感染期间，Listeria monocytogenes 能够穿过血脑屏障，定植于脑组织。本方案中，我们演示了如何评估小鼠感染后器官中的细菌定植情况。同时提供了一种对整个器官进行灌注的实验步骤，以准确定量脑实质中的细菌数量。
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摘要
摘要
单核细胞增生李斯特菌 是一种常与食源性感染相关的胞内细菌病原体。该病原体的 单核细胞增生李斯特菌 穿过血脑屏障（BBB）令人担忧，因为它可能导致危及生命的脑膜炎和脑炎。血脑屏障可保护脑微环境免受感染后血液中各种有毒代谢物和微生物病原体的侵害，从而维持脑内稳态。关于其作用机制 单核细胞增生李斯特菌 目前尚不完全清楚存在于血液中的病原体如何穿过血脑屏障（BBB）引发脑部感染，同时也缺乏可用于研究脑部感染的可靠模型系统 L. monocytogenes在此，我们介绍一种简单的小鼠感染模型，用于确定细菌是否已穿过血脑屏障（BBB），并定量分析定植于脑组织中的细菌载量 体内. 在该方法中，动物通过静脉注射感染 L. monocytogenes 通过暴露于CO实施人道安乐死2 随后实施颈椎脱位。在采集感染器官前，对动物进行心脏灌注。灌注前采集血液，并通过将血液或器官匀浆液进行系列稀释后涂布于琼脂平板，计数形成的菌落数，以确定每器官或每毫升血液中的细菌数量。该方法可用于研究增强脑部感染的新型受体-配体相互作用 L. monocytogenes 并且可以轻松地适用于多种细菌病原体的研究。
引言
革兰氏阳性菌Listeria monocytogenes是一种兼性胞内病原体，也是全球最致命的食源性病原体之一。摄入被L. monocytogenes污染的食物可导致人类李斯特菌病，这是一种严重的侵袭性疾病，主要影响孕妇、新生儿、老年人以及免疫功能低下者1。L. monocytogenes是美国由食源性病原体引起的死亡主要原因之一，李斯特菌病的病例死亡率高达20–30%，在所有食源性病原体中居首位2。目前尚无针对L. monocytogenes的疫苗，且该细菌能够通过穿越血脑屏障（BBB）有效扩散至远端器官和大脑，从而引发危及生命的脑膜炎并导致大脑定植3,4,5,6。细菌性脑膜炎通常较为严重；尽管大多数接受治疗的患者可以康复，但感染可能引发严重并发症，例如，脑损伤、听力丧失或儿童学习障碍。L. monocytogenes预计占美国所有社区获得性脑膜炎病例的至少10%7。
细菌扩散至大脑和脑膜的主要途径是通过血液。在脑部血管中循环的细菌能够穿过血脑屏障（BBB）引发脑部感染。血脑屏障是一种高度血管化的屏障系统，可保护大脑免受血液中循环的外来颗粒侵害。内皮细胞构成一层衬于血管内表面的结构8,9此外 L. monocytogenes，多种细菌病原体，例如 脑膜炎奈瑟菌, 肺炎链球菌, 大肠杆菌，以及 流感嗜血杆菌 b型（Hib）能够通过跨越血脑屏障定植于大脑3,4,5,6然而，在检测感染小鼠脑组织中的细菌载量时，必须确定细菌是否已穿过血脑屏障（BBB），否则脑组织中的细菌载量可能仅反映仍存在于脑血管内的细菌。因此，在测定脑组织匀浆的菌落形成单位（CFU）之前，必须先对小鼠进行灌流以彻底清除血液。
在本研究中，我们描述了 体内 用于检测的方法 L. monocytogenes 脑部感染。本文所述方法中，我们使用了 L. monocytogenes 菌株 10403S 单核细胞增生李斯特菌 10403S 是研究小鼠感染模型中全身性单核细胞增生李斯特菌病最常用的实验室菌株之一10. 本方案基于标准的静脉注射方法 L. monocytogenes 随后进行小鼠灌流。小鼠感染实验方案的示意图如下所示： 图1. L. monocytogenes-收集非灌注或灌注小鼠的感染脑组织及其他器官，测定器官中的细菌载量。这些方法不仅有助于确定感染动物脑组织中的总体细菌定植情况，还可用于判断细菌是否已穿透血脑屏障 体内 以介导对大脑的侵袭。需要强调的是，本实验方案必须在咨询相关机构生物安全委员会及动物设施管理部门后方可实施。
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方案
所有动物均须以最大程度的谨慎进行饲养和操作，以尽量减少实验过程中可能引起的不适。实验操作必须遵守机构动物护理和使用委员会以及所有联邦、州和地方法律法规。同时请注意，实验室实验应按照生物安全二级（Biosafety Level 2）指南进行。
1. 用于小鼠感染研究的单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）培养
- 在1 L锥形瓶中高压灭菌500 mL脑心浸液（BHI）琼脂培养基以制备固体培养平板。将培养基置于56 °C水浴中冷却，然后加入链霉素，终浓度为100 µg/mL。
- 将25 mL培养基倒入培养皿中。在室温（22℃）下静置干燥 oC-25 °C）。如有需要，可将平板在37 °C下干燥至完全干燥。
- 使用无菌接种环和无菌技术，取一环完整的冷冻菌种 单核细胞增生李斯特菌 菌株 10403S11,12 从含有30%甘油的BHI培养基冻存菌种中复苏，并在-80 °C冰箱中保存。
- 划线接种 单核细胞增生李斯特菌 在BHI琼脂/链霉素平板上划线接种，以便分离单个细菌菌落。将平板置于37 °C培养箱中过夜（18 h至24 h）进行培养 L. monocytogenes 菌落。
- 使用无菌接种环，挑取单个 单核细胞增生李斯特菌 从BHI琼脂平板上挑取单菌落，接种于含有5 mL添加100 µg/mL链霉素的BHI液体培养基的无菌试管中。
- 孵育 L. monocytogenes 培养管在静置培养箱中略微倾斜30°过夜。
- 第二天，目视检查 L. monocytogenes 培养以促进生长（BHI培养基将变浑浊），并短暂涡旋振荡以确保菌液均匀悬浮。
- 无菌条件下取1 mL细菌培养液，测定其在600 nm处的光密度（OD600）600使用分光光度计。
注意：在测定光学密度之前，使用无菌BHI肉汤作为空白对照进行分光光度计读数。 L. monocytogenes 培养。该 L. monocytogenes 在读取光密度之前，也可将培养物用BHI稀释（2到5倍）。 - 确定数量 单核细胞增生李斯特菌 通过将培养物进行10倍系列稀释后涂布平板，测定每毫升BHI培养液中的菌落形成单位（CFU）。该方法可用于建立培养物光密度与菌体数量之间的关系。 L. monocytogenes 培养物及其每毫升培养液中的细菌数量。通常，OD600 1.0 L. monocytogenes 培养物相当于约 1 x 109 每毫升细菌菌落形成单位
2. 小鼠感染用单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）的制备
- 在动物感染前18至24小时，于含有100 µg/mL链霉素的BHI肉汤中培养L. monocytogenes菌种，并按照步骤1所述测定OD600/每毫升的~CFU值。
注：小鼠通常需在感染前一周订购，并在进行感染实验前适应动物设施环境。本研究中，将6–8周龄的雌性BALB/c小鼠（每组5只 ）饲养于哈佛医学院生物安全二级（BSL2）动物防护设施的屏障环境中，并自由供应食物和饮水ad libitum。 - 根据细菌培养物的~CFU/mL值，确定每只小鼠所需的L. monocytogenes培养物用量。用无菌磷酸盐缓冲液（pH 7.2，PBS）将L. monocytogenes培养物稀释至适当的细菌浓度。通常通过静脉注射方式，每只小鼠注射200 µL含1–2 × 104 CFU细菌的PBS。
- 通过将10倍系列稀释液接种至含100 µg/mL链霉素的BHI琼脂平板上，验证接种物中L. monocytogenes的数量。将平板置于37 °C培养箱中过夜培养，按以下公式计算每只小鼠接种的L. monocytogenes数量：
接种量（CFU）=（菌落数 × 稀释倍数）/ 涂布体积（mL）× 注射体积（mL）
3. 通过尾静脉注射静脉内感染单核细胞增生性李斯特菌（L. monocytogenes）小鼠模型
- 取下小鼠笼盖及食槽，将笼子置于250 W红外线加热灯下5分钟。
注意：该方法可使尾静脉扩张，便于注射操作。- 将动物小心放入合适尺寸的小鼠固定器中，以便在尾静脉注射期间安全地固定动物。
- 混匀L. monocytogenes接种液（步骤2.2），并将接种液吸入配备26 G针头的1 mL注射器中。
- 找到小鼠的一条侧尾静脉，使用酒精棉片或75%乙醇喷雾清洁注射部位。
- 使用配备26 G针头的注射器，将200 µL L. monocytogenes悬液轻柔地注入侧尾静脉。
- 用棉质纱布短暂按压注射部位以止血，并将动物放入新笼中。
注意：对所有需注射的小鼠执行此操作，并在笼子上贴上适当标签。为确定注射后L. monocytogenes接种液的浓度，使用剩余接种液重复步骤2.3。每只小鼠静脉注射的L. monocytogenes感染剂量以注射前后接种液样本测得的平均CFU表示。
- 用棉质纱布短暂按压注射部位以止血，并将动物放入新笼中。
- 每日监测感染动物，记录任何明显的疾病症状（例如，毛发竖立、弓背姿势、行动迟缓、体重减轻）。在感染后72小时之前出现明显濒死状态的动物（例如，感染后24、48小时）应从实验中移除并实施人道安乐死。持续每日监测，直至所有剩余动物在感染后72小时被处死。
注意：L. monocytogenes菌株10403S在BALB/c小鼠中的50%致死剂量（LD50）约为1–2 × 104 CFU/只。采用本方案接种LD50剂量的L. monocytogenes后，小鼠可能出现上述疾病症状，研究者可预期小鼠在感染72小时后开始因感染死亡。
4. 感染小鼠的解剖与心脏灌注 L. monocytogenes
- 感染后72小时（或在更早的预期时间点），根据机构动物伦理委员会批准的方案对感染小鼠实施安乐死，例如使用CO2窒息法，随后进行颈椎脱位。
注意：若需采集血液，在进行颈椎脱位时应尽量避免撕裂血管。- 通过观察小鼠是否无足部抽搐反应，确认其已死亡。
注意：若需进行心脏灌注，请预先设置自动泵/灌注系统，流速为4 mL/min。
- 通过观察小鼠是否无足部抽搐反应，确认其已死亡。
- 将动物仰卧置于解剖盘中，并在腹部毛发/皮肤表面涂抹75%乙醇。
- 使用剪刀在腹壁做一切口，并将切口向上延伸至肋骨下方。
- 暴露膈肌和内脏器官。
注意：操作时应小心，避免损伤任何内脏器官。 - 剪开膈肌，并沿两侧剪开肋骨，以暴露心脏左心室。
- 使用钝头镊子轻轻夹住心脏，将连接灌注系统的21 G蝶形针插入左心室，然后小心剪开右心房，将血液（约0.2 mL）收集至含有10 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的2 mL离心管中，以防止凝血。小鼠心脏灌注的示意图见图2。
注意：若不进行灌注，可使用1 mL注射器经心脏穿刺采血，并迅速转移至含有10 mM EDTA的2 mL离心管中以防止凝血。随后按照描述的方法（步骤5.1）采集单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）感染的器官。 - 开始灌注，用含10 mM EDTA的PBS溶液以15–20 mL的总量对动物灌注4分钟。
注意：通过观察血液和PBS-EDTA溶液从右心房流出并进入解剖盘的情况来评估灌注效果。完全灌注后，脑和肝脏会呈现苍白状，表明残留细菌来源于所采集的器官，而非循环血液。
5. 器官采集与细菌载量测定
- 灌流后，仔细去除器官（例如肝脏、脾脏）上附着的血管和韧带，分别将器官放入含有 5 mL 无菌冷（4 °C）PBS 的无菌 15 mL 圆锥形离心管中。将样本置于冰上保存，直至进一步处理。
- 为获取脑组织，使用剪刀在耳后剪下头部，并沿动物两眼之间中线切开头皮。如有需要，将剪刀紧贴颅骨剪除多余组织。
- 将剪刀的一侧尖端轻轻插入枕骨大孔（脊髓穿过的颅底孔），然后向两侧横向剪开颅骨。
- 沿啮齿动物两眼之间中线轻轻剪开颅骨，注意施加侧向压力。避免扰动脑组织，尽量减少脑组织与剪刀的接触。
- 使用精细镊子打开颅骨以暴露脑组织，将刮勺置于脑组织底面与颅骨基底之间，以取出脑组织。
注：此操作会导致脑神经纤维撕裂。 - 小心将脑组织转移至含有 5 mL 无菌冷 PBS 的 15 mL 圆锥形离心管中。
- 丢弃小鼠尸体，并对剩余动物重复上述步骤。
注：所有器官采集完毕后，清洁操作区域，准备进行器官匀浆以测定细菌载量。
- 在生物安全柜中，将组织匀浆器的探头依次插入分别装有 5% 次氯酸钠、无菌水、75% 乙醇、无菌水的独立 15 mL 圆锥形离心管中，每次运行匀浆器 10 秒，以清洁并灭菌探头。
- 在 15 mL 圆锥形离心管中匀浆感染的脑组织（设置 6，约 20 秒，最大转速），直至无可见组织碎片残留。
- 按照步骤 5.3 所述方法清洁匀浆器，以防止细菌交叉污染至下一个器官样本。
- 对所有其他器官（例如肝脏、脾脏）执行匀浆操作。
- 匀浆过程完成后，按照步骤 5.3 所述方法清洁匀浆器，并存放备用。
- 用无菌 PBS 对器官匀浆液进行 10 倍系列稀释，并将稀释液涂布于 BHI 琼脂/链霉素平板，以测定每个器官的 CFU 数量。
注：采用类似方法测定每毫升血液中的 CFU 数量。- 所有稀释液涂板完成后，将平板转移至 37 °C 培养箱中过夜培养。
- 次日，计数每块平板上的菌落数量，按以下公式计算每个器官或每毫升血液中的总细菌数：
CFU/器官 = （菌落数 × 稀释倍数）/ 涂布的匀浆液体积（mL）× 5
CFU/mL 血液 = （菌落数 × 稀释倍数）/ 涂布的血液体积（mL）
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结果
大脑具有高度血管化特征，且已知单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）能够感染存在于血液中的多种细胞类型3,13。本实验方案用于证明单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）可穿越小鼠血脑屏障（BBB），进而引起脑部感染。为了确定细菌是否在体内（in vivo）穿越了血脑屏障，需在检测脑组织细菌载量前，先对小鼠进行血液灌注。否则，所获得的菌落形成单位（CFU）可能包含存在于脑血管内的细菌。图3A（Figure 3A）和图3B（Figure 3B）分别展示了感染单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）的小鼠在感染后72小时、灌注前或灌注后的脑组织和肝脏组织。图4（Figure 4
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讨论
单核细胞增生李斯特菌 可导致人类发生危及生命的脑膜脑炎。既往研究已证实，该细菌能够穿越血脑屏障（BBB）并在脑组织中定植。感染过程中，细菌入侵脑组织的途径可能有三种：细菌直接穿透血脑屏障、被单核细胞包裹后以隐蔽方式运输、以及通过感染的单核细胞携带细菌进入脑组织3以及轴突迁移 L. monocytogenes 引起脑干脑炎的菌株15由于大脑具有高度血管化特征 L. monocytogenes 在全身性感染期间已知会在血液中循环，因此可测定其水平 L. monocytogenes 能够穿透血管以定植中枢神经系统和大脑至关重要。
在所述实验方案中，通过静脉尾静脉注射在小鼠体内建立全身性L. monocytogenes感染。该方法可用于绕过肠道屏障，专门评估细菌从血液侵入血脑屏障（BBB）的能力。本方案描述了多个重要参数。其中一个关键参数是在体内实验中使用适当的细菌感染剂量。这一点至关重要...
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）美国公共卫生服务基金项目 AI103806 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 脑心浸液培养基 | Becton Dickinson | 237200 | |
| 硫酸链霉素 | Amresco | 0382-50G | |
| 培养皿 | VWR | 25384-342 | |
| 甘油 | VWR | 97062-832 | |
| IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic 匀浆器 | IKA | 3352109 | 型号：T18BS1 |
| 分光光度计 | Beckman Coulter | DU 800 系列 | |
| BALB/c 小鼠 | Jackson Laboratory | 型号 #000651 | |
| 1 mL 注射器 | Becton Dickinson | 309659 | |
| 26 G 针头 | Becton Dickinson | 305115 | |
| 21 G 蝶形针头 | Becton Dickinson | 367281 | |
| 乙二胺四乙酸 | Sigma-Aldrich | 60004 | |
| 15 mL 锥形管 | VWR | 21008-918 | |
| 圆底试管 | VWR | 60819-546 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Corning | 46-013-CM | |
| 不锈钢刮勺 | VWR | 82027-520 | |
| 不锈钢剪刀（6.5 英寸） | VWR | 82027-592 | |
| 不锈钢剪刀（4.5 英寸） | VWR | 82027-578 | |
| 不锈钢钝头镊子 （4.5 英寸） | VWR | 82027-440 | |
| 不锈钢细尖镊子 （6 英寸） | VWR | 82027-406 |
参考文献
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