利用飞行磨具测量西部玉米根虫（Diabrotica virgifera virgifera）（LeConte）的飞行倾向与飞行表现

摘要

飞行磨是用于比较年龄、性别、交配状态、温度或各种其他因素如何影响昆虫飞行能力的重要工具’其飞行行为。本文描述了在不同处理条件下，固定并测量西部玉米根虫飞行倾向和飞行表现的实验方案。

摘要

西方玉米根虫（Diabrotica virgifera virgifera LeConte）（鞘翅目：叶甲科）是美国北部玉米种植区一种具有重要经济影响的害虫。部分种群已对包括转Bt基因玉米在内的防控策略产生抗性，这类转基因玉米可表达源自苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）的杀虫毒素。了解西方玉米根虫的扩散行为对于建立抗性进化、传播及缓解模型至关重要。昆虫飞行行为，尤其是远距离飞行，其观察与表征本身具有较大难度。飞行磨装置为在实验室条件下直接检测飞行相关的发育和生理影响及其后果提供了手段，而这些数据无法通过田间研究获得。本研究利用飞行磨装置测量雌性根虫在22小时测试期间的飞行活动时间、飞行总次数，以及每次飞行的距离、持续时间和速度。16台飞行磨装置置于可程序化控制光照、温度和湿度的环境培养箱中。所使用的飞行磨为典型设计，其飞行臂可绕中心支点自由旋转。当昆虫被固定在飞行臂一端并进行飞行时，带动飞行臂旋转，每次旋转均由传感器记录并附带时间戳。软件对原始数据进行汇总，并进一步处理以生成目标飞行参数的统计摘要。飞行磨研究中最困难的环节是使用粘合剂将 tether（牵线）固定在昆虫体上，所用方法需根据具体物种进行优化。固定方式必须足够牢固，以保持昆虫体位稳定并在运动过程中不脱落，同时又不能干扰飞行时翅膀的自然运动。该固定过程要求操作者具备娴熟的技巧、精细的操作和快速的反应能力，因此对根虫操作过程进行视频记录具有重要参考价值。

引言

西方玉米根虫（Diabrotica virgifera virgifera LeConte）（鞘翅目：叶甲科）于1909年被确认为玉米作物的害虫¹。如今，它是美国玉米带最重要的玉米（Zea mays L.）害虫，其幼虫取食玉米根部，造成与此害虫相关的大部分产量损失。由于西方玉米根虫所导致的防治成本和玉米产量损失，每年估计超过10亿美元²。该害虫具有很强的适应能力，种群已对多种防治策略产生抗性，包括化学杀虫剂、轮作制度以及转基因Bt玉米³。要确定防治措施所需覆盖的空间范围，以减缓局部抗性（即抗性热点区域）的发展，关键在于更深入地了解该虫的扩散能力⁴。如果缓解措施仅局限于抗性热点周围过小的空间范围，则难以奏效，因为具有抗性的成虫会扩散至缓解区域之外⁵。因此，了解西方玉米根虫的飞行行为，对于制定有效的抗性管理计划至关重要。

飞行扩散在成年西方玉米根虫的生活史和生态学中起着重要作用⁶，该害虫的飞行行为可在实验室条件下进行研究。实验室中可采用多种方法测定昆虫的飞行行为。活动记录仪（actograph）可限制昆虫在垂直平面内飞行，用于测量昆虫飞行所持续的时间。已有研究利用活动记录仪比较不同年龄、体型大小、温度条件、杀虫剂敏感性及杀虫剂暴露史下西方玉米根虫雌雄个体的飞行持续时间与飞行节律模式^7,8,9。飞行隧道由追踪室和定向气流组成，特别适用于研究昆虫在追随气味羽流（例如候选信息素组分¹⁰或植物挥发物¹¹）时的飞行行为。飞行转轮（flight mills）可能是实验室研究昆虫飞行行为最常用的方法，可用于表征飞行倾向性和飞行能力的多个方面。在西方玉米根虫的研究中，实验室飞行转轮已被用于分析其进行短距离和持续飞行的倾向性，以及持续飞行的激素调控机制^12,13。 

飞行磨为在实验室条件下研究昆虫飞行行为提供了一种相对简单的方法，使研究人员能够测量多种飞行参数，包括周期性、速度、距离和持续时间。目前使用的许多飞行磨均源自Kennedy等人¹⁴以及Krogh和Weis-Fogh¹⁵设计的旋转装置。飞行磨在形状和尺寸上可能有所不同，但其基本原理保持一致。昆虫被固定并安装在一个可绕垂直轴以极小摩擦自由旋转的径向水平臂上。当昆虫向前飞行时，其运动路径被限制在水平面内做圆周运动，每旋转一圈所行进的距离由臂长决定。通常使用传感器检测因昆虫飞行活动引起的臂的每一次旋转。原始数据包括单位时间内的旋转次数以及飞行发生的时间。这些数据被输入计算机进行记录。多个飞行磨的数据通常可并行、近乎同时地记录，常见的装置包含16个或32个飞行磨组成的阵列。原始数据随后通过定制软件进一步处理，以获得飞行速度、独立飞行次数、飞行总距离和总持续时间等变量的数值。

由于形态学上的差异，例如昆虫整体大小、用于连接 tether 的目标区域的尺寸与形状、身体柔软程度和灵活性、麻醉的需求与方法、胶粘剂误用或溢出可能污染翅膀和/或头部等因素，不同昆虫种类在选择最佳 tethering 方法时各不相同，此外还有诸多其他细节需要考虑。以已报道的盾蝽（plataspid bug）¹⁶ 和小蠹（ambrosia beetle）¹⁷ 的可视化 tethering 操作为例，其 tether 附着的目标区域相对较大，且胶粘剂放置位置的容错性较高，因为头部和翅膀与附着点之间存在一定空间隔离。这并非低估 tethering 这些昆虫的难度——对任何昆虫种类而言，该操作都具有挑战性。然而，西方玉米根虫（western corn rootworm）尤其难以 tether：其前胸背板狭窄且短小，必须使用极少量的粘接材料（本例中为牙科蜡），并进行极为精确的固定，以避免干扰飞行时鞘翅的张开，同时避免接触头部，因为胶粘剂若触及复眼或触角，可能影响其行为表现。与此同时，tether 又必须牢固附着，以防被这种强飞行能力的昆虫挣脱。本文最重要的贡献即在于展示了玉米根虫成虫的 tethering 方法，可为从事该类或类似昆虫研究的研究人员提供一种可行且有价值的参考方案。

本文描述了用于有效固定并测定不同幼虫密度下饲养的西部玉米根虫成虫飞行活动的方法。图1 所示的飞行磨装置及软件源自 Jones 等人在线公布的設計¹⁸。固定技术根据 Stebbing 等人⁹ 的描述进行了修改。16 套飞行磨装置置于环境控制舱内，用于调控光照、湿度和温度（图2）。利用本装置或类似设置，结合以下技术，可检测多种可能影响西部玉米根虫飞行倾向和飞行能力的因素，包括年龄、性别、温度、光周期及其他多种因素。 

方案

1. 为飞行测试准备西部玉米根虫成虫

注意：如果需要控制或明确成虫的年龄，则必须先在野外采集成虫，再将其后代饲养至成虫期用于测试。如果对甲虫的年龄或标准化饲养环境无特殊要求，则可直接测试野外采集的成虫，此时本实验方案可从第2步开始。

1. 从目标玉米田中采集至少500只西方玉米根虫成虫，以确保获得足够数量的卵用于饲养足够数量的成虫。使用手动吸虫器从田间采集成虫。
   注意：建议在美国玉米带成虫数量高峰期（约7月下旬）进行采集，以确保采集到两性个体。若采集时间过早，多数为雄虫；若采集时间过晚，多数为雌虫。
2. 将采集到的雄性和雌性成虫放入一个网笼中，笼内放置切碎的玉米穗、玉米叶片组织、1.5%琼脂固体以及产卵基质。一个18 × 18 × 18 cm的网笼（网孔规格44 × 32，孔径650 µm）可同时容纳最多500只成虫。
   1. 使用田间种植的玉米作为玉米穗来源，选择处于R3期（乳熟期）的籽粒进行采集¹⁹。R3期的籽粒外部呈黄色，内部因淀粉积累而呈乳白色液体状。玉米穗可冷冻保存长达一年，待需要时再使用。喂养根虫时，去除苞叶并将玉米切成约3 cm厚的横向切片。切碎的玉米是成虫的主要食物，应每周更换两次。
   2. 从温室中任意生长阶段的玉米植株上获取叶片。叶片组织的用量应根据笼内成虫数量而定。避免使用田间植株，以防引入病害。
   3. 制备琼脂固体时，将15 g琼脂粉与1 L去离子水混合，加热至沸腾。趁热将液体倒入培养皿（100 mm × 15 mm）中。冷却后盖上皿盖，并置于冷藏（6° C）保存。琼脂为成虫提供水分来源，应每周更换两次。
   4. 准备产卵基质时，将40 g过筛田间土壤（<180 µm）放入培养皿中，用去离子水润湿，确保培养皿底部土壤呈现湿润状态。用针具在湿润土壤表面划痕。每周更换一次产卵基质，并将其置于25° C、60%相对湿度的培养箱中孵化至少一个月。
3. 卵孵化培养一个月后，将产卵基质内容物通过250 µm筛网冲洗，直至所有土壤被清除。将清洗后的卵置于10 mL量筒中进行定量。每1 mL约含10,000枚卵。
4. 将定量后的卵放入44 mL容器中，并覆盖过筛田间土壤（<180 µm）。西方玉米根虫卵在冬季经历专性滞育²⁰。为打破滞育，需将卵置于冷藏（6° C）中至少6个月。
   ​注意：卵可在冷藏中保存超过5个月，但卵的活力随时间下降。保存12个月后，孵化率可能极低甚至无孵化。
5. 至少冷藏5个月后，将卵取出并置于25° C、60%相对湿度的培养箱中。新生幼虫最早可在取出冷藏后16天开始孵化。
6. 卵孵化后，在44 mL塑料容器底部放置三颗已萌发的玉米籽粒，使根部暴露（即不覆盖土壤）。使用软毛刷将12只新生幼虫转移至根部表面。
7. 向40 mL过筛土壤（<600 µm）中加入4.5 mL去离子水。将湿润土壤覆盖在已接种新生幼虫的萌发籽粒上，并用网布覆盖容器，防止幼虫逃逸。
8. 在设置44 mL塑料容器的同一天，准备一个473 mL容器，内含未萌发的玉米籽粒。稍后将根虫幼虫转移至该较大容器中。籽粒数量决定每株植物所需的幼虫密度。加入120 g土壤混合物，其中包含50%过筛田间土壤（<600 µm）和50%盆栽土，并用20 mL去离子水润湿。
9. 7天后，将44 mL容器中的全部内容物转移至473 mL容器中。此时幼虫为二龄幼虫。
   注意：此次转移至较大容器是为了在化蛹前为幼虫提供足够的根系生物量以供取食。
10. 通常在卵孵化后约26天观察成虫羽化。成虫羽化后具有飞行能力，若用手直接捕捉可能从473 mL容器中逃逸。建议使用带吸虫器的真空装置收集成虫。
11. 如需进行比较试验，可根据性别和/或日期对成虫进行分组。西方玉米根虫的性别可通过观察前胸基跗节的形态来确定²¹。雄虫的前胸基跗节宽大、呈方形，而雌虫的则狭窄、呈圆锥形。
    1. 将甲虫放入一个45 mL透明聚苯乙烯塑料小瓶中，并用带有6个小孔（直径约1 mm）的瓶盖盖紧。
    2. 麻醉甲虫。将连接至CO₂钢瓶调压阀的管子末端对准瓶盖上的小孔，让CO₂缓慢流入小瓶约10至15秒，直至成虫失去对瓶壁的抓握力。
       注意：麻醉后的昆虫将保持不动约1分钟。
    3. 将麻醉后的甲虫腹面朝上放置于倒置的塑料培养皿底部。小心地将未倒置的培养皿盖盖在甲虫上方，确保甲虫的跗节紧贴皿盖，以便在解剖显微镜下方便观察前胸基跗节。
12. 若实验要求甲虫在飞行前进行交配，则应使用至少5日龄的雄虫与新羽化的雌虫交配。
    注意：使用较年长的雄虫可确保其在与未交配雌虫接触时已达到性成熟。雌虫在成虫羽化时即具备性成熟，而雄虫需在羽化后5至7天的发育期才能达到性成熟^22,23。

2. 飞行测试前启动飞行仪软件程序

注意：飞行转盘程序文件（.vi 文件扩展名，需在商业软件平台中运行，参见材料表）及其使用说明可通过链接下载"数据分析流程" 和 "圆形飞行磨使用说明"，分别）在 "飞行仪线路连接与软件" 琼斯等人研究部分¹⁸ 网站。如果这些程序在软件平台的新版本或未来版本中不再可用，或者用户希望添加新功能，则可使用琼斯等人提供的程序。 ¹⁸ 可根据需要由用户进行修改。

1. 打开飞行磨软件程序（图3).
2. 输入以下信息 初始化 表。
   1. 设置 开始时间 和 结束时间 飞行测试所需的持续时间。
      注意：所有成虫应在开始时间前 30 分钟内完成绑缚并安装到飞行磨上。一名熟练的操作人员可能需要 30 至 45 分钟来完成 16 只甲虫的绑缚和飞行测试准备工作（参见 第3节).
   2. 设置 最小阈值（min） 至0。这可以确保记录飞行臂通过时的任何检测信号，也是Jones等推荐的默认设置。 ¹⁸.
   3. 设置 最大阈值（分钟） 至1。此处使用了1分钟。该值表示从传感器检测到飞行臂开始，必须经过1分钟的时间间隔 "呼叫" 飞行的终点
   4. 为文件输入一个名称。
   5. 设置 原始数据记录间隔（分钟） 至1。该数值用于控制原始数据输出报告的汇总间隔。此处设置为1 min。因此，例如转数的输出将按每分钟记录。
      注意：传感器活动的电子扫描实际时间间隔非常短，但设置为1分钟间隔可在满足大多数研究目的的精细记录尺度的同时，将电子表格输出的数据行数限制在便于目视检查的合理范围内。
3. 在……之下 受试者信息 标签，根据需要填写标有 ID、饮食、性别、物种和备注的列。
4. 点击 开始 位于屏幕左侧的按钮。程序将在按下该按钮后开始采集原始数据 当前时间 匹配 开始时间.

3. 将西方玉米根虫固定到飞行磨装置上

1. 将一段40毫米长的28号钢丝在中间弯成90°角。
   注意：钢丝也可由其他金属制成，例如铜或黄铜。
2. 取少量牙科蜡，体积略大于针尖，用指尖搓揉成球形。操作时应确保手指清洁，避免碎屑、污垢和油脂混入蜡中，否则可能影响蜡与昆虫体表的粘附。
3. 将弯曲后的40毫米钢丝一端插入蜡球中心。
4. 按照前述方法（见1.11.1和1.11.2）使用CO₂对试验成虫进行麻醉。
5. 将麻醉后的成虫置于平坦表面，使其背面向上。若甲虫无法完全平躺，应调整其足部位置使其平放。确保甲虫尽可能平贴于表面，以保证钢丝定位准确。
6. 用丁烷打火机短暂加热（< 1秒）钢丝上的牙科蜡。若加热时间过长，熔化的蜡会从钢丝上滴落。一旦蜡从钢丝脱落，不得再次使用，因其将无法有效粘附于昆虫体壁。
7. 小心地将带有熔化牙科蜡的钢丝末端放置于前胸背板的背侧表面，同时使钢丝另一端（即无牙科蜡的一端）沿腹部中线方向延伸。也可根据需要将无蜡端朝向头部方向；在此情况下，飞行中的甲虫将推动而非拉动飞行臂。注意熔化的蜡不得接触鞘翅或其缝合线，以免影响或阻碍飞行。
8. 将钢丝的自由端插入飞行磨具臂的中空金属管开口中。确保钢丝通过摩擦力紧密固定。可根据需要将束缚的甲虫调整为顺时针或逆时针方向飞行。
9. 安装甲虫后立即从大块纸巾上撕下一小片（直径约1厘米）纸巾碎片，提供给悬挂在飞行磨具上的束缚甲虫，使其跗节接触；大多数甲虫会抓住纸片并克服重力持握，直至首次飞行活动开始时自行松开。此举可显著减少初始阶段的逃逸或着陆行为。
   注意：飞行测试室内应尽量减少人员活动，仅在安装和移除成虫时进入。测试通常在安装后至少30分钟才开始（参见2.2.1项下的说明），在此期间及整个测试过程中，人员不应停留在飞行室内。
10. 完成飞行磨具测试后，移除所有已测试的成虫。通过轻轻将钢丝从前胸背板剥离，去除连接束缚装置与前胸背板的蜡珠。蜡珠易于分离且不会损伤体壁，便于后续需要时继续用于其他实验。

4. 保存从飞行磨程序中收集的数据。

1. 程序可设置为手动或自动模式。若程序设置为手动模式，则用户必须通过点击停止按钮来结束程序。若程序设置为自动模式，则当当前时间与结束时间一致时，程序将自动停止采集原始数据。
2. 飞行测试期结束后，点击退出。
3. 确保在程序初始化期间输入的文件名（步骤 2.2）下已保存 TDMS 文件。
4. 点击 TDMS 文件，并将文档另存为电子表格格式（.xlsx）。

5. 从已保存的电子表格（.xlsx）中提取飞行参数

注意：可自定义设计电子表格，用于处理飞行磨软件输出的原始数据。此处使用的软件程序与 Jones 等人¹⁸所述相同，但增加了一个附加程序，用于识别并汇总单个昆虫在测试期间的最长连续飞行。

1. 对于参与飞行活动的每个个体，电子表格将包含以下信息：飞行编号、总转数、开始时间、结束时间和飞行持续时间（分钟）。
   1. 要计算测试期间飞行的总距离，请将标记为“总转数”的列求和，然后乘以每转飞行的距离。每转飞行的距离取决于从中心转轴到所附昆虫的飞行臂长度。例如，如果该距离为15.9 cm，则每转相当于飞行1米。总转数也可在“测试统计”标签页中找到。
   2. 要计算测试期间飞行的总持续时间，请将标记为“飞行持续时间（min）”的列求和。
   3. 要确定最长连续飞行的距离和持续时间，请进入“测试统计”标签页，并查看标有“最长飞行#”的列。
   4. 飞行速度可通过飞行距离除以飞行持续时间计算得出。对于昆虫，速度通常以 m/s 或 km/h 表示。

结果

图4展示了飞行测试后预期结果的代表性示例。飞行数据来自爱荷华州立大学昆虫学系开展的实验工作。将6日龄交配后的西方玉米根虫雌成虫固定在飞行磨装置上，并置于环境控制舱中，条件设置为14:10光暗周期、60%相对湿度和25°C。从模拟黎明开始前30分钟起，将甲虫在飞行磨上持续放置22小时，并记录其飞行活动（图4）。黎明和黄昏通过程序控制的光照强度渐变来模拟，即在30分钟内光照强度从完全关闭逐渐变为完全开启（或反之）。生成的电子表格中第一个标签页汇总了经测试的各个成虫个体信息，这些信息来自步骤2.3的输入。后续标签页包含每个个体的飞行数据。最后两个标签页分别标记为“RAW DATA”和“Test Stats”。“RAW DATA”包含所有个体飞行活动的时间记录。“Test Stats”标明每只甲虫最长的连续飞行时间，以及最长连续飞行持续时间（分钟）、测试期间总飞行时间（分钟）和测试期间总旋转圈数的汇总数据。每次独立飞行的起止时间戳可用于分析飞行的周期性。

对于连接到飞行磨...

讨论

阐明西方玉米根虫的飞行行为对于制定有效的抗性管理方案至关重要。该害虫的飞行行为已在实验室中通过多种方法进行研究，包括活动记录仪、飞行通道和飞行磨。本文所述并图示的飞行磨可使昆虫进行不间断飞行，从而使研究人员能够量化整个试验期间单次飞行的距离、持续时间、周期性和速度等飞行参数。

对于西方玉米根虫及其他大多数昆虫种类而言，飞行磨实验方案中最困难的步骤是正确地将系线连接到成虫（步骤3）。由于前胸背板可用于固定金属丝的表面积较小，且体壁表面存在大量天然蜡质，该操作具有较大难度。此外，昆虫从CO₂麻醉状态复苏后很快开始活动，可用于完成系线操作的时间有限，这进一步增加了操作难度。在整个测试期间，必须确保系线位置正确并牢固粘附于甲虫的前胸背板。若系线位置偏移，甲虫在飞行磨上可能难以正常飞行，导致测得的飞行距离、持续时间和速度人为偏低。若牙科蜡未能将金属丝牢固粘附于前胸背板，甲虫可能在测试过程中逃脱。因此，操作者需保持双手清洁稳定，准确掌握加热蜡质至适宜操作温度的技巧，并在系线过程中保持自信，这些能力均可通过充分练习获得。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丁烷多用途打火机	BIC	UXMPFD2DC	用于固定昆虫时软化石蜡
透明聚苯乙烯塑料瓶（45 ml）	Freund Container and Supply	AS112	麻醉甲虫时用于盛放昆虫
脱水培养基，琼脂粉	Fisher Scientific	S14153	用于制备琼脂以保持成虫所需湿度
聚甲醛棒（直径1"，长3.75"）	多家供应商：可选用互联网上价格最低者。		作为飞行磨的支柱
牙科蜡	DenTek	47701000335	用于将固定丝粘附于前胸背板
铁氧体环形磁铁（外径：0.69”，内径：0.29”，厚度：0.118”；拉力7盎司）	Magnet Shop	63B06929118	成对使用——用于产生悬浮力
霍尔效应传感器	Optikinc	OHN3120U	在Optekinc网站左侧“磁性传感器”类别下查找该型号。链接中提供了当前供应商信息。
皮下注射用金属导管（22号规格；外径0.0358” × 内径0.01975” × 壁厚0.004”）	Small Parts, Inc.	HTX-22T-12	用于制作飞行磨臂和主轴杆
培养箱（104.1 × 85.4 × 196.1 cm）	Percival Scientific	I-41VL
LabVIEW完整开发系统软件，系统设计平台	National Instruments（参见 http://www.ni.com/en-us/shop/labview/select-edition.html）	LabVIEW 2018（完整版）	提供运行飞行磨文件（.vi扩展名）所需的环境，相关文件可从Jones等18在http://entomology.tfrec.wsu.edu/VPJ_Lab/Flight-Mill下载。 LabVIEW 2018完整版兼容Windows/Mac/Linux操作系统。
网笼（18 × 18 × 18 cm）	MegaView Science Co. Ltd.	BugDorm-4M1515	网孔尺寸 = 44 × 32，孔径650 µm
针状工具	BLICK	34920-1063	用于在实验室中划刻土壤表面以促进产卵
镍环形磁铁（外径3/16” × 内径1/16” × 厚度1/16”）	K&J Magnetics	R311	用于触发数字霍尔效应传感器
培养皿（100 mm × 15 mm）	Fisher Scientific	S33580A
塑料容器（44 ml）	Dart	150PC	用于幼龄幼虫的初期饲养
塑料容器（473 ml）	Placon	22885	用于较大龄期幼虫的饲养
圆头画笔（2号）	Simply Simmons	10472906	用于将刚孵化的初孵幼虫转移至根部表面
筛子（250-µm孔径）	Fisher Scientific	08-418-05	用于将虫卵与土壤分离
钢丝（28号规格）	The Hillman Group	38902350282
聚四氟乙烯棒（直径3/8"，长3/4"）	United States Plastic Corporation	47503	用于承载旋转臂
真空泵	Gast Manufacturing, Inc.	1531-107B-G288X	用于在实验室中吸取成虫
白色聚酯雪纺布料	Hobby Lobby	194811	防止幼虫从饲养容器中逃逸