方法文章

恒定压力下肺固定用于评估小鼠肺气肿

DOI：

10.3791/58197

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2019年9月26日

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1Department of Respiratory Medicine, Juntendo University Graduate School of Medicine, Juntendo University, 2Pharmaceutical Planning Group, Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.

本文内容

摘要

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本文介绍了一种用于肺组织固定的实用方案，可为源自肺气肿小鼠模型的肺组织样本提供稳定的条件，以便进行组织学评估。该方法的主要优势在于，能够在相同恒定压力下固定多个肺组织，且不会导致肺组织塌陷或萎陷。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肺气肿是慢性阻塞性肺疾病（COPD）的重要特征。在使用肺气肿小鼠模型的研究中，需要进行最佳的肺组织固定，以获得可靠的肺组织学标本。由于肺组织的结构主要由空气和组织构成，因此在固定过程中存在肺组织塌陷或萎缩的风险。目前存在多种肺组织固定方法，每种方法各有优缺点。本文介绍的肺组织固定方法采用恒定压力，可为肺气肿小鼠模型研究提供理想的组织学评估条件。该方法的主要优势在于可同时对多个肺组织样本进行条件一致的固定。肺组织标本来源于长期暴露于香烟烟雾的小鼠。肺组织固定过程使用专用设备以实现恒定压力的控制。该恒定压力可使肺组织保持在相对充分膨胀的状态。因此，该方法能够制备出适用于评估香烟烟雾诱导的轻度肺气肿的肺组织学标本。

引言

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慢性阻塞性肺疾病（COPD）是全球主要的致死原因之一1。吸烟是COPD最重要的致病因素，但其发病机制尚未完全阐明。COPD具有两个主要特征，包括进行性气流受限和肺部异常的炎症反应。肺气肿样病变在COPD患者肺部常有发生2。肺气肿的病理学特征表现为肺泡壁的破坏3。已有多种动物物种被用于构建COPD的体内模型（如狗、豚鼠、猴子和啮齿类动物）4。然而，小鼠已成为构建COPD模型最常用的动物。这具有诸多优势，包括成本低、可进行遗传修饰、基因组信息丰富、抗体资源广泛，以及可使用多种小鼠品系5。目前尚无一种小鼠模型能够完全模拟人类COPD的所有特征，因此研究人员需根据具体研究目的选择最合适的模型6。肺气肿小鼠模型是当前可用的多种COPD小鼠模型之一。其他模型还包括急性加重小鼠模型、全身共病模型和COPD易感性模型7。

肺气肿小鼠模型可通过多种外源性因素诱导产生，包括化学试剂和香烟烟雾暴露4。化学物质暴露（例如弹性蛋白酶）可导致严重的肺气肿类型，而香烟烟雾则引起轻度肺气肿8,9。香烟烟雾被认为是慢性阻塞性肺疾病（COPD）发病机制的主要原因；因此，选择香烟烟雾作为建立COPD小鼠模型的方法是合理的10。已有大量研究采用香烟烟雾在小鼠中诱导肺气肿。例如，Nikula 等人通过将 B6C3F1 雌性小鼠暴露于香烟烟雾中 7 或 13 个月，成功建立了肺气肿小鼠模型11。我们亦通过衰老标志物蛋白/SMP-30 基因敲除（KO）小鼠建立了肺气肿小鼠模型12。至关重要的是，需采用适当的肺组织固定方法，以清晰显示由香烟烟雾暴露所致的这种轻度肺气肿模型。

已建立多种肺组织固定的实验方法13。然而，目前尚无评估肺气肿的肺组织固定的金标准方法14。本实验室的多项研究已证实，本文所介绍的固定系统可通过创建稳定的条件，有效用于肺气肿的评估12,15,16,17,18。当前系统的主要优势在于，可同时在相同条件下固定多个肺组织样本，且避免肺组织塌陷或萎陷。该肺组织固定系统使用一些特殊设备，使肺组织标本能够在设定时间内以适当的恒定压力进行膨胀固定。该特殊设备由三部分组成，包括下部容器、上部容器和泵。肺组织标本置于下部容器中，该容器与加压的固定剂相连，从而使上下容器之间的固定剂液面形成25 cmH2O的压力差19。

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方案

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以下方法已获得顺天堂大学医学院动物护理与使用委员会的批准，并遵循日本科学委员会于2006年6月1日发布的《动物实验的恰当实施指南》。本方法主要包括三个步骤：1）小鼠解剖，2）肺脏放血，3）借助专用设备对肺组织进行固定。通常情况下，肺组织标本在固定48小时后进行包埋处理12,15,16,17,18。

1. 小鼠解剖

  1. 测量小鼠的体重，然后确定需要给予的戊巴比妥剂量。
  2. 以每公斤体重70 mg的剂量经腹腔注射戊巴比妥，并通过脚趾夹捏无反应来确认麻醉效果。
  3. 以45°角插入针头，直至穿透皮肤和肌肉。回抽针栓确认出现空气负压后，再注射戊巴比妥。
  4. 通过无反射性运动反应确认麻醉状态。
    注意： 建议使用麻醉小鼠而非处死小鼠，以实现肺部完全去血。
  5. 沿中线切开小鼠皮肤和腹肌，切口方向朝向头部区域。
  6. 横向剪开，以提供更大的操作空间。

2. 肺脏放血

  1. 暴露膈肌层，并用镊子刺穿。
  2. 打开胸腔空间，剪开胸骨区域，使肺和心脏清晰可见。
  3. 在左心房和右心室处剪开心脏。
  4. 将一根套管（24 G）插入右心室区域，并朝向头侧推进，直至进入肺动脉，如图1所示。
  5. 启动泵，使1×磷酸盐缓冲液（PBS）循环（约200 mL/h），直至所有肺组织变为白色。

3. 肺组织固定

  1. 取出气管、肺和心脏。
  2. 切断周围结缔组织，游离这三个器官。
  3. 用缝合线结扎右侧主支气管，并切除右侧肺的所有肺叶。
  4. （可选）：右侧肺的肺叶分为四个部分。从右侧主支气管上切断这些部分，并分别处理为冷冻组织样本。
  5. 将心脏和左侧肺的肺叶插入固定剂中，固定剂置于10 mL注射器内。
    注意：固定剂具有危险性。请佩戴适当的防护装备（例如，长橡胶手套），并在通风良好的环境中操作。
  6. 使用10 mL注射器创建真空环境以充气膨胀肺组织，如图2所示。
  7. 将套管（20 G）插入气管并打结固定。
  8. 使用1 mL注射器向肺内注入固定剂以检查是否存在泄漏。
  9. 转移至肺组织固定压力装置，如图3所示。
  10. 固定完成后，取出肺组织样本，并将气管打结封闭。

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结果

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如前所述，产生持续恒定压力的专用设备可分为三个部分（图3A）。下部为插入肺组织样本的位置（图4A）。肺组织通过套管（20 G）连接至福尔马林液流末端，并使用三通旋塞阀进行连接（图4B）。压力由上下两个容器之间固定剂液面的高度差产生（图5）。压力差为25 cmH2O；然而，通过高度调节旋钮，可将压力在25–30 cmH2O范围内进行调节（图5）。泵通过管道连接上下容器（图3A），以维持固定剂液面25 cm的高度差。试剂流动方向如图3B...

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讨论

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本文介绍的大鼠肺组织固定方法并非首创，但该系统具有多项优势。首先，该方法可同时在相同条件下固定多个肺组织（最多20个）。毒理病理学学会指出，重力灌注固定的灌注压力范围为22–25 cmH2O22。值得注意的是，已有多个研究采用25 cmH2O的压力进行肺组织固定13,19,23,24,25,26,27，本实验室目前的系统也采用了这一压力值12,15,...

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披露

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作者声明无竞争利益。

致谢

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本工作部分由日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金（编号26461199，T. Sato）以及顺天堂大学医学院环境与性别医学研究所（编号E2920，T. Sato）资助。资助方未参与本方法的设计及论文撰写。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% 甲醛溶液（中性缓冲甲醛溶液）Wako060-01667
弯头镊子HammacherHSC187-11
套管针，20G 规格TerumoSR-FS2032
套管针，22G 规格TerumoSR-OT2225C用于肺脏放血的套管针
镊子HammacherHSC184-10
Kimtowel 纸巾Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark)61000
Kimwipe 擦拭纸Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark)62011
下部容器（丙烯酸玻璃材质）Tokyo Science定制压力设备组件
滚压泵Nissin Scientific CorpNRP-75用于肺脏放血的泵装置
滚压泵 RP-2000Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd)160200压力设备用泵
硅胶管 Ø 9 mmSansyo94-0479压力设备组件
Somnopentyl（64.8 mg/mL）Kyoritsu SeiyakuSOM02-YA1312戊巴比妥钠
手术剪HammacherHSB014-11
缝合线，0 号NescosutureGA01SW
1 mL 注射器TerumoSS-01T
带针头的 1 mL 注射器TerumoSS-01T2613S
10 mL 注射器TerumoSS-10ESZ
三通旋塞阀TerumoTS-TR1K01
上部容器（丙烯酸玻璃材质）Tokyo Science定制压力设备组件

参考文献

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