超超磁氧化铁纳米探针在肺外结核检测的合成、表征及应用

Summary

为了改进结核分枝杆菌抗原的血清学诊断测试，我们开发了超副磁性氧化铁纳米探针来检测肺外结核病。

Abstract

合成了一种分子成像探针，包括超副磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒和结核分枝杆菌表面抗体（MtbsAb），以提高肺外结核（ETB）的成像灵敏度。合成了SPIO纳米探针，并与MtbsAb结合。纯化SPIO-MtbsAb纳米探针采用TEM和NMR进行特征。为了确定探针的靶向能力，SPIO-MtbsAb纳米探针与Mtb一起孵育，用于体外成像测定，并注射到Mtb接种小鼠体内进行磁共振（MR）的体内调查。Mtb和THP1细胞磁共振成像（MRI）的对比度增强降低与SPIO-MtbsAb纳米探针浓度成正比。在30分钟静脉注射SPIO-MtbsAb纳米探针注射Mtb感染小鼠后，与接受PBS注射的小鼠相比，在T2加权MR图像中，肉芽肿位位的信号强度提高了14倍。MtbsAb 纳米探针可用作 ETB 检测的新方式。

Introduction

在全球范围内，肺外结核病（ETB）占结核病病例的很大比例。然而，ETB诊断往往错过或延迟，因为它的阴险的临床表现和诊断测试的不良表现;错误的结果包括痰涂片对酸快杆菌的阴性，缺乏组织病理学上的肉芽肿组织，或未能培养结核分枝杆菌（Mtb）。与典型病例相比，ETB发生频率较低，并且很少涉及 Mtb 杆菌的释放。此外，它通常被本地化在难以接近的部位，如淋巴结，胸膜，和骨关节区域^1。因此，侵入性程序，以获得足够的临床标本，这使得细菌确认的风险和困难，是必不可少的^2，3，4。

市售的ETB抗体检测测试在临床检测中不可靠，因为它们的灵敏度范围广泛（0.00-1.00）和所有肺外位点结合的特异性（0.59-1.00）。5 。干扰素β、培养性滤蛋白（CFP）和早期分泌抗原靶点（ESAT）的酶相关免疫点（ELISPOT）检测已用于诊断潜伏和活性结核病。然而，结果因诊断ETB^6、7、8的不同疾病部位而异。此外，皮肤P....

Protocol

所有有关动物实验的协议均遵循美国国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》（2011 年第 8 版）的标准实验室动物育种操作程序，并经机构动物护理和使用委员会。

1. SPIO纳米粒子合成

1. 在室温下大力搅拌 Dextran T-40 （5 mL; 50% w/w） 和水性 FeCl₃±6H₂O （0.45 g; 2.77 mmol） 和 FeCl₂×4H₂O （0.32 g; 2.52 mmol） 溶液的混合物，制备涂有氧化铁的磁性纳米颗粒。
2. 快速添加 NH₄OH （10 mL; 7.5% v/v）。
3. 进一步搅拌黑色悬浮液1小时;随后，在17，300 x g下离心10分钟，然后取出骨料。
4. 通过凝胶过滤色谱²⁰将最终的SPIO产品与未绑定的D-40分离。
5. 将反应混合物（总体积 = 5 mL）装入2.5厘米×33厘米柱中，在pH 7.0下加入含有0.1M Na醋酸和0.15 M NaCl的缓冲液。
6. 在空隙体积中收集纯化的氧化铁磁性纳米颗粒，分别使用盐酸和苯酚/^{硫酸方法测定}330和490nm的铁和dextran的柱。

Results

SPIO-MtbsAb 纳米探针合成和表征
SPIO纳米粒子被设计成与MtbsAb结合。稳定在SPIO纳米粒子表面的dextran被上氯二苯并联。SPIO纳米粒子随后与EDBE结合，以激活dextran端的初级胺功能组。SA 然后被结合形成 SPIO-EDBE-SA。SPIO-MtbsAb 纳米探针在耦合剂存在的情况下，通过 MtbsAb 与 SPIO-EDBE-SA 结合，在最后一步中形成。SPIO-MtbsAb纳米探针的TEM图像（图1）表明SPIO-MtbsAb纳米探针的外观分布良好。SPIO-MtbsAb 纳米探针芯的平均尺寸为 3.8 × 0.4 nm（200 个粒子计算）。

在水溶液中，纳米探针的松弛度值r₁和r₂分别为23×3和151×8^mM-1s-1，分别为20 MHz和37.0°C~0.1°C。SPIO-MtbsAb纳米探针的r

Discussion

与相关研究类似，我们对SPIO-MtbsAb纳米探针的发现表明^Mtb27、28具有显著特异性。在小鼠模型中注射TB后1个月，发现了皮下Mtb肉芽肿。典型的结核肉芽肿学发现包括淋巴细胞渗透、上皮性巨噬细胞的存在和新血管化。酸速杆菌分散在结核病变中，证实了MtbsAb免疫性化学发现。这表明Mtb表面抗原和MtbsAb之间的免疫反应。柏林蓝突出显示了与MtbsAb相同的区域，证实了探头与酸速Mtb结合的特异性。

值得注意的是，Mtb和单细胞THP1细胞MRI的负对比度增强程度与SPIO-MtbsAb纳米探针浓度成正比。当携带Mtb肉芽肿的小鼠施用SPIO-MtbsAb纳米探针时，在T2加权MR图像上注意到，与使用PBS注射的对立面位相比，在肉芽肿位上的信号减少14倍。这表示对比度代理的大量累积。结果表明，获得对比剂特定靶向的可能性，可降低临床诊断的剂量要求。

我们的发现表明，这些纳米探针在Mtb肉芽肿病变中积累可检测.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
（苯并三唑-1-基氧基）三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐	Sigma-Aldrich
1-羟基苯并三	Sigma-Aldrich
葡聚糖（T-40）	GE Healthcare Bio-sciences AB
环氧氯丙烷，2,2'-（乙烯二氧基）双（乙胺）	Sigma-Aldrich
三氯化铁六水合物	Fluka
氯化亚铁四水合	Fluka
人单核细胞 THP-1
牛分枝杆菌 BCG	巴斯德 Mérieux	Connaught 菌株;ImmuCyst Aventis
MRI	GE medical Systems	3.0-T， Signa
NH4OH	Fluka
NMR 弛豫计	Bruker	NMS-120 Minispec
Sephacryl S-300	GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25	GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM 分子多孔膜管，12,000 -14,000 MW 截止	Spectrum Laboratories Inc
TB 表面抗体 - Mtb	Acris Antibodies GmbH	BP2027
透射电子显微镜	JEOL	JEM-2000 EX II