超超磁氧化铁纳米探针在肺外结核检测的合成、表征及应用

Summary

为了改进结核分枝杆菌抗原的血清学诊断测试，我们开发了超副磁性氧化铁纳米探针来检测肺外结核病。

Abstract

合成了一种分子成像探针，包括超副磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒和结核分枝杆菌表面抗体（MtbsAb），以提高肺外结核（ETB）的成像灵敏度。合成了SPIO纳米探针，并与MtbsAb结合。纯化SPIO-MtbsAb纳米探针采用TEM和NMR进行特征。为了确定探针的靶向能力，SPIO-MtbsAb纳米探针与Mtb一起孵育，用于体外成像测定，并注射到Mtb接种小鼠体内进行磁共振（MR）的体内调查。Mtb和THP1细胞磁共振成像（MRI）的对比度增强降低与SPIO-MtbsAb纳米探针浓度成正比。在30分钟静脉注射SPIO-MtbsAb纳米探针注射Mtb感染小鼠后，与接受PBS注射的小鼠相比，在T2加权MR图像中，肉芽肿位位的信号强度提高了14倍。MtbsAb 纳米探针可用作 ETB 检测的新方式。

Introduction

在全球范围内，肺外结核病（ETB）占结核病病例的很大比例。然而，ETB诊断往往错过或延迟，因为它的阴险的临床表现和诊断测试的不良表现;错误的结果包括痰涂片对酸快杆菌的阴性，缺乏组织病理学上的肉芽肿组织，或未能培养结核分枝杆菌（Mtb）。与典型病例相比，ETB发生频率较低，并且很少涉及 Mtb 杆菌的释放。此外，它通常被本地化在难以接近的部位，如淋巴结，胸膜，和骨关节区域^1。因此，侵入性程序，以获得足够的临床标本，这使得细菌确认的风险和困难，是必不可少的^2，3，4。

市售的ETB抗体检测测试在临床检测中不可靠，因为它们的灵敏度范围广泛（0.00-1.00）和所有肺外位点结合的特异性（0.59-1.00）。5 。干扰素β、培养性滤蛋白（CFP）和早期分泌抗原靶点（ESAT）的酶相关免疫点（ELISPOT）检测已用于诊断潜伏和活性结核病。然而，结果因诊断ETB^6、7、8的不同疾病部位而异。此外，皮肤PPD（纯化蛋白衍生物）和昆蒂弗龙-结核病经常提供假阴性结果^9。QuantiFERON-TB-2G是一种全血免疫反应测定，不需要从受影响的器官标本，这可能是一个替代诊断工具^{6，10，11。}其他通常用于结核病脑膜炎的诊断方法，如聚合酶链反应，仍然过于麻木不仁，无法自信地排除临床诊断^12，13。这些常规测试表明，没有足够的诊断信息来发现肺外感染部位。因此，临床上需要新的诊断模式。

分子成像旨在设计新的工具，可以直接筛选体内疾病过程的特定分子靶点^14，15。超副磁性氧化铁（SPIO），一种T2加权NMR造影剂，可以显著提高磁共振（MR）成像（MRI）16、17的特异性和灵敏度。这种新的功能成像模式可以通过配体受体相互作用在分子水平上精确绘制组织变化草图。在这项研究中，合成了一种新的分子成像探针，包括SPIO纳米粒子，与Mtb表面抗体（MtbsAb）结合，用于ETB诊断。SPIO纳米探针是微创对组织和身体在检查^18，19。此外，这些纳米探针由于其顺磁特性，可以在低浓度下显示精确的MR图像。此外，SPIO纳米探针似乎引起最少的过敏反应，因为铁离子的存在是正常生理的一部分。在这里，在细胞和动物模型中评估了针对ETB的SPIO-MtbsAb纳米探针的灵敏度和特异性。结果表明，纳米探针可作为超敏感成像剂用于ETB诊断。

Protocol

所有有关动物实验的协议均遵循美国国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》（2011 年第 8 版）的标准实验室动物育种操作程序，并经机构动物护理和使用委员会。

1. SPIO纳米粒子合成

1. 在室温下大力搅拌 Dextran T-40 （5 mL; 50% w/w） 和水性 FeCl₃±6H₂O （0.45 g; 2.77 mmol） 和 FeCl₂×4H₂O （0.32 g; 2.52 mmol） 溶液的混合物，制备涂有氧化铁的磁性纳米颗粒。
2. 快速添加 NH₄OH （10 mL; 7.5% v/v）。
3. 进一步搅拌黑色悬浮液1小时;随后，在17，300 x g下离心10分钟，然后取出骨料。
4. 通过凝胶过滤色谱²⁰将最终的SPIO产品与未绑定的D-40分离。
5. 将反应混合物（总体积 = 5 mL）装入2.5厘米×33厘米柱中，在pH 7.0下加入含有0.1M Na醋酸和0.15 M NaCl的缓冲液。
6. 在空隙体积中收集纯化的氧化铁磁性纳米颗粒，分别使用盐酸和苯酚/^{硫酸方法测定}330和490nm的铁和dextran的柱。

2. SPIO-MtbsAb合成

1. 合成SPIO结合EDBE使用先前报告的方法^21，22。
2. 合成SPIO-EDBE-琥珀氢化物（SA）。
   1. 在室温下搅拌SPIO-EDBE和SA的碱性溶液（5M NaOH;10 mL）24小时。
   2. 使用分子多孔膜管（12，000-14，000 MW 截止）对2L蒸馏水进行20次变化。每次更换 6 小时。
3. 最后，将100μL的SPIO-EDBE-SA（4毫克/毫克铁）加入400μL的4.5毫克/mL MtbsAb，使用1-羟基苯甲酸酯和（苯甲酰胺-1-yloxy）三重磷酸二磷酸二铵作为催化剂，在24h室内搅拌溶液。
4. 最后，通过凝胶过滤色谱法将溶液与未结合抗体分离。
5. 将反应混合物（5 mL）加载到2.5厘米×33厘米柱上，并使用PBS缓冲液洗脱。使用双辛酸酸蛋白测定试剂盒²³确认Ab_nano粒子复合物（即纳米探针）。

3. 粒子形态观察和松弛层测量

1. 在100kV电压下使用透射电子显微镜检查平均粒径、形态和尺寸分布。
   1. 将复合色散滴铸到 200 个网状铜格栅上，并在室温下干燥，然后再将其加载到显微镜上。
2. 在 20 MHz 和 37.0 °C 和 37.0 °C ± 0.1 °C 下使用 NMR 松弛计测量纳米探针的松弛时间值（T₁和T_2）。
   1. 每次测量前校准松弛计。
   2. 分别记录通过反转恢复和Carr-Purcell-Meiboom-Gill脉冲序列生成的8个数据点的_r1和r2值，以确定r1和r2放松度^20。

4. 细胞成像

1. 在 RPMI 1640 中培养人单核细胞 THP-1，在 37°C 下 5% CO₂培养箱中培养 10% 的胎儿牛血清、50 μg/mL 金霉素硫酸盐、100 单位/mL 青霉素 G 钠、100 μg 链霉素硫酸盐和 0.25 μg/mL 真菌区。
2. 用10⁶个菌落形成单元（CFU）孵育SPIO-MtbsAb纳米探针（2 mM），在37°C的5%CO2培养箱中孵育1×10⁷活性单核细胞，在37°C下孵化1小时。
3. 在200 x g下离心管，并丢弃上清液。在介质（200 μL）中重新溶解颗粒。
4. 使用快速梯度回波脉冲序列扫描样本（重复时间 （TR） = 500;回波时间 （TE） = 20;翻转角度 = 10°）通过3.0-T MRI来确定纳米探针的特异性和灵敏度^21，22。

5. BCG（卡尔梅特-盖林）接种

1. 重建冻干疫苗或细菌库存在Sauton的介质，然后用盐水稀释股票，直到正确分散，如前^所述24。
2. 接种从ADIMMUNE（台湾台北）获得的M.bovis BCG活衰减应变（康诺特菌株;ImmuCyst Aventis， 巴斯德·梅里厄斯） 在 0.1 mL/鼠标 （即 10⁷ CFU） 的体积在贸易到小鼠的左或右背颈皮，如前面描述的²³。将盐水注射到小鼠体内作为阴性对照。BCG 接种后，每天监测动物。
3. 使用二氧化碳安乐死在细菌接种后1个月牺牲动物。从内皮接种部位收获组织。将组织固定在10%的形式素中，并嵌入石蜡的序列部分在5-10μm. 染色组织部分与血氧林/eosin和Ziehl-Neelsen染色酸快细菌²⁴和柏林蓝色铁^铁25。

6. 体内核磁共振成像

1. 将氯胺酮（80毫克/千克体重）和木兰辛（12毫克/千克体重）分皮注射到小鼠体内进行动物麻醉。
2. 将SPIO-TbsAb探针（2 nmol/200μL）注射到小鼠的尾静脉中。MR图像小鼠在探针注射前后，然后每5分钟30分钟获得T2加权快速自旋回波图像（TR = 3000;TE = 90;视场 = 8）。
3. 使用信号强度 （SI） 定量分析所有 MR 图像，这是 Mtb 肉芽肿中心与肉芽肿区域相邻的背部肌肉的可比位置的测量目标区域。
4. 使用 SI 测量值计算相对信号增强功能，在使用公式注入造影剂之前（SIpre;控制）和 0-3 小时后（SIpost） 注入对比度代理
   
   [（SIpost - SIpre）/SIpre] = 100
   
   其中SIpre是病变的SI在预增强扫描和SIpost是增强后扫描^21，22的病变的SI。

Results

SPIO-MtbsAb 纳米探针合成和表征
SPIO纳米粒子被设计成与MtbsAb结合。稳定在SPIO纳米粒子表面的dextran被上氯二苯并联。SPIO纳米粒子随后与EDBE结合，以激活dextran端的初级胺功能组。SA 然后被结合形成 SPIO-EDBE-SA。SPIO-MtbsAb 纳米探针在耦合剂存在的情况下，通过 MtbsAb 与 SPIO-EDBE-SA 结合，在最后一步中形成。SPIO-MtbsAb纳米探针的TEM图像（图1）表明SPIO-MtbsAb纳米探针的外观分布良好。SPIO-MtbsAb 纳米探针芯的平均尺寸为 3.8 × 0.4 nm（200 个粒子计算）。

在水溶液中，纳米探针的松弛度值r₁和r₂分别为23×3和151×8^mM-1s-1，分别为20 MHz和37.0°C~0.1°C。SPIO-MtbsAb纳米探针的r

Discussion

与相关研究类似，我们对SPIO-MtbsAb纳米探针的发现表明^Mtb27、28具有显著特异性。在小鼠模型中注射TB后1个月，发现了皮下Mtb肉芽肿。典型的结核肉芽肿学发现包括淋巴细胞渗透、上皮性巨噬细胞的存在和新血管化。酸速杆菌分散在结核病变中，证实了MtbsAb免疫性化学发现。这表明Mtb表面抗原和MtbsAb之间的免疫反应。柏林蓝突出显示了与MtbsAb相同的区域，证实了探头与酸速Mtb结合的特异性。

值得注意的是，Mtb和单细胞THP1细胞MRI的负对比度增强程度与SPIO-MtbsAb纳米探针浓度成正比。当携带Mtb肉芽肿的小鼠施用SPIO-MtbsAb纳米探针时，在T2加权MR图像上注意到，与使用PBS注射的对立面位相比，在肉芽肿位上的信号减少14倍。这表示对比度代理的大量累积。结果表明，获得对比剂特定靶向的可能性，可降低临床诊断的剂量要求。

我们的发现表明，这些纳米探针在Mtb肉芽肿病变中积累可检测...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
（苯并三唑-1-基氧基）三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐	Sigma-Aldrich
1-羟基苯并三	Sigma-Aldrich
葡聚糖（T-40）	GE Healthcare Bio-sciences AB
环氧氯丙烷，2,2'-（乙烯二氧基）双（乙胺）	Sigma-Aldrich
三氯化铁六水合物	Fluka
氯化亚铁四水合	Fluka
人单核细胞 THP-1
牛分枝杆菌 BCG	巴斯德 Mérieux	Connaught 菌株;ImmuCyst Aventis
MRI	GE medical Systems	3.0-T， Signa
NH4OH	Fluka
NMR 弛豫计	Bruker	NMS-120 Minispec
Sephacryl S-300	GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25	GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM 分子多孔膜管，12,000 -14,000 MW 截止	Spectrum Laboratories Inc
TB 表面抗体 - Mtb	Acris Antibodies GmbH	BP2027
透射电子显微镜	JEOL	JEM-2000 EX II