文献）3,4,5），其共同点在于两种成像技术（LM 和 EM）均在同一份样品上进行。因此，这两种方法的结合可实现对该样品的多模态、多尺度和多维度分析3其优势在于，LM 能够提供多种不同细胞的广泛概览，从而识别出异质细胞群体中表达特定蛋白或多种目标蛋白的细胞亚群。EM 突破了 LM 的分辨率限制，可对特定的细胞内事件提供更高分辨率的图像。此外，EM 能够可视化非荧光性的亚细胞结构背景，包括所有膜包被的细胞器以及大型大分子复合物（例如， 核糖体，中心粒 等等。）和细胞骨架成分，从而提供额外的空间信息，即所谓的“参考空间”6，并为荧光显微镜检测到的荧光点提供背景信息。
近年来，CLEM不仅成为细胞生物学家的有力工具5，也受到病毒学家的广泛关注（参见文献7综述），用于研究导致病毒成功增殖的复杂病毒-细胞相互作用。因此，了解病毒如何改造细胞膜和细胞器以利于自身增殖，对于开发抗病毒药物以根除致病性病毒至关重要。
本文描述了一种关联显微技术（CLEM），该方法可通过光镜（LM）检测表达与荧光蛋白（FP）融合的病毒蛋白的细胞。随后对这些细胞进行冷冻固定，并进一步制备用于透射电子显微镜（TEM）的超微结构分析，以深入了解这些蛋白的表达如何重塑细胞内膜结构（图1）。迄今为止，大多数已发表的病毒学研究中的关联显微技术均采用化学固定的细胞8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19。这主要是出于生物安全考虑，需要在生物安全二级和三级（BSL-2 和 BSL-3）实验室中灭活具有感染性的材料，而这些实验室通常无法进行细胞的冷冻固定。然而，对于需要最佳保存细胞膜结构的研究问题，强烈推荐通过高压冷冻（HPF）实现玻璃态固化20。在此类情况下，可应用本文所述的关联显微技术流程。有趣的是，在处理具有感染性的样本时，高压冷冻也可在先前已通过化学方法灭活的样品上进行，例如在 BSL-2 和 BSL-3 实验室中完成化学灭活后再进行后续操作。化学固定后接高压冷冻的组合方式，能够在一定程度上获得冷冻保存方法的优势21,22。
图1：通过 CLEM分析细胞的工作流程示意图。 生长在图案化蓝宝石圆片上的细胞首先通过光学显微镜（LM）分析，以定位表达荧光蛋白（FPs）的细胞，随后进行电镜（EM）制样处理。定位后，立即采用高压冷冻（HPF）和冷冻替代（FS）方法对细胞进行固定，然后包埋于树脂中。树脂聚合完成后，需将细胞生长的支撑物（即蓝宝石圆片）从树脂块上移除。含有包埋细胞的树脂块被修整为小型梯形，随后用金刚石刀对表达荧光蛋白的剩余细胞进行超薄切片。超薄切片收集于载网槽上，再通过透射电子显微镜（TEM）进一步观察，以获得这些细胞的超微结构信息。该图经参考文献29许可改编和修改。请点击此处查看该图的放大版本。
方案
1. 细胞培养用图案化蓝宝石圆片的制备
- 将带有字母数字图案的图案化蓝宝石圆片（见材料表）转移至15 mL锥形离心管中，其中图案蚀刻在其一个表面上。
注意：也可使用无字母数字图案的传统0.05 mm厚蓝宝石圆片，通过在其表面镀碳并覆盖定位网格来创建参考图案。为此，应在施加碳图案前用乙醇清洗蓝宝石圆片。 - 用乙醇彻底清洗，并在含有滤纸的培养皿中铺开晾干。使用细长镊子将它们分别放置在玻璃载片上，彼此分开。
- 使用倒置显微镜（4倍放大）检查每个蓝宝石圆片上的坐标图案是否可读。
注意：若不可读，可借助镊子翻转蓝宝石圆片。 - 将蓝宝石圆片存放在培养皿中。
注意：此步骤可暂停实验流程。
2. 带有图案蓝宝石圆片的细胞培养
- 使用紫外（UV）交联仪对图案化蓝宝石圆片进行5分钟的灭菌处理。
- 将蓝宝石圆片转移至细胞培养生物安全柜中。在生物安全柜内用乙醇对长柄镊子进行灭菌。
- 将一半的细胞培养基（见材料表）加入细胞培养皿中。用长柄镊子小心地将蓝宝石圆片转移至培养皿中。
- 将1 × 105个稳定表达T7聚合酶的Huh7-Lunet细胞重悬于另一半培养基中，接种至培养皿中。
注意：计算接种细胞数量时，应确保实验终点时细胞融合度不超过20–30%。细胞密度过高会影响后续电镜观察时细胞的定位；此外，过度融合可能导致细胞从蓝宝石圆片上脱落。 - 检查蓝宝石圆片是否仍位于培养皿底部，并通过倒置显微镜确认其上的字母数字坐标仍清晰可读。
注意：若圆片在培养基中漂浮，可用长柄镊子将其轻压至底部，并必要时翻转至正确朝向。 - 次日按照参考文献21,23中所述方法及转染试剂生产商的说明书对细胞进行转染。
3. 在图案化蓝宝石圆盘上生长的细胞的显微成像
- 在实验终点时，将蓝宝石圆片转移至含有 30–50 µL/位点无 pH 指示剂培养基的金属成像板中，以减少非特异性背景荧光。
注意：此处所述金属板（图 2）由欧洲分子生物学实验室（EMBL）车间设计。若无此板或类似装置，也可使用玻璃底细胞培养皿进行荧光显微镜观察（LM）。重要的是需将常规细胞培养基更换为不含 pH 指示剂的培养基。还需注意应避免长时间曝光，因其可能导致光漂白，进而引起活性氧（ROS）积累并对细胞造成生理损伤24,25。 - 在倒置宽场荧光显微镜下对细胞进行成像。
注意：当使用绿色荧光蛋白（GFP）标记蛋白时（如代表性结果所示），应分别使用 450–490 nm 和 500–550 nm 的激发与发射滤光片。 - 首先获取细胞的低倍图像（10–20X），以定位表达荧光蛋白（FPs）的细胞。利用微分干涉差（DIC）显微镜记录目标细胞所在图案化蓝宝石圆片的位置坐标。
注意：拼接多个区域图像有助于更全面地了解目标细胞的位置。此外，此处也可选择性地使用相差显微镜。 - 对同一细胞/细胞群获取高倍（荧光和 DIC）图像（63–100X，油浸物镜），以更清晰地区分目标蛋白在细胞内空间中的亚细胞定位。
注意：DIC 图像提供上下文信息，该信息通常对于后续将荧光显微镜图像与电镜图像进行关联至关重要，因为最终关联分析借助细胞的“解剖学”标志物时更为精确。由于部分蓝宝石圆片可能在冷冻固定过程中破裂，强烈建议每种条件准备三份重复样本。此外，在高压冷冻（HPF）及本方案后续步骤中，部分细胞可能从圆片上脱落，而其他细胞的超微结构可能因冷冻损伤而出现伪影。因此，应通过荧光显微镜至少对圆片上的两个区域进行成像，以确保最终有足够的细胞可供分析。重要的是，这两个区域应位于圆片的相对两侧，以便将包埋细胞的树脂块切成两半，并分别获取这两个区域的切片。
图 2：在图案化蓝宝石圆盘上生长的细胞进行光学显微成像的示意图。（A） 使用精细镊子将蓝宝石圆盘转移至成像板上。（B-C） 该成像板由海德堡EMBL车间专门设计，可适配于光学显微镜，使蓝宝石圆盘在不含pH指示剂的细胞培养基中成像成为可能。成像板由一块75 mm × 25 mm × 1 mm的金属载片制成，使用3 mm钻头铣出四到五个孔，以匹配蓝宝石圆盘的尺寸。此外，在每个孔的两侧以90°角铣出小凹槽，便于操作时用镊子夹取圆盘。为实现最佳成像条件，在孔的下方使用紫外胶粘附0号玻璃盖玻片（厚度0.085至0.13 mm），并置于紫外光下固化。（D） 图案化蓝宝石圆盘的高倍放大图像，显示其表面刻蚀的字母数字坐标。图案化蓝宝石圆盘为商业化产品（见材料表）。请点击此处查看该图的放大版本。
4. 通过高压冷冻技术对生长在图案化蓝宝石圆盘上的细胞进行冷冻固定
- 将用于高压冷冻（HPF）的“A”和“B”型铝制载具（参见材料表）放入含有经1-十六碳烯浸润的滤纸的培养皿中。将带有细胞的图案化蓝宝石圆片浸入盛有1-十六碳烯的培养皿中。
注意：轻轻移动圆片以洗去细胞培养基。 - 按照以下方式将蓝宝石圆片夹在HPF样品架中的“A”和“B”型铝制载具之间（图3B）。底部放置“B”型载具，使其平面朝上。将蓝宝石圆片置于该平面上，细胞面朝上。然后在上方添加“A”型载具，使其0.1 mm深度的一面朝向细胞。
注意：由于图案化蓝宝石圆片比常规蓝宝石圆片更厚，因此需在EMBL车间将市售的“A”型载具（原设计用于非图案化的0.05 mm蓝宝石圆片）在0.2 mm深度一侧切割至0.05 mm，以便适配HPF样品架（图3A）。为此，将“A”型载具插入金属管末端，使0.2 mm一侧暴露并固定，以便进行切割。切割后对该侧面进行打磨，使其表面平整。或者，也可使用专用于图案化蓝宝石圆片上方的特殊铝制载具（可商业获取，参见材料表），此时HPF“三明治”结构仅由蓝宝石圆片和该载具组成。 - 关闭HPF仪器的样品架并冷冻细胞。
注意：本方案针对特定型号的HPF仪器。也可使用其他型号的HPF仪器6,26。无论如何，请注意供应商提供的新一代仪器。
警告：使用护目镜和听力保护耳机。 - 将冷冻后的“三明治”结构置于装有液氮的聚苯乙烯盒中，用于临时储存。
警告：佩戴护目镜，并联系当地安全负责人，了解操作液氮时可能存在的危险。- 为避免混淆，将每个“三明治”结构分别放入已编号的0.5 mL微量离心管中（置于聚苯乙烯盒内）。
注意：本方案可在此暂停。若无法立即进行冷冻置换（FS），样品可储存于带孔的冻存管（顶部打孔）中，放入盒子后置于液氮超低温杜瓦瓶的架子上（参见材料表）。该液氮容器应放置在配备氧气传感器的房间内，以防缺氧导致窒息。
警告：以下所有操作（步骤5和6）必须在生物安全柜中进行。此外，所用大多数试剂具有危害性。使用前必须仔细阅读制造商提供的材料安全数据表（MSDS），并向安全负责人咨询当地安全规定，确保安全操作。对于这些耗材的正确处置以及下文所述设备的规范使用，也需参照所在机构的健康与安全规程。
- 为避免混淆，将每个“三明治”结构分别放入已编号的0.5 mL微量离心管中（置于聚苯乙烯盒内）。
图3：用于高压冷冻（HPF）的带图案蓝宝石圆盘在两个铝制载具之间组装的示意图。（A）传统“A”型载具的剖面图，需将其较深一侧从0.2 mm切割至0.05 mm。（B）将表面刻有字母数字图案、厚度为0.16 mm的蓝宝石圆盘组装到两个铝制载具中以进行高压冷冻，具体步骤如下：将蓝宝石圆盘放置在“B”型载具的平坦面上，细胞面朝上；再将一个经切割的“A”型载具置于其上，使其0.1 mm深的一面朝向细胞，形成“高压冷冻三明治”结构。铝制载具和带图案的蓝宝石圆盘均可商业购得（见材料表）。请点击此处查看该图的放大版本。
5. 冷冻固定细胞的断面扫描
- 加注FS仪器（参见 材料表) 用液氮处理。将温度设置为 -90 °C 等待仪器达到此温度。
- 制备含有0.2%四氧化锇（OsO₄）的FS溶液4)（v/v），0.1% 醋酸铀（UA）（w/v）溶于玻璃蒸馏丙酮中，同时使FS仪降温。
注意：配制（例如）12 mL FS 培养基时，混合 600 µL 4% OsO₄4在小型玻璃容器中加入0.012 g UA，置于超声波清洗仪中溶解5分钟。用移液器加入11.4 mL玻璃蒸馏丙酮，充分混匀。 - 用200-填充1.5 mL微量离心管500 µL 加入FS培养基，盖上盖子，转移至FS仪器中。静置10分钟，使FS培养基冷却。
- 使用预冷的长镊子将含有细胞的蓝宝石圆盘的冷冻“三明治”转移至液氮中，随后放入含有FS培养基的离心管内。
警告：使用防冻手套和护目镜。
注意：在操作过程中，HPF“三明治”结构可能会自发解体。此时，请确保将冷冻的蓝宝石片转移至微量离心管中，铝制载体可丢弃。 - 按照以下步骤运行FS，直至第二天27：从 -90 °C 至 -80 °C 8 小时；从 -80 °C 至 -50 °C 8 小时；从 -50 °C 至 -20 °C 2小时；从-20 °C 到 0 °C 2小时。
6. 冷冻置换样品的树脂包埋
警告：以下所述所有操作必须在生物安全柜中进行。此外，所使用的大多数试剂均具有危险性。使用前必须仔细阅读生产商提供的材料安全数据表，并咨询安全管理人员有关当地安全规定，以确保安全操作。对于这些使用过的材料的正确处置，以及下述设备的正确使用，还须咨询所在机构的健康与安全规程。
- 从FS机器中取出替代的样品，并将其置于冰上20分钟。
- 将样品在室温下放置20分钟，然后用玻璃蒸馏丙酮彻底清洗（每次10分钟，共清洗3次）。若FS处理后铝制载体仍留在微量离心管中，需用长镊子将其丢弃。
- 使用四步环氧树脂系列对剩余蓝宝石圆片上的细胞进行渗透处理：分别在含25%、50%和75%树脂的玻璃蒸馏丙酮中各孵育1小时，随后在100%树脂中过夜孵育。次日更换为新鲜的100%树脂并孵育1小时。
- 小心地将蓝宝石圆片放入安装在试剂浴中的流通式环内，试剂浴中充满100%树脂。这些环用作10个蓝宝石圆片的聚合模具。
注意：必须将蓝宝石圆片完全推至底部，且坐标面朝上，确保可清晰读取。可通过连接在通风橱上的双目显微镜进行检查，也可改用生物安全柜内的双目显微镜。重要的是，试剂环底部刻有编号（1-10），有助于样品识别。此外，可在树脂块中加入纸质标签以辅助样品鉴定。 - 将样品置于60 °C烘箱中聚合48小时。
7. 从聚合树脂块中取出图案化蓝宝石圆片
- 从烘箱中取出含有细胞的硬质树脂块。
注意：此处可暂停实验流程。如不暂停，需让包埋块冷却至室温后再进行切片。 - 用剃刀片切割包埋模具，以暴露树脂块。使用镊子取出圆柱形树脂块。
注意：如果在聚合前未将纸质标签放入树脂块中，请使用永久性记号笔对树脂块进行编号，并将其存放于1.5 mL微量离心管中。此步骤可暂停实验流程。 - 将含有蓝宝石圆片的树脂块尖端浸入装有液氮的聚苯乙烯盒中，直至不再产生“气泡”。随后，将树脂块尖端浸入沸腾的H2O.
- 根据需要重复前两个步骤，直至蓝宝石圆盘从树脂块上脱落。
警告：请佩戴护目镜和防冻手套。
注意：如果此步骤无效，可使用剃刀刀片去除圆片周围部分聚合的树脂后再重试。本实验方案可在此处暂停。
8. 透射电镜用靶向修块与超薄切片
- 使用超薄切片机的双目镜观察树脂块表面，确定目标细胞所在区域。
注意：图案化蓝宝石圆盘的坐标图案负像会保留在块面表面，从而有助于识别目标细胞所在区域，以便进行定向修块。必须将光学显微镜图像垂直翻转，以帮助定位块面的相同位置。 - 使用洁净的剃刀将包埋的单层细胞（包含目标细胞）修整为一个呈梯形的小型平整金字塔状结构（平均尺寸约为 200 µm × 250 µm）。
- 使用 35° 金刚石刀对包埋的细胞进行 70 nm 的超薄切片。
- 借助超细镊子将切片转移至电镜载网槽格上。
注意：: 应避免使用网状载网，因为切片可能被载网金属条遮挡。 - 将载网放入载网盒中保存。
注意：此步骤可作为暂停点。
9. 超薄切片的透射电子显微镜分析
- 将载网槽插入透射电子显微镜的样品 holder 中。获取低倍率（概览）图像，使目标细胞的完整细胞轮廓可见。
注意：: 可通过细胞轮廓以及细胞之间的相对位置作为参考，与光学显微镜（LM）先前获取的微分干涉差（DIC）图像进行比对，从而重新定位目标细胞。 - 对目标细胞获取高倍率图像，尝试在超微结构水平上找到与之前光学显微镜（LM）观察到的荧光信号相对应的结构特征。
注意：可在高倍率下获取拼接图像，以获得目标细胞的高分辨率整体视图。此外，在与荧光图像进行比对前，通常需要连续获取同一细胞在连续超薄切片上的图像，以便进行三维重建。
结果
采用本文所述方法（图1），将稳定表达T7 RNA聚合酶的Huh7-Lunet细胞接种于带有图案的蓝宝石圆片上，随后转染表达丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS5A两个结构域并带有GFP标签的质粒（pTM_AH-D1-GFP）（图4）。次日，将生长有细胞的图案化蓝宝石圆片从细胞培养皿中取出，利用光镜（LM）进行成像（图4，图2）。通过细胞质中是否存在绿色荧光来识别表达AH-D1-GFP的细胞，并记录其在蓝宝石圆片坐标图案中的位置（图5A、图5B）。在完成光镜观察后，立即将含有目标细胞的蓝宝石圆片夹在两个铝制载片之间（图3），并通过高压冷冻（HPF）进行低温固定。随后对细胞进行冷冻置换，并最终包埋于环氧树脂中。
从聚合树脂块上取下蓝宝石圆盘后，可在树脂块表面观察到字母数字图案的印痕，从而能够定位目标细胞所在区域。随后修去树脂块的其余部分，保留包含目标细胞的小梯形区域。从此梯形区域切取连续超薄切片，收集于电镜载网槽上，并进一步通过透射电子显微镜（TEM）进行分析（图5C）。需要注意的是，尽管手动获取连续超薄切片是可行的28，但该过程耗时耗力，且需要经过良好训练并具备熟练技能的操作人员。此外，在进行此CLEM实验流程时（图5A），细胞密度应保持较低，以确保在光镜下先前识别的同一细胞能够被快速定位。否则，若细胞密度过高，将显著延缓在电镜水平成功定位目标细胞的过程。
对表达AH-D1-GFP的目标细胞进行多个超薄切片的透射电镜（TEM）分析（图5D、图5E），结果显示其细胞内存在大量形态各异的囊泡聚集，这些囊泡由单层脂质双分子层与周围细胞质分隔（图5E）。
图4：执行图示 CLEM 示例所遵循的工作流程示意图 图5. 表达T7 RNA聚合酶的Huh7-Lunet细胞被转染了编码丙型肝炎病毒NS5A蛋白两亲性螺旋（AH）和结构域1（D1）的DNA质粒，该蛋白在其C末端标记有GFP（pTM_AH-D1-GFP）。该NS5A蛋白片段的表达在转录水平上由T7启动子（T7 Pm）调控，在翻译水平上由脑心肌炎病毒（EMCV）IRES（内部核糖体进入位点）元件调控，IRES以二级结构形式表示。转染后24小时（24 hpt），生长在图案化蓝宝石圆片上的表达AH-D1-GFP的细胞通过光镜（LM）检测，并立即进行高压冷冻-冷冻替代（HPF-FS）处理。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图5：CLEM 实验流程示例。（A）稳定表达 T7 聚合酶的 Huh7-Lunet 细胞，在转染质粒 pTM_AH-D1-GFP 后 24 小时，通过荧光显微镜分析在图案化蓝宝石圆片上生长的 GFP 阳性细胞。（B） 白色虚线矩形内选定用于 CLEM 分析的单个细胞的高倍放大图像。（C） 同一细胞经高压冷冻（HPF）、冷冻置换（FS）及树脂包埋后，超薄切片的透射电子显微镜（TEM）图像。（D） 在载网槽上连续 70 nm 超薄切片的示意图，包含目标细胞。（E） 左侧：目标细胞两个切片的 TEM 概览图；右侧：左侧黄色矩形框内选定的细胞内区域的高倍 TEM 图像，显示大量由单层膜与细胞质分隔的囊泡。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本文所介绍的用于研究病毒蛋白表达对细胞膜影响的CLEM方法，此前已成功用于阐明丙型肝炎病毒（HCV）复制相关结构，主要是双层膜囊泡（DMVs）21，并确定形成这些HCV诱导结构所需的关键组成成分23。需要注意的是，在我们首次使用CLEM研究HCV复制的实验中21，采用的是本方案稍作修改的版本。在该研究中，使用了传统的厚度为0.05 mm、无字母数字图案的蓝宝石圆片，并通过在其表面覆盖碳层并叠加定位网格的方式创建参考图案（见材料表）。当前方案的这一版本仍可继续使用，其优势在于可直接使用"A"型HPF载样夹，无需像图3A所示那样进行切割。此外，如方案中所述，也可使用更厚的"A"型载样夹（见材料表）配合带有图案的蓝宝石圆片，从而无需使用"B"型载样夹。
有趣的是，该方案不仅可用于研究 BSL-1 样本（例如此处及其他文献中所述的转染病毒蛋白的细胞19,23），还可用于研究病毒感染的细胞。尽管操作人类病原体通常仅限于 BSL-2 和 BSL-3 实验室，但在某些国家，仍有可能在这些生物安全条件下进行冷冻固定。在因当地法规限制或缺乏高压冷冻仪（HPF）而无法实施玻璃化冷冻的 BSL-2 和 BSL-3 实验室中，若预先使用醛类试剂对病毒感染的细胞进行化学固定（即在离开 BSL-2 或 BSL-3 设施之前完成），仍可采用本方法进行样品制备。此外，为保留荧光信号，醛类固定后需立即淬灭，其余步骤则与本文所述方案完全相同。该技术可能被视为冗余，因为细胞经历了化学固定和玻璃化冷冻两次固定。然而，与仅接受化学固定的细胞相比，这种双重固定方案确实显著改善了丙型肝炎病毒（HCV）诱导的双层膜囊泡（DMVs）的保存效果21。
有关进一步的修改和故障排除，读者可参考本手稿方案部分中的各项说明。这些说明描述了需要避免的常见问题，以及在实施本方法时可能遇到的潜在困难的替代解决方案。
应用该技术的主要要求是具备高压冷冻（HPF）仪。当无法通过高压冷冻对细胞进行冷冻固定（由于缺乏高压冷冻仪）或无需进行冷冻固定（当膜结构的保存无需达到最佳状态）时，可采用化学固定法，随后进行电镜制样与分析8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19。该方案无需使用蓝宝石载片，但需使用带有网格标记的细胞培养皿，以便重新定位细胞或细胞簇。此类培养皿的主要优势在于其直径大于蓝宝石载片，可实现更大面积的表面筛选。因此，本CLEM方案已成功应用于研究抗病毒化合物对丙型肝炎病毒（HCV）的作用15 ，或用于可视化诺如病毒非结构蛋白诱导的膜结构重排19。另一个可能限制该方法应用的因素是缺乏商用的快速冷冻（FS）设备。在此情况下，可使用简易的自制快速冷冻系统替代。尽管自动化的快速冷冻设备可能减少操作失误，但自制设备同样可成功应用，例如在Kent McDonald30 和Paul Walther的实验室中即有成功使用案例。
关于化学固定，此处所述方案可实现细胞内结构的最佳保存20。因此，若具备上述高压冷冻（HPF）和冷冻替代（FS）设备，则优先推荐对目标细胞进行玻璃化冷冻处理。
未来对这种CLEM方法的改进可能不仅限于在超微结构水平上获取二维信息，还包括获得有关病毒引起的膜和细胞器结构改变的三维信息。三维电子显微技术（3D-EM），包括电子断层扫描（ET）和聚焦离子束-扫描电子显微镜技术（FIB-SEM）（详见文献29），也可应用于按照本实验方案制备的细胞样品21,31。此外，在荧光显微镜（LM）水平上也可获取三维信息，尤其是在使用共聚焦显微镜获取z轴层扫图像（z-stacks）时。事实上，当需要实现LM与EM数据集之间的精确定位关联时，强烈推荐采用此方法（例如参见文献17）。三维z轴层扫图像所提供的信息有助于提升其与二维透射电镜（TEM）图像之间的关联精度。因此，在此类情况下，可选择最匹配的LM与EM图像，并利用现有的关联软件进行处理，例如ICY平台的ec-CLEM插件（http://icy.bioimageanalysis.org/）32 或ImageJ的Landmark Correspondences插件（http://imagej.net/Landmark_Correspondences），从而生成LM与EM图像的叠加结果。
当需要时间信息来理解某一事件的动力学时，可结合电子显微镜（EM）使用延时成像技术来监测活细胞的动态变化。在目标事件发生过程中，立即对细胞进行固定，从而获得一个"冻结快照"，随后可通过电子显微镜对其进行分析，以获取固定时刻细胞超微结构的详细信息。为了获得该"冻结快照"，在实时观察后，细胞可采用化学固定33 或冷冻固定6。由于许多细胞过程的发生速度超过化学固定中试剂扩散的速度，因此在条件允许的情况下，应进行超快速冷冻。然而，需要注意的是，不同高压冷冻仪（HPF）的有效时间分辨率存在差异34。
此外，尽管本实验方案是为将细胞包埋于环氧树脂而设计的，但细胞也可包埋于低黏度树脂中，例如 Lowicryls、LR White 或 LR Gold。使用这些包埋介质可保留抗原性35,36，以及荧光信号37,38 ，因此主要用于包埋后切片上的免疫标记39,40 和切片上的 CLEM41,42,43,44，其中光学显微镜（LM）在包埋后进行。这两种方法（免疫电镜和切片上 CLEM）对于那些可通过透射电镜（TEM）轻松识别非典型结构的实验至关重要，也可作为光学显微镜与电镜信号之间错误关联的对照。同样，也可使用可在两种成像模式（LM 和 EM）下可视化的抗体进行标记45 ，例如，在 LM（包埋前阶段）中识别转染细胞，并通过免疫电镜（包埋后阶段）对 GFP 信号进行特异性标记，从而实现更精确的定位。然而需要注意的是，为使抗体能够进入细胞内空间，需在 LM 前进行透化处理，这可能导致细胞超微结构在电镜水平上的保存效果次优。有趣的是，本方案也适用于多色实验，可通过使用除 GFP 以外的其他荧光标签（如本研究中所示）来实现。总之，根据所研究的具体科学问题，可在光学显微镜和/或电镜环节对本方案进行多种可能的调整与优化。有关其他替代方案的全面描述，读者可参考文献5,46。无论显微技术如何组合，联合应用均能获得更丰富的信息，使我们能够更深入地理解病毒及其蛋白在真实生命环境中如何与宿主相互作用。
该方法中最关键的步骤是从目标细胞中收集连续切片。正如代表性结果部分所强调的，这一步骤需要经验丰富的技术人员以及极大的耐心。重要的是，这一步骤对于在透射电镜（EM）水平上重新定位目标细胞至关重要，原因有两点。首先，在此类采用预包埋荧光显微镜（LM）的关联显微成像（CLEM）方案中，空间坐标仅在LM层面以及包埋后的树脂块表面可见；然而，这些坐标在透射电镜（TEM）切片上将不可见。因此，必须使用刀片仔细对树脂块表面进行靶向修块，以确保后续获得的切片中包含表达特定荧光蛋白（FP）的细胞。其次，需要对多张切片进行"扫描"，以实现LM与EM图像之间的最佳叠加匹配。与在包埋后阶段进行LM的方法相比，本方法中的LM-EM叠加精度较低。这种较低的叠加准确性源于LM与EM之间轴向分辨率的差异、EM样品处理过程中的收缩效应以及切片过程中的压缩变形42。尽管如此，有效的追踪方法（例如利用标记特征）有助于重新定位目标细胞，包括细胞之间的相对位置关系，以及细胞及其细胞核的形态特征。在这方面，如实验方案中所述，微分干涉差（DIC）图像提供了关键的"解剖学"信息，有助于提高关联精度。此外，也可在LM成像前对细胞核或其他易于识别的细胞器（如线粒体或脂滴）进行染色，并将其作为定位标记。
最后值得指出的是，尽管本论文主要关注该技术在病毒学研究中的应用，但该实验设计的适用范围可拓展至更广泛的生物学问题研究。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们非常感谢欧洲分子生物学实验室（EMBL，海德堡）和海德堡大学电子显微镜核心设施（EMCF）的工作人员。我们还要感谢海德堡大学的Ulrike Herian、Stephanie Kallis和Andrea Hellwig，以及乌尔姆大学的Eberhardt Schmidt和Renate Kunz在技术方面提供的专业协助。R.B.及其团队（U.H.和I.R.-B.）的工作得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）SFB1129项目TP11和TRR83项目TP13的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 紫外交联仪 | Stratagene | 400072 | Stratalinker 1800，230 Vac，配备254 nm紫外灯管，每根8瓦 |
| 有图案的蓝宝石圆片 | 工程办公室 M. Wohlwend，Sennwald，瑞士 | 627 | 它们的直径为0.3 mm，厚度为0.16 mm，并带有蚀刻的字母数字图案，以便重新定位细胞。这些圆片仅可通过电子邮件订购：martin-wohlwend@bluewin.ch。 |
| 细长镊子 | 美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德，电子显微镜科学公司 | 72919-SS | "样式 SS"，用于处理蓝宝石圆片。 |
| 细胞培养基 | Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 41965-062 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），添加 2 mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、每毫升 100 单位青霉素、100 µ每毫升含 g 链霉素和 10% 胎牛血清（DMEM 完全培养基，见下文）。包装包含 10 瓶，每瓶 500 mL。 |
| L-谷氨酰胺 | Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 25030-123 | 包含20瓶，每瓶100 mL。 |
| 非必需氨基酸 | Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 11140-068 | 包含20瓶，每瓶100 mL。 |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 15140-163 | 包含20瓶，每瓶100 mL。 |
| 胎牛血清 | Sigma Aldrich，美国密歇根州圣路易斯 | F7524 | 50 mL 瓶装 |
| 倒置显微镜 | Olympus Deutschland，德国汉堡 | CKX41 | 这是一台带有三目镜筒选件和荧光升级功能的倒置显微镜。 |
| 稳定表达T7 RNA聚合酶的Huh7-Lunet细胞 | 可在 Ralf Bartenschlager 教授实验室获取 | 暂无可用内容 | 请联系 Bartenschlager 教授：ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de。 |
| Mirus TransIT-LT1 转染试剂 | Mirus Bio LLC，美国麦迪逊 | MIR 2304 | 广谱、低毒性的DNA转染试剂。0.4 mL小瓶 |
| 倒置宽场荧光显微镜 | 卡尔蔡司显微镜有限公司，德国 | 蔡司 Observer.Z1 | 用于活细胞培养实验的倒置荧光显微镜 |
| 1-十六碳烯 | 默克公司，德国达姆施塔特 | 8220640100 | 100 mL 瓶装 |
| "A" 用于高压冷冻（HPF）的铝制载样杯 | 工程办公室 M. Wohlwend，Sennwald，瑞士 | 241 | 这是本方案所使用的载样 holder，具有 0.1 和 0.2 mm 两种不同深度。该 holder 仅可通过电子邮件订购：martin-wohlwend@bluewin.ch。 |
| "B" 高压冷冻用铝制载样杯 | 工程办公室 M. Wohlwend，Sennwald，瑞士 | 242 | 这是本方案所使用的载具，厚度为0.3 mm。该载具仅可通过电子邮件订购：martin-wohlwend@bluewin.ch。 |
| "A" 用于高压冷冻的铝制样品杯（专用于带图案蓝宝石圆片） | 工程办公室 M. Wohlwend，Sennwald，瑞士 | 737 | 这是可单独与图案化蓝宝石圆片一同使用的载具（可作为当前方案的替代方法），无需使用 "B" 支架或版本 "A" 支架。厚度为 0.84 mm。仅可通过电子邮件订购：martin-wohlwend@bluewin.ch。 |
| 蓝宝石圆片 | 工程办公室 M. Wohlwend，Sennwald，瑞士 | 405 | 这些蓝宝石圆盘是 "常规的" 一种，直径为0.3 mm，厚度为0.05 mm。它们也可用于CLEM，作为图案化蓝宝石圆片的替代品。 |
| 定位网格 | 美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德，电子显微镜科学公司 | LF135-Cu | 这些135目网格用于在 Sapphire 盘表面创建字母数字图案 "常规的" 通过碳镀膜处理蓝宝石圆片（如上所述），使其可用于关联光电子显微镜（CLEM）。100个载网/瓶。 |
| 高压冷冻机 | ABRA Fluid AG，瑞士维德瑙 | HPM 010 | 该HPF仪器已用于本方案。 |
| 高压冷冻仪 | Leica Microsystems，奥地利维也纳 | EMPACT 2 | "EMPACT 2"，作为本方案中所用HPM设备（如上所述）的替代方案。 |
| 冷冻管 | Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | Z763667-500EA | 用于液氮中冷冻固定样品的长期保存。每包包含500个冻存管。 |
| 液氮杜瓦瓶 | Cole-Parmer GmbH，德国韦尔泰姆 | GZ-05094-60 | 用于液氮中冷冻固定样品的长期储存，配备可容纳1600个冻存管的冷冻架。 |
| 自动冷冻置换（AFS）仪器 | Leica Microsystems，奥地利维也纳 | EM AFS2 | 该设备可进行冷冻置换和逐步降温（PLT）处理，实现低温下树脂的包埋与聚合。 |
| 四氧化锇（OsO₄） | 美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德，电子显微镜科学公司 | 19150 | 4% 水溶液，每盒含 10 支 2 mL 安瓿瓶。 |
| 醋酸铀酰（UA） | Serva，德国海德堡 | 77879.01 | 含25克（UA）-2H的瓶子2O. |
| 超声波破碎仪 | Bandelin Electronic，柏林，德国 | 329 | "Sonorex Super RK 31" 是一种用于本方案中混合OsO4的含水清洗液的高功率超声波清洗浴4 在制备FS培养基时，以及在准备Ua时。 |
| 玻璃蒸馏丙酮 | 美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德，电子显微镜科学公司 | 10015 | 100 mL 瓶装 |
| 体视显微镜 | Leica Microsystems，奥地利维也纳 | Leica M80 | 用于日常检查的常规体视显微镜，配备相机以拍摄图像。 |
| 环氧树脂 | 美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德，电子显微镜科学公司 | 14120 | Embed 812 是一种试剂盒，包含多种组分，必须按照生产商规定的比例混合使用。 |
| 流通环 | Leica Microsystems，奥地利维也纳 | 16707157 | 含100件的包装 |
| 试剂浴 | Leica Microsystems，奥地利维也纳 | 16707154 | 含100件的包装 |
| 超薄切片机 | Leica Microsystems，奥地利维也纳 | Leica EM UC7 | 用于在室温下制备半薄和超薄切片的超薄切片机 |
| Ultra 35 ° 金刚石刀 | Diatome Ltd.，尼道 瑞士 | AGG339-735 | 这种刀具的刃长为3 mm。 |
| 超细镊子 | 美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德，电子显微镜科学公司 | E78318 | "风格 3X"用于处理电镜载网。 |
| EM载网格 | 美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德，电子显微镜科学公司 | G2010-Cu | 100 个载网/瓶 |
| EM网格存储盒 | 美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德，电子显微镜科学公司 | 71155 | 可容纳100个载网。 |
参考文献
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重印与许可
