感染期间，Listeria monocytogenes 能够穿过血脑屏障，定植于脑组织。本方案中，我们演示了如何评估小鼠感染后器官中的细菌定植情况。同时提供了一种对整个器官进行灌注的实验步骤，以准确定量脑实质中的细菌数量。
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摘要
摘要
单核细胞增生李斯特菌 是一种常与食源性感染相关的胞内细菌病原体。该病原体的 单核细胞增生李斯特菌 穿过血脑屏障（BBB）令人担忧，因为它可能导致危及生命的脑膜炎和脑炎。血脑屏障可保护脑微环境免受感染后血液中各种有毒代谢物和微生物病原体的侵害，从而维持脑内稳态。关于其作用机制 单核细胞增生李斯特菌 目前尚不完全清楚存在于血液中的病原体如何穿过血脑屏障（BBB）引发脑部感染，同时也缺乏可用于研究脑部感染的可靠模型系统 L. monocytogenes在此，我们介绍一种简单的小鼠感染模型，用于确定细菌是否已穿过血脑屏障（BBB），并定量分析定植于脑组织中的细菌载量 体内. 在该方法中，动物通过静脉注射感染 L. monocytogenes 通过暴露于CO实施人道安乐死2 随后实施颈椎脱位。在采集感染器官前，对动物进行心脏灌注。灌注前采集血液，并通过将血液或器官匀浆液进行系列稀释后涂布于琼脂平板，计数形成的菌落数，以确定每器官或每毫升血液中的细菌数量。该方法可用于研究增强脑部感染的新型受体-配体相互作用 L. monocytogenes 并且可以轻松地适用于多种细菌病原体的研究。
引言
革兰氏阳性菌Listeria monocytogenes是一种兼性胞内病原体，也是全球最致命的食源性病原体之一。摄入被L. monocytogenes污染的食物可导致人类李斯特菌病，这是一种严重的侵袭性疾病，主要影响孕妇、新生儿、老年人以及免疫功能低下者1。L. monocytogenes是美国由食源性病原体引起的死亡主要原因之一，李斯特菌病的病例死亡率高达20–30%，在所有食源性病原体中居首位2。目前尚无针对L. monocytogenes的疫苗，且该细菌能够通过穿越血脑屏障（BBB）有效扩散至远端器官和大脑，从而引发危及生命的脑膜炎并导致大脑定植3,4,5,6。细菌性脑膜炎通常较为严重；尽管大多数接受治疗的患者可以康复，但感染可能引发严重并发症，例如，脑损伤、听力丧失或儿童学习障碍。L. monocytogenes预计占美国所有社区获得性脑膜炎病例的至少10%7。
细菌....
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方案
所有动物均须以最大程度的谨慎进行饲养和操作，以尽量减少实验过程中可能引起的不适。实验操作必须遵守机构动物护理和使用委员会以及所有联邦、州和地方法律法规。同时请注意，实验室实验应按照生物安全二级（Biosafety Level 2）指南进行。
1. 用于小鼠感染研究的单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）培养
- 在1 L锥形瓶中高压灭菌500 mL脑心浸液（BHI）琼脂培养基以制备固体培养平板。将培养基置于56 °C水浴中冷却，然后加入链霉素，终浓度为100 µg/mL。
- 将25 mL培养基倒入培养皿中。在室温（22℃）下静置干燥 oC-25 °C）。如有需要，可将平板在37 °C下干燥至完全干燥。
- 使用无菌接种环和无菌技术，取一环完整的冷冻菌种 单核细胞增生李斯特菌 菌株 10403S11,12 从含有30%甘油的BHI培养基冻存菌种中复苏，并在-80 °C冰箱中保存。
- 划线接种 单核细胞增生李斯特菌 在BHI琼脂/链霉素平板上划线接种，以便分离单个细....
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结果
大脑具有高度血管化特征，且已知单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）能够感染存在于血液中的多种细胞类型3,13。本实验方案用于证明单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）可穿越小鼠血脑屏障（BBB），进而引起脑部感染。为了确定细菌是否在体内（in vivo）穿越了血脑屏障，需在检测脑组织细菌载量前，先对小鼠进行血液灌注。否则，所获得的菌落形成单位（CFU）可能包含存在于脑血管内的细菌。图3A（Figure 3A）和图3B（Figure 3B）分别展示了感染单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）的小鼠在感染后72小时、灌注前或灌注后的脑组织和肝脏组织。图4（Figure 4
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讨论
单核细胞增生李斯特菌 可导致人类发生危及生命的脑膜脑炎。既往研究已证实，该细菌能够穿越血脑屏障（BBB）并在脑组织中定植。感染过程中，细菌入侵脑组织的途径可能有三种：细菌直接穿透血脑屏障、被单核细胞包裹后以隐蔽方式运输、以及通过感染的单核细胞携带细菌进入脑组织3以及轴突迁移 L. monocytogenes 引起脑干脑炎的菌株15由于大脑具有高度血管化特征 L. monocytogenes 在全身性感染期间已知会在血液中循环，因此可测定其水平 L. monocytogenes 能够穿透血管以定植中枢神经系统和大脑至关重要。
在所述实验方案中，通过静脉尾静脉注射在小鼠体内建立全身性L. monocytogenes感染。该方法可用于绕过肠道屏障，专门评估细菌从血液侵入血脑屏障（BBB）的能力。本方案描述了多个重要参数。其中一个关键参数是在体内实验中使用适当的细菌感染剂量。这一点至关重要.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）美国公共卫生服务基金项目 AI103806 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 脑心浸液培养基 | Becton Dickinson | 237200 | |
| 硫酸链霉素 | Amresco | 0382-50G | |
| 培养皿 | VWR | 25384-342 | |
| 甘油 | VWR | 97062-832 | |
| IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic 匀浆器 | IKA | 3352109 | 型号：T18BS1 |
| 分光光度计 | Beckman Coulter | DU 800 系列 | |
| BALB/c 小鼠 | Jackson Laboratory | 型号 #000651 | |
| 1 mL 注射器 | Becton Dickinson | 309659 | |
| 26 G 针头 | Becton Dickinson | 305115 | |
| 21 G 蝶形针头 | Becton Dickinson | 367281 | |
| 乙二胺四乙酸 | Sigma-Aldrich | 60004 | |
| 15 mL 锥形管 | VWR | 21008-918 | |
| 圆底试管 | VWR | 60819-546 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Corning | 46-013-CM | |
| 不锈钢刮勺 | VWR | 82027-520 | |
| 不锈钢剪刀（6.5 英寸） | VWR | 82027-592 | |
| 不锈钢剪刀（4.5 英寸） | VWR | 82027-578 | |
| 不锈钢钝头镊子 （4.5 英寸） | VWR | 82027-440 | |
| 不锈钢细尖镊子 （6 英寸） | VWR | 82027-406 |
参考文献
- Radoshevich, L., Cossart, P. Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).
- de Noordhout, C. M., et al. The global burden of....
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重印与许可
