本文介绍了一种在可食用植物中制备针对1型糖尿病的口服候选疫苗的实验方案。
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方法文章
红花菜豆中表达一种用于1型糖尿病的候选生物制药疫苗的瞬时表达研究
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
植物分子农业是指利用植物生产目标分子。在此领域中，植物既可作为生物反应器用于目标产物的生产及后续纯化，也可在使用可食用植物物种时，实现异源蛋白的直接口服递送。本研究中，我们采用基于去结构化植物病毒的重组DNA技术，结合真空渗透法递送，开发了一种以可食用植物系统为基础的1型糖尿病（T1D）候选口服疫苗。研究结果表明，红甜菜可作为表达人源T1D相关自身抗原的适宜宿主，该抗原被认为是T1D疫苗的潜在候选分子。我们对表达自身抗原的叶片进行了系统表征，包括其对胃消化的耐受性、残留细菌负荷以及次生代谢物谱，从而全面概述了植物用于异源蛋白直接口服递送的生产工艺。分析结果显示，在模拟胃消化条件下，冻干的候选口服疫苗几乎完全降解，提示在植物源性GAD疫苗的制备过程中需采用包封策略以提高其稳定性。
引言
自20世纪80年代植物分子生物学革命以来，基于植物的生物制药生产系统可被视为对基于微生物和哺乳动物细胞的传统系统的替代方案1。与传统平台相比，植物系统具有多项优势，其中最重要的是可扩展性、成本效益和安全性2。重组产物可从转基因植物组织中纯化后通过注射或口服途径给药，此外，转基因的可食用植物也可直接用于口服递送。口服途径可同时促进黏膜免疫和全身免疫，并避免了对针头和专业医疗人员的需求。此外，口服给药省去了复杂的下游加工过程，而该过程通常占重组蛋白总生产成本的80%3。上述所有优势可转化为生产、物资和人力成本的节约，从而降低每剂药物的成本，使药物能够为全球大多数人群所负担。
已开发出多种策略，用于在植物中实现稳定转化和瞬时表达，以生产重组蛋白。其中，一种高产量的去构建植物病毒表达系统（例如 magnICON）表现出优异的性能，可在相对较短的时间内实现重组蛋白的高产量4。已有大量报道采用基于植物病毒的表达 系统在Nicotiana benthamiana植株中进行瞬时表达，该植物被视为标准的生产宿主。然而，由于其叶片中会积累生物碱及其他有毒代谢物，这种模式植物不被认为是一种可食用物种。
本研究中，我们比较了两种....
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方案
1. 红甜菜和菠菜的栽培
- 在生长室中种植红甜菜（B. vulgaris cv Moulin Rouge）和菠菜（S. oleracea cv Industria），光照强度为150 µE，相对湿度65%，光/暗周期为12小时，温度分别为23/21 °C。
- 种子萌发后，每周施用两次市售肥料溶液（浓度为1 g/L）（材料表）。进行农杆菌浸润实验时，使用五周大的菠菜和六周大的红甜菜植株。
2. 利用去构建的植物病毒载体技术进行瞬时表达
- 植物表达载体的构建
- 使用标准技术将载体——5’模块（pICH20111）、3’模块（pICH31070.GAD65mut、pICH31070.∆87G65mut 和 pICH7410.eGFP，按先前所述方法制备）1,2,7，以及整合酶模块（pICH14011）——导入农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101 菌株中。在含有 50 μg/mL 利福平及相应载体特异性抗生素的 LB 培养基中于 28 °C 培养 2 天（pICH20111、pIC....
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结果
本研究展示了在可食用植物组织中开发口服疫苗的工作流程。重点在于目标蛋白在可食用宿主植物物种中的表达，以及对潜在口服疫苗的表征。
第一步是评估基于植物病毒的表达技术在可食用植物系统中生产重组蛋白的适用性。为此，我们首先选用eGFP作为模型蛋白，并在两种可食用的叶用植物系统——红甜菜和菠菜中进行表达。通过人工农杆菌浸润法，将携带eGFP重组表达载体的A. tumefaciens菌液接种至植物组织中。利用Western印迹分析（图1A,B,D,E）检测荧光蛋白的表达，并在紫外光下进行定量分析。结果显示，红甜菜系统的eGFP表达水平显著高于菠菜：红甜菜在接种后第9天（dpi）的eGFP表达量达到544.9 ± 10.9 µg/g鲜叶重（FLW）（图1C），而菠菜的最高表达量为113.4 ± 0.3 µg/g FLW，出现在接种后第11天（dpi）（<.......
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讨论
本研究展示了针对自身免疫性糖尿病候选口服疫苗设计的初步分析。本实验的目标蛋白是一种突变型人源65 kDa谷氨酸脱羧酶，其表达与功能易于检测和定量12。该蛋白在不同可食用植物组织中的表达由载体介导5，这些载体可在极短时间内实现高水平的重组蛋白表达。最佳候选可食用植物宿主的筛选基于通过农杆菌介导的瞬时转化（agroinfiltration）在红甜菜和菠菜叶片中进行eGFP表达的结果。由于手工农杆菌转化过程耗时，且菠菜叶片组织较难渗透，该步骤可能成为工业化放大的关键限制因素。
确定收获时的具体天数（dpi），以获得重组蛋白的最高积累水平，是重组蛋白研究中的关键步骤，需根据具体情况逐一测试和筛选。通过对不同天数（4至12天）荧光蛋白表达水平的分析，可确定每种植物系统中表达量最高的时间点。在这些表达峰值日，比较增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的浓度（µg/g FLW），结果表明红菜头是重组蛋白产量表现最优的表达平台。
由于这一原因，进一步测试了.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由维罗纳大学在2014年项目征集框架下资助，联合项目“利用植物生产自身免疫性糖尿病可食用疫苗（eDIVA）”（项目编号：891854）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2-μm Minisart RC4 膜过滤器 | Sartorius-Stedim | 17764 | |
| 2–巯基乙醇 | Sigma | M3148 | 有毒；4% 与甘油、SDS 和 Tris-HCl 配制成上样缓冲液 |
| 4-吗啉乙磺酸（MES） | Sigma | M8250 | pH 5.5 |
| 96 孔板 | Sarstedt | 833924 | |
| 乙酸 | Sigma | 27221 | 腐蚀性 |
| 色谱纯乙腈（LC-MS 级） | Sigma | 34967 | |
| 乙酰丁香酮 | Sigma | D134406 | 有毒 – 0.1 M DMSO 储存液 |
| 细菌级琼脂 | Applichem | A0949 | 15 g/L 与酵母提取物、NaCl 和胰蛋白胨配制 LB 培养基（NaOH 调节 pH 至 7.5） |
| 甲酸铵 | Sigma | 70221 | |
| 抗 eGFP 抗体 | ABCam | ab290 | |
| 抗 GAD 65/67 抗体 | Sigma | G5163 | |
| 抗 LHCB2 抗体 | Agrisera | AS01 003 | |
| 亮蓝 R-250 | Sigma | B7920 | |
| C18 柱 | Grace | - | Alltima HP C18（150 mm × 2.1 mm；3 μm）色谱柱 |
| C18 保护柱 | Grace | - | Alltima HP C18（7.5 mm × 2.1 mm；5 μm）保护 柱 |
| CalMag Grower | Peter Excel | 15-5-15 | 肥料 |
| 羧苄青霉素二钠 | Duchefa Biochemie | C0109 | 有毒 |
| 化学发光成像系统 | BioRad | 1708370 | ChemiDoc Touch 成像系统 |
| 氯仿 | Sigma | C2432 | |
| 去垢剂 | Sigma | P5927 | 聚山梨酯 20 |
| 荧光读板仪 | Perkin-Elmer | 1420-011 | VICTOR 多功能计数器 |
| 色谱纯甲酸（LC-MS 级） | Sigma | 94318 | |
| 甘油 | Sigma | G5516 | 15% 与 Tris-HCl、SDS 和 2–巯基乙醇配制成上样缓冲液 |
| GoTaq G2 聚合酶 | Promega | M7841 | |
| HCl | Sigma | H1758 | 腐蚀性 |
| HILIC 柱 | Grace | - | Ascentis Express HILIC（150 mm × 2.1 mm；粒径 2.7 μm）色谱柱 |
| HILIC 保护柱 | Grace | - | Vision HT HILIC（7.5 mm × 2.1 mm；3 μm）保护 柱 |
| 辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔抗体 | Sigma | A6154 | 避免反复冻融 |
| HPLC 自动进样器 | Beckman Coulter | - | System Gold 508 自动进样器 |
| HPLC 系统 | Beckman Coulter | - | System Gold 128 溶剂模块 HPLC |
| 异丙醇 | Sigma | 24137 | 易燃 |
| 硫酸卡那霉素 | Sigma | K4000 | 有毒 |
| KCl | Sigma | P9541 | 2 g/L 与 NaCl、Na2HPO4 和 KH2PO4 配制 PBS |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | 2.4 g/L 与 NaCl、Na2HPO4 和 KCl 配制 PBS |
| 上样缓冲液 | |||
| 鲁米诺溶液 | GE Healthcare | RPN2232 | 使用 ECL Prime Western Blot 试剂盒配制溶液 |
| 冷冻干燥机 | 5Pascal | LIO5P0000DGT | |
| 质谱仪 | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000；质谱仪配备 ESI 源，分析器为离子阱 |
| 甲醇 | Sigma | 32213 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| 脱脂奶封闭液 | Ristora | - | 在 PBS 中配制成 3% |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | 与 NaH2PO4 配制磷酸钠缓冲液 |
| NaCl | Sigma | S3014 | 80 g/L 与 KCl、Na2HPO4 和 KH2PO4 配制 PBS；10 g/L 与酵母提取物、胰蛋白胨和细菌级琼脂配制 LB 培养基（NaOH 调节 pH 至 7.5） |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | 与 Na2HPO4 配制磷酸钠缓冲液；14.4 g/L 配制 PBS |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| 硝酸纤维素膜 | Ge Healthcare | 10600002 | |
| 猪胃黏膜来源胃蛋白酶 | Sigma | P7000 | |
| 过氧化物酶底物 ECL | GE Healthcare | RPN2235 | 避光材料 |
| 真空加压泵 | VWR | 111400000098 | |
| 试剂 A | Sigma | B9643 | 将此试剂 50 份与试剂 B 1 份混合，配制 BCA 工作液 |
| 试剂 B | Sigma | B9643 | 将此试剂 1 份与试剂 A 50 份混合，配制 BCA 工作液 |
| 利福平 | Duchefa Biochemie | R0146 | 有毒 – 25 mg/mL DMSO 储存液 |
| SDS（十二烷基硫酸钠） | Sigma | L3771 | 易燃、有毒、腐蚀性—10% 储存液；3% 与 Tris-HCl、甘油和 2–巯基乙醇配制成上样缓冲液 |
| 焦亚硫酸钠 | Sigma | 7681-57-4 | |
| 超声破碎系统 | Soltec | 090.003.0003 | Sonica® 2200 MH；频率 40 kHz |
| 注射器 | Terumo | - | |
| 透明固定式 300-µL 插入式玻璃管 | Thermo Scientific | 11573680 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | 用 1N HCl 调节 pH 配制 Tris-HCl 缓冲液，使用 1.5 M Tris-HCl（pH 6.8）与 SDS、甘油和 2–巯基乙醇配制上样缓冲液 |
| 胰蛋白胨 | Formedium | TRP03 | 10 g/L 与酵母提取物、NaCl 和细菌级琼脂配制 LB 培养基（NaOH 调节 pH 至 7.5） |
| 真空浓缩仪 | Heto | 3878 F1-3 | Speed-vac 系统 |
| 色谱纯水（LC-MS 级） | Sigma | 39253 | |
| 酵母提取物 | Sigma | Y1333 | 5 g/L 与胰蛋白胨、NaCl 和细菌级琼脂配制 LB 培养基（NaOH 调节 pH 至 7.5） |
参考文献
- Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).
- Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L.
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