李斯特菌脑部感染

革兰氏阳性细菌李斯特菌是一种兼生的胞内病原体, 是世界上最致命的食物传播病原体之一。摄取l-李斯特菌污染的食物会导致人类李斯特菌病, 一种严重的侵袭性疾病, 主要针对孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷患者¹人。李斯特菌是美国食品传播病原体死亡的主要原因之一, 李斯特菌病的病死率高达 20–30%, 是所有食物传播病原体的最高²。目前尚无疫苗用于L. 李斯特菌和细菌有效地扩散到远端器官和大脑的能力通过血脑屏障 (BBB) 可能导致危及生命的脑膜炎和大脑的殖民化^3,4,5,6. 细菌性脑膜炎通常是严重的;虽然大多数接受治疗的人康复, 感染可能会引起严重的并发症,例如, 脑损伤, 听力丧失, 或学习障碍儿童。据预测, 在美国⁷的社区获得性脑膜炎中,李斯特菌至少占10%。

细菌向大脑和脑膜传播的主要途径是通过血液。在大脑血管中循环的细菌能够穿过脑屏障引起脑部感染。脑屏障是一种高度血管化的屏障系统, 可以保护大脑不受血液中流动的异物的侵害。内皮细胞构成一层线的血管的内部表面^8,9。除了L. 李斯特菌, 多种细菌病原体, 如淋球菌奈瑟,肺炎链球菌,大肠杆菌,流感嗜血杆菌b 型 (Hib) 能够殖民化通过脑屏障^3,4,5,6的大脑。然而, 当检查被感染老鼠的大脑中的细菌负担时, 确定细菌是否越过了脑屏障是很重要的, 否则, 大脑中的细菌负担可能代表仍然在大脑血管中的细菌。因此, 在确定脑组织匀浆的成藏单元 (CFU) 之前, 必须灌注所有血液中的小鼠。

在本研究中, 我们描述了在体内方法检查的脑细胞增生性李斯特菌感染。在这里描述的方法, 我们使用了 L. 李斯特菌10403S。¹⁰.李斯特菌10403S 是最广泛使用的实验室菌株之一, 研究系统性李斯特菌病在小鼠感染模型中的应用。本协议以标准静脉注射的L. 型李斯特菌为基础, 然后灌注小鼠。图 1显示了小鼠感染协议的示意图。从非灌注或灌注小鼠中采集到的李斯特菌感染的大脑和其他器官, 并确定了细菌的器官负担。这些方法不仅可以确定受感染动物的脑部细菌的全殖化, 还有利于确定细菌是否穿透了体内的脑屏障, 以调停大脑的侵袭。必须强调的是, 这项实验室议定书应在与有关的机构生物安全委员会和动物设施管理部门协商后进行。

所有动物都要保持和处理, 最大限度地照顾, 以尽量减少不适在过程中。该程序将按照机构动物照料和使用委员会以及所有联邦、州和地方法律进行。还请注意, 实验室实验将按照生物安全等级2准则进行。

1. 增殖性李斯特菌在小鼠感染研究中的生长

1. 高压釜500毫升脑心输液 (BHI) 琼脂培养基在1升锥形瓶中制备固体培养基板。让媒体在56摄氏度的水浴冷却, 然后添加链霉素在最后浓度为100µg/毫升。
   1. 将25毫升的培养基/培养皿倒入培养皿中。允许板材在室温下干燥 (22 ^oC-25 °c)。如有需要, 可将板材干燥37摄氏度, 直至完全干燥。
2. 使用无菌接种循环和无菌技术, 获得一个循环充满冰冻L. 李斯特菌应变 10403S^11,12从冻结在 BHI 媒体加30% 甘油和维持在-80 °c 冷藏库的股票文化.
   1. 在 BHI 琼脂/链霉素板上条纹的L. 李斯特菌, 使单一细菌菌落可以被隔离。把盘子放在一个37摄氏度的孵化箱里过夜 (18 小时到24小时), 以生长出L. 李斯特菌群。
   2. 使用无菌接种循环, 从 BHI 琼脂板中选取一个单一的i. 李斯特菌群, 并将该菌落接种为含有100µg/毫升链霉素的5毫升 BHI 汤的不育试管。
3. 在静止的孵化室里, 在一夜之间孵化出一夜间的李斯特菌培养管。
   1. 第二天, 目视检查L. 李斯特菌培养的生长 (BHI 介质将混浊) 和漩涡短暂, 以确保文化的统一悬浮。
   2. 灌装去除细菌培养的1毫升整除, 用分光光度计测量 600 nm (OD₆₀₀) 的光学密度。
      注: 无菌 BHI 汤可作为分光光度计读数的空白, 用于测量i. 型李斯特氏细胞的光学密度。在阅读光密度前, BHI 中的l-李斯特菌培养也可以稀释 (五倍)。
   3. 通过电镀10倍的 CFU 序列稀释, 确定每毫升 BHI 培养的李斯特菌群形成单元的数量。这是很有用的, 以建立一个关系的光密度的L. 李斯特菌培养和细菌数量的每毫升的文化。一般而言, a L. 李斯特菌培养的 OD₆₀₀为 1.0, 相当于每毫升细菌的大约 1 x 10⁹ CFU。

2. 小鼠感染李斯特菌的制备

1. 在动物感染前十八至二十四小时, 在含有100µg/毫升链霉素的 BHI 汤中, 生长L. 李斯特菌培养, 并根据步骤1中的说明确定每毫升₆₀₀/~ CFU。
   注意: 老鼠通常在感染前一周被下令, 并且在进行感染研究之前就已经适应了动物设施。在这项研究中, 6–8周老女性 BALB/c 小鼠 (每组5只老鼠) 被安置在一个屏障环境中的哈佛医学院 BSL2-level 动物遏制设施, 并提供食品和水广告随意。
2. 根据细菌培养的每毫升 CFU, 确定感染每只老鼠所需的李斯特菌培养量。稀释无菌磷酸盐缓冲盐水 pH 值 7.2 (PBS) 中的l-李斯特菌培养, 使细菌浓度适当。小鼠通常感染静脉注射200µL 的 PBS 含有 10⁴ CFU 细菌/动物。
3. 在含有100µg/毫升链霉素的 BHI 琼脂板上, 验证接种中的L. 型李斯特菌的数量10倍的串联稀释。在一夜之间孵化37摄氏度孵化器中的板块, 以确定每只老鼠接种的李斯特菌数量, 如下所示:
   接种 (CFU) = (数量的殖民地 x 稀释因子)/mL 镀 x 体积 (mL) 注入

3. 静脉尾静脉注射法感染L. 李斯特菌的实验研究

1. 从装有小鼠的笼子里取下盖子和食物箱, 将笼子放在 250 W 红外线热灯下5分钟。
   注意: 这种方法允许尾部静脉扩张, 确保注射更容易执行。
   1. 小心地将动物放在适当大小的鼠标抑制装置中, 在尾静脉注射时安全地抑制动物。
2. 混合L. 李斯特菌接种 (步骤 2.2), 并将接种装入1毫升注射器, 配备26克针。
3. 找到鼠标的侧尾静脉, 用酒精垫或75% 乙醇喷雾清洁注射部位。
4. 用注射器用26克针轻轻地将200µL 的李斯特菌悬浮在侧尾静脉中。
   1. 使用棉纱布对注射部位施加压力, 以止血, 并将动物放在新的笼子里。
      注意: 对所有要注射的老鼠执行这个过程, 并用适当的标签标记笼子。为了确定注射后浓度的接种李斯特菌, 重复步骤2.3 使用剩余的接种量。每只老鼠静脉注射的接种李斯特菌感染报告为平均 CFU 测量的前和后注射接种样本。
5. 每天监测受感染的动物, 并注意任何明显的疾病迹象 (例如,竖起的皮毛, 驼背的姿势, 缓慢的运动, 体重减轻)。在 72 h 感染后 (例如24、48 h 感染后), 从研究和人道的牺牲中移除看起来明显奄奄一息的动物。继续每日监测, 直到所有剩余的动物被牺牲72小时后感染。
   注: 50% 的致死剂量 (LD₅₀) 为L. 李斯特菌 10403S BALB 小鼠是 ~ 的 x 10⁴ CFU/动物。使用本议定书感染 LD₅₀剂量的小鼠可能出现疾病迹象, 如上文所示, 调查人员可预期老鼠会在感染后72小时内开始屈服于感染。

4. 感染李斯特菌的小鼠的解剖和心脏灌注

1. 在 72 h 感染后 (或在较早的时间点), 弄死受感染的小鼠使用了机构动物伦理委员会批准的协议, 如 CO₂窒息, 其次是颈椎脱位。
   注: 如果要进行血液收集, 尽量减少血管撕裂, 同时执行颈椎脱位。
   1. 确认老鼠已被安乐死, 没有爪子抽搐反应。
      注: 如果要进行心脏灌注, 设置一个自动泵/灌注系统的流量为4毫升/分钟。
2. 将动物放在解剖盘的背面, 在腹部皮毛/皮肤表面应用75% 乙醇。
3. 使用剪刀, 在腹壁切开切口, 将切口伸展到肋骨下方。
4. 暴露隔膜和内脏器官。
   注意: 小心不要撕裂内脏器官。
5. 通过切开隔膜切开胸腔, 并将肋骨保持在双边上以暴露心脏的左心室。
6. 使用钝钳, 轻轻地抓住心脏, 并插入一个21克蝶针连接到一个灌注系统到左心室, 然后仔细切开右心房收集血液 (约0.2 毫升) 到2毫升管, 含10毫米乙二胺酸 (EDTA) 防止凝固。图 2显示了鼠标心脏灌注的原理图。
   注: 如果不进行灌注, 可以用1毫升注射器采集心脏穿刺, 并迅速转移到2毫升, 含有10毫米 EDTA, 以防止凝血。L.然后按照所述的情况 (步骤 5.1) 收获李斯特菌感染的器官。
7. 开始灌注和灌注的动物4分钟与15–20毫升的 PBS 含有10毫米 EDTA。
   注: 通过观察血液和 PBS-EDTA 溶液流经右心房并进入解剖盘, 评估灌注。在完全灌注后, 大脑和肝脏会出现脱皮, 确保剩余的细菌来自收获的器官而不是循环的血液。

5. 器官收割和细菌负担的测定

1. 在灌注后, 通过仔细去除所附的任何血管和韧带, 将器官分别放置在含有5毫升不育的冷 (4 °c) PBS 的无菌15毫升圆锥管中, 从而获得器官 (如肝、脾)。在冰上储存样品直到进一步的处理。
2. 为了收割大脑, 用剪刀把头斩首在耳朵后面, 在动物的眼睛和中线之间切开头皮皮肤。如果需要, 修剪多余的组织保持剪刀压在头骨上。
   1. 轻轻地将剪刀的一个尖端插入孔万能 (头骨底部的孔, 通过它脊髓通过), 并横向切割两侧的头骨。
   2. 轻轻地将头骨放在鼠眼中间的中线, 一定要施加侧向压力。避免大脑的扰动, 保持脑组织与剪刀之间的最小接触。
   3. 使用细尖钳, 打开头骨揭露大脑, 并在大脑的底部和头骨的底部放置一把铲子, 以消除大脑。
      注意: 这导致脑神经纤维撕裂。
   4. 小心地将大脑转移到一个15毫升的圆锥管, 含有5毫升的无菌冷 PBS。
   5. 丢弃鼠标胴体, 并对其余的动物重复这些步骤。
      注: 一旦所有器官都被收割, 清理程序区域, 准备器官均匀化, 以确定细菌的负担。
3. 在生物安全柜中, 通过插入尖端和运行均质机, 在5% 漂白剂, 无菌水, 75% 乙醇, 无菌水中, 每一个单独的15毫升圆锥管, 清洁和消毒的组织均质体尖端。
4. 融汇被传染的脑子 (~ 二十年代在设置 6, 最大 rpm) 在15毫升圆锥管直到未看见的组织片断依然存在。
   1. 清洁在步骤5.3 中描述的均质机, 以防止细菌对下一个器官样本进行污染。
   2. 对所有其他器官 (如肝、脾) 进行均匀化处理。
   3. 在均匀化过程完成后, 按照步骤5.3 中的说明清洗均质机, 然后存储到进一步使用。
5. 在无菌 PBS 中制备10倍稀释的器官组织匀浆, 并在 BHI 琼脂/链霉素板上稀释, 以确定每个器官的 CFU。
   注意: 用类似的方法来确定每毫升血液的 CFU。
   1. 在所有稀释被镀, 转移板材到一个37°c 孵化室过夜。
   2. 第二天, 计算每个板块上的菌落数, 以确定每个器官或血毫升的细菌总数, 如下所示:
      CFU/器官 = (殖民地的数量 x 稀释因子) 或匀浆被镀的 x 5
      CFU/毫升血 = (菌落数 x 稀释因子)/毫升的血镀

大脑是高度血管化的, 而L. 李斯特菌是已知的感染细胞类型存在于血液中3,13。所描述的协议是用来证明L. 李斯特的能力, 通过血脑屏障 (BBB) 导致大脑感染的小鼠。为了确定细菌是否在体内越过了脑屏障, 在确定大脑中的细菌负担之前, 老鼠的血流灌注。否则, 获得的 CFU 可能包括在脑血管中存在的细菌。(图3A) 和肝脏 (图 3B) 在72小时后感染后或之后发生的李斯特菌感染。图 4显示了L. 感染李斯特菌的小鼠器官的细菌负担, 并说明了每只老鼠的大脑、血液、肝脏和脾脏中存在的细菌数量。这些数据表明, 动物的灌注并没有显著影响本研究中所检查的小鼠器官的细菌负担 (图 4)。

图 1: 示意图概述L. 体内的李斯特菌感染协议.请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 心脏灌注程序示意图.灌注通过鼠标心脏显示插入的灌注针在左心室 (步骤 4.6)。针插入后, 立即切口进入右心房开始灌注过程。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: 感染后的小鼠器官L. 李斯特菌。BALB 小鼠经外侧尾静脉注射感染, 野i. 型李斯特菌 10403S, (1-2 x 104细菌/动物)。在72小时感染后, 小鼠被安乐死, 并收集小鼠器官, 或安乐死小鼠通过心脏灌注15-20 毫升的 PBS, 在器官采集前含有10毫米 EDTA。有代表性的大脑 (A) 和肝脏 (B) 是从非灌注或灌注小鼠中显示出来的。注意, 老鼠器官在灌注后会出现白色/苍白 (脱皮), 确保细菌 CFU 来自于所收获的器官组织, 而不是组织内的循环血液。这一数字已从 Ghosh等201814修改。请单击此处查看此图的较大版本.

图 4: 感染小鼠器官的细菌负担.BALB 小鼠经静脉感染野生i. 型李斯特菌 10403S, 如图 3所示。在72小时后感染, 收集了每只老鼠的大脑、血液、肝脏和脾脏, 并确定了细菌的负担。在单独的实验中, 对小鼠进行全身灌注, 并测定各脏器内的细菌负担。水平线表示中值。* 对于这个组, 血液在心脏灌注开始前立即收集。这一数字已从 Ghosh等201814修改。请单击此处查看此图的较大版本.

作者声明没有竞争的财政利益。