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方法文章

红花菜豆中表达一种用于1型糖尿病的候选生物制药疫苗的瞬时表达研究

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⸱

DOI：

10.3791/59298

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2019年3月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, University of Verona

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种在可食用植物中制备针对1型糖尿病的口服候选疫苗的实验方案。

摘要

植物分子农业是指利用植物生产目标分子。在此领域中，植物既可作为生物反应器用于目标产物的生产及后续纯化，也可在使用可食用植物物种时，实现异源蛋白的直接口服递送。本研究中，我们采用基于去结构化植物病毒的重组DNA技术，结合真空渗透法递送，开发了一种以可食用植物系统为基础的1型糖尿病（T1D）候选口服疫苗。研究结果表明，红甜菜可作为表达人源T1D相关自身抗原的适宜宿主，该抗原被认为是T1D疫苗的潜在候选分子。我们对表达自身抗原的叶片进行了系统表征，包括其对胃消化的耐受性、残留细菌负荷以及次生代谢物谱，从而全面概述了植物用于异源蛋白直接口服递送的生产工艺。分析结果显示，在模拟胃消化条件下，冻干的候选口服疫苗几乎完全降解，提示在植物源性GAD疫苗的制备过程中需采用包封策略以提高其稳定性。

引言

自20世纪80年代植物分子生物学革命以来，基于植物的生物制药生产系统可被视为对基于微生物和哺乳动物细胞的传统系统的替代方案1。与传统平台相比，植物系统具有多项优势，其中最重要的是可扩展性、成本效益和安全性2。重组产物可从转基因植物组织中纯化后通过注射或口服途径给药，此外，转基因的可食用植物也可直接用于口服递送。口服途径可同时促进黏膜免疫和全身免疫，并避免了对针头和专业医疗人员的需求。此外，口服给药省去了复杂的下游加工过程，而该过程通常占重组蛋白总生产成本的80%3。上述所有优势可转化为生产、物资和人力成本的节约，从而降低每剂药物的成本，使药物能够为全球大多数人群所负担。

已开发出多种策略，用于在植物中实现稳定转化和瞬时表达，以生产重组蛋白。其中，一种高产量的去构建植物病毒表达系统（例如 magnICON）表现出优异的性能，可在相对较短的时间内实现重组蛋白的高产量4。已有大量报道采用基于植物病毒的表达 系统在Nicotiana benthamiana植株中进行瞬时表达，该植物被视为标准的生产宿主。然而，由于其叶片中会积累生物碱及其他有毒代谢物，这种模式植物不被认为是一种可食用物种。

本研究中，我们比较了两种可食用植物系统——红甜菜（Beta vulgaris cv Moulin Rouge）和菠菜（Spinacea oleracea cv Industria），利用基于植物病毒的载体5表达谷氨酸脱羧酶65 kDa同工型（GAD65）的两种候选形式。GAD65是与1型糖尿病（T1D）相关的主要自身抗原，目前正处于人体临床试验阶段，旨在通过诱导免疫耐受来预防或延缓T1D的发生6。GAD65在植物中的生产已在模式植物如Nicotiana tabacum和N. benthamiana中进行了广泛研究4,5,6,7。本文描述了利用可食用植物物种在可直接口服的组织中生产该分子的方法。从技术角度出发，我们通过评估多个参数，研究并筛选了适用于农杆菌浸润的植物系统及用于GAD65生产的可食用植物平台：包括重组蛋白的表达水平、用于口服的植物组织中残留的微生物载量、GAD65对胃消化的耐受性，以及转基因植物与野生型植物之间的生物等效性。

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方案

1. 红甜菜和菠菜的栽培

  1. 在生长室中种植红甜菜（B. vulgaris cv Moulin Rouge）和菠菜（S. oleracea cv Industria），光照强度为150 µE，相对湿度65%，光/暗周期为12小时，温度分别为23/21 °C。
  2. 种子萌发后，每周施用两次市售肥料溶液（浓度为1 g/L）（材料表）。进行农杆菌浸润实验时，使用五周大的菠菜和六周大的红甜菜植株。

2. 利用去构建的植物病毒载体技术进行瞬时表达

  1. 植物表达载体的构建
    1. 使用标准技术将载体——5’模块（pICH20111）、3’模块（pICH31070.GAD65mut、pICH31070.∆87G65mut 和 pICH7410.eGFP，按先前所述方法制备）1,2,7，以及整合酶模块（pICH14011）——导入农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101 菌株中。在含有 50 μg/mL 利福平及相应载体特异性抗生素的 LB 培养基中于 28 °C 培养 2 天（pICH20111、pICH14011 和 pICH7410.eGFP 使用 50 μg/mL 羧苄青霉素，pICH31070 使用 50 μg/mL 卡那霉素）。
    2. 通过菌落 PCR 筛选菌落，各载体使用以下特异性引物：针对 3’模块 pICH31070.GAD65mut 和 pICH31070.∆87G65mut 的引物为 5’-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3’ 和 5’-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3’，退火温度 55 °C，延伸时间 110 s；针对第三个 3’模块 pICH7410.eGFP 的引物为 5’-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3’ 和 5’-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3’，退火温度 53 °C，延伸时间 30 s；针对 5’模块的引物为 5’-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3’ 和 5’-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3’，退火温度 53 °C，延伸时间 20 s；针对整合酶模块的引物为 5’-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3’ 和 5’-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3’，退火温度 57 °C，延伸时间 45 s。
    3. 在总体积为 20 μL 的体系中进行 PCR 反应，反应循环程序如下：95 °C 预变性 5 min；进行 35 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 30 s、退火温度下退火 30 s 及 72 °C 延伸（退火温度和延伸时间根据每对引物特异性设定）；最后在 72 °C 延伸 7 min。
  2. 注射器农杆菌浸润法
    1. 将三种 A. tumefaciens 转化子分别接种于 50 mL 含 50 μg/mL 利福平及相应载体特异性抗生素的 LB 培养基中（转化了 pICH20111、pICH14011 或 pICH7410.eGFP 的 A. tumefaciens 使用 50 μg/mL 羧苄青霉素，转化了 pICH31070 的 A. tumefaciens 使用 50 μg/mL 卡那霉素），于 28 °C 摇床过夜培养。
    2. 将过夜培养的菌液在 4,500 ×g 离心 20 min 收集菌体，用 100 mL（或初始菌液体积的两倍）浸润缓冲液（含 10 mM 4-吗啉乙磺酸（MES；pH 5.5）和 10 mM MgSO4）重悬，无需考虑 OD600。室温（RT）孵育 3 h。
    3. 将含有三种模块之一（GAD65mut、∆87GAD65mut 或 eGFP 3’模块）的菌液与 5’模块和整合酶模块的菌液等体积混合。使用该混合菌液对红甜菜和菠菜叶片进行注射器浸润。
    4. 将 5 mL 菌液装入无针头的注射器中。将注射器尖端紧贴红甜菜和菠菜叶片的下表面，同时在叶片另一侧施加轻微反向压力。
    5. 从植株顶端开始，浸润前三个完全展开的叶片。用纸质标签在叶柄上标记已浸润的叶片。将植株放回生长室，在标准条件下培养。
      注意：出于健康与安全考虑，浸润过程中应佩戴护目镜和手套。
    6. 在侵染后 4 至 14 天（dpi）采集浸润过的叶片，并用液氮速冻。将植物组织储存在 -80 °C。
  3. 真空农杆菌浸润法
    1. 将三种 A. tumefaciens 转化子分别在含 50 μg/mL 利福平及相应载体特异性抗生素的 50 mL LB 培养基中，于 28 °C 摇床过夜培养。
    2. 将过夜培养的菌液在 4,500 ×g 离心 20 min 收集菌体，用 1 L 浸润缓冲液重悬至 OD600 为 0.35，室温（RT）孵育 3 h。
    3. 向每种菌液中加入 0.01%（v/v）的去垢剂（聚山梨酯 20）。将含有三种模块之一（GAD65mut、∆87GAD65mut 或 eGFP 3’模块）的菌液与 5’模块和整合酶模块的菌液等体积混合。
    4. 将一株植物（六周龄的红甜菜植株，见第 1 节）插入支架中。将支架倒置并置于盛有浸润液（2 L）的烧杯上方，使叶片完全浸入浸润菌液中。
      注意：确保所有叶片完全浸没在菌液中。必要时可添加额外浸润液以提高液面。
    5. 将带有浸没植株的浸润液转移至浸润室中并关闭舱门。启动真空泵，打开浸润室的真空进气阀。
    6. 当浸润室内压力降至 90 mbar 时，维持真空 3 min，随后释放真空 45 s。待浸润室恢复至大气压后，打开舱门，将浸润过的植株从菌液中取出。
    7. 将植株放回生长室，在标准条件下培养。
    8. 根据重组蛋白的最大表达时间（dpi）采集浸润过的叶片，并用液氮速冻。将植物组织储存在 -80 °C。

3. 重组蛋白表达分析

  1. 总可溶性蛋白（TSP）提取
    1. 使用研钵和研杵在液氮中将通过注射器或真空渗入法获得的红甜菜和菠菜叶片（分别在步骤2.2.6和2.3.8中收集）研磨成细粉。将粉末转移至15 mL塑料管中，并于-80 °C保存。
    2. 向300 mg叶粉中加入900 µL提取缓冲液（50 mM 磷酸钠，pH 8.0，20 mM 亚硫酸氢钠）。
      注意：所选植物组织重量（mg）与缓冲液体积（µL）的比例为1:3。
    3. 通过涡旋振荡1分钟使混合物均质化，然后在4 °C下以30,000 ×g离心40分钟。
    4. 将上清液收集至洁净的离心管中，并于-80 °C保存。
  2. 植物eGFP的可视化与定量
    1. 将来自表达eGFP的叶片的每种TSP提取物各100 µL（设三个技术重复）加入96孔板中。
    2. 将96孔板放入荧光读板仪中并开始检测。使用适用于eGFP荧光检测的485/535 nm滤光片组合。
    3. 为进行绝对定量，在同一块板中制备标准曲线，加入不同量（62.5、125、500、750和1,000 ng）的纯化eGFP。
  3. 双辛可宁酸（BCA）法测定TSP含量
    1. 将试剂A（材料表）50份与试剂B（材料表）1份混合。根据待测样品和标准品的数量，配制足量的新鲜BCA工作液。
      注意：每个样品所需的BCA工作液体积为1.9 mL。对于包含9个标准品（含空白）的标准程序，共需17.1 mL BCA工作液。
    2. 用移液器将每种标准品（包括空白）及TSP提取物各0.1 mL加入已标记的离心管中。
      注意：作为校准标准品，应使用与样品相同的稀释液（如水）新鲜配制一系列浓度范围为10–1,000 μg/mL的牛血清白蛋白（BSA）标准品。空白组为0.1 mL用于标准品和样品配制的稀释液。
    3. 加入1.9 mL BCA工作液并充分混匀。盖好管盖，在37 °C孵育30分钟。
    4. 将离心管冷却至室温，在10分钟内测定所有样品在562 nm处的吸光度。
      注意：即使在室温下，显色反应仍会持续。只要在10分钟内完成所有管的吸光度测定，就不会引入显著误差。
    5. 从各标准品和TSP提取物的读数中减去空白组在562 nm处的吸光度值。
    6. 以各标准品浓度为横坐标，以其经空白校正后的562 nm吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，并据此确定每个TSP提取物的蛋白浓度。
  4. 按照Gecchele等8先前描述的方法进行考马斯亮蓝染色。
  5. Western印迹分析
    1. 按照Gecchele等8先前描述的方法进行Western印迹分析。
    2. 蛋白质经电泳分离后，采用标准技术将其转印至硝酸纤维素膜上。通过将4%脱脂奶粉溶于磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中配制封闭液。用10 mL封闭液在室温下封闭膜1小时。
    3. 在5 mL含0.1%去污剂的封闭液中，将兔源一抗按以下比例稀释：抗GAD65/67和抗LHCB2抗体为1:10,000，抗eGFP抗体为1:20,000。将膜与稀释后的一抗溶液在4 °C孵育过夜，或在室温下持续振荡孵育4小时。
    4. 弃去一抗溶液，用含0.1%去污剂的封闭液洗涤膜3次，每次5分钟。
    5. 在含0.1%去污剂的封闭液中，将辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔二抗按1:10,000稀释。将膜在室温下持续振荡孵育1.5小时。
    6. 弃去二抗溶液，用PBS-T（含0.1%去污剂的PBS）洗涤膜5次，每次5分钟。
    7. 根据制造商说明书，将膜与市售的鲁米诺溶液孵育，并使用化学发光成像系统检测信号。

4. 植物材料处理

  1. 在表达高峰期（11 dpi）收获经真空农杆菌浸润表达 ∆87GAD65mut 的红甜菜叶片，并用液氮速冻。
  2. 将冷冻的叶片在 -50 °C 和 0.04 mbar 条件下冻干 72 小时，然后于 -80 °C 保存。
  3. 将叶片研磨成细粉，置于含硅胶的密封容器中，于室温下避湿保存。

5. 胃消化模拟与细胞完整性分析

  1. 胃消化模拟
    1. 称取100 mg研磨后的冻干红甜菜叶片，用6 mL PBS（pH 7.4）重悬。
    2. 用6 M HCl将样品pH调节至2。
    3. 加入来自猪胃黏膜的4 mg/mL胃蛋白酶（溶于10 mM HCl），使终浓度达到1 mg/mL，或胃蛋白酶与总可溶性蛋白的比例为1:20。在37 °C下振荡反应120分钟。
    4. 用1 M NaOH将样品pH调至8，以灭活胃蛋白酶。
    5. 取每份样品750 µL，在4 °C下以20,000 x g 离心20分钟。分别收集上清液，并将沉淀物用相当于上清液体积的上样缓冲液（1.5 M Tris HCl，pH 6.8，3% SDS，15%甘油和4% 2-巯基乙醇）重悬。
      注意：出于健康与安全考虑，样品制备时应佩戴手套并在通风橱中操作。
    6. 通过Western印迹分析分别检测上清液和重悬后的沉淀物8。
  2. 细胞完整性分析
    1. 准备两份100 mg研磨后的冻干红甜菜叶片，分别用6 mL PBS（pH 7.4）重悬。
    2. 仅将其中一份样品的pH用6 M HCl调节至2。将两份样品在37 °C下振荡120分钟。
    3. 取每份样品750 µL，在4 °C下以20,000 x g 离心20分钟。分别收集上清液，并将沉淀物用相当于上清液体积的上样缓冲液重悬。
    4. 通过Western印迹分析分别检测上清液和重悬后的沉淀物。

6. 生物负载检测

  1. 称取100 mg冻干的红甜菜叶片，将粉末重悬于8 mL无菌PBS（pH 7.4）中，涡旋振荡1分钟。
  2. 制备不含抗生素的LB培养基，或分别添加：(i) 50 µg/mL利福平，(ii) 50 µg/mL利福平和50 µg/mL羧苄青霉素，(iii) 50 µg/mL利福平和50 µg/mL卡那霉素，或(iv) 50 µg/mL利福平、50 µg/mL羧苄青霉素和50 µg/mL卡那霉素。
  3. 将每种冻干叶片匀浆液各取1 mL，分别接种于上述5种选择性LB培养基之一中。
  4. 将所有培养皿在28 °C下培养3天。
  5. 计数每块培养皿上生长的Agrobacterium菌落。
  6. 计算并定义残留细菌载量，即每毫升冻干叶片匀浆液中的菌落形成单位数（CFU/mL）。

7. 代谢物提取

  1. 初级代谢物提取
    1. 称取30 mg保存于-80 °C的、经真空农杆菌浸润表达∆87GAD65mut的红甜菜叶片粉末，置于2 mL塑料管中。
    2. 加入750 µL预冷的70/30 (v/v) 甲醇/氯仿溶液，涡旋振荡30 s，于-20 °C孵育2 h。
      注意：所有溶剂和添加剂必须为LC-MS级。
    3. 加入600 µL预冷水，于4 °C以17,900 ×g离心10 min。收集上层水-醇相并转移至新的2 mL管中。弃去下层氯仿相及中间相。
    4. 将样品置于真空浓缩仪中处理3 h，以蒸发溶剂。
    5. 将步骤7.1.4所得沉淀溶解于300 µL的50/50 (v/v) 乙腈/水溶液中，超声处理3 min。
    6. 将溶液经0.2 μm膜过滤器过滤后，转移至透明固定式300 µL插件玻璃管中。
  2. 次级代谢物提取
    1. 称取300 mg保存于-80 °C的、经真空农杆菌浸润表达∆87GAD65mut的红甜菜叶片粉末，置于15 mL塑料管中。
    2. 加入3 mL甲醇，涡旋振荡30 s，于40 kHz超声处理15 min。
      注意：所有溶剂和添加剂必须为LC-MS级。
    3. 于4 °C以4,500 ×g离心10 min，将上清液转移至新的15 mL管中。
    4. 取100 µL提取液，按1:3 (v/v) 比例用水稀释，经0.2 μm膜过滤器过滤。
    5. 将溶液转移至透明固定式300 µL插件玻璃管中。
  3. 极性脂质提取
    1. 称取200 mg保存于-80 °C的、经真空农杆菌浸润表达∆87GAD65mut的红甜菜叶片粉末，置于15 mL塑料管中。
    2. 加入200 µL水，再加入2 mL甲醇，冰上静置1 h。
      注意：所有溶剂和添加剂必须为LC-MS级。
    3. 涡旋振荡30 s，于40 kHz超声处理15 min。
    4. 于4 °C以4,500 ×g离心25 min。收集氯仿相并转移至2 mL管中。弃去上层水-醇相及中间相。
    5. 将样品置于真空浓缩仪中处理3 h，以蒸发溶剂。
    6. 将步骤7.3.5所得沉淀用600 µL甲醇溶解。
    7. 取100 µL提取液，按1:5 (v/v) 比例用甲醇稀释，经0.2 μm膜过滤器过滤。
    8. 将溶液转移至透明固定式300 µL插件玻璃管中。

8. 液相色谱-质谱分析及数据处理

  1. 按照供应商的建议设置液相色谱-质谱（LC-MS）系统。
    注意：液相色谱部分包括一个自动进样器，与高效液相色谱（HPLC）相连，用于次级代谢物和极性脂质分析时，在C18分析柱（150 × 2.1 mm，粒径3 µm）前连接一个C18保护柱（75 × 2.1 mm，粒径5 µm）；用于亲水相互作用液相色谱（HILIC）分析时，则在HILIC分析柱（150 × 2.1 mm，粒径2.7 µm）前连接一个HILIC保护柱（7.5 × 2.1 mm，3 µm）。质谱仪为离子阱质谱仪，配备电喷雾电离（ESI）或大气压化学电离（APCI）离子源。
  2. 为高效液相色谱梯度洗脱准备合适的溶剂。用于初级代谢物分析时，以20 mM甲酸铵作为流动相A，95%乙腈、5%水加10 mM甲酸铵作为流动相B；用于次级代谢物分析时，以含0.05%甲酸的水溶液为流动相A，含0.05%甲酸的乙腈为流动相B；用于极性脂质分析时，以含0.05%甲酸的水溶液为流动相A，100%乙腈为流动相B。
    注意：所有溶剂及添加剂必须为LC-MS级。
  3. 使用表1中列出的梯度程序进行代谢物洗脱。设定流速为0.2 mL/min。对于次级代谢物和极性脂质，每份样品进样10 µL；对于初级代谢物，每份样品进样5 µL。
  4. 通过混合不同样品的等量部分制备质量控制（QC）样品，以获得代表各实验条件的混合样本。在实验过程中分析QC样品，以监测仪器性能。具体而言，每分析10个样品后插入一次QC样品分析。
  5. 对样品进行随机化处理，以避免仪器引入的系统性偏差。
  6. 每完成9次分析后，立即插入一次色谱柱清洗程序和一次空白分析。
    注意：清洗程序应采用两种溶剂之间的缓慢梯度，并在强洗脱剂高比例条件下进行等度洗脱。空白分析采用纯甲醇:水（50/50, v/v）进样，以提高后续分析中保留时间的重现性。
  7. 根据表2中列出的参数，设置仪器在正负交替离子化模式下采集质谱数据。
    注意：其他参数取决于具体的仪器平台。
  8. 后续数据处理步骤请参照Dal Santo等人的文献9中所述方法进行。

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结果

本研究展示了在可食用植物组织中开发口服疫苗的工作流程。重点在于目标蛋白在可食用宿主植物物种中的表达，以及对潜在口服疫苗的表征。

第一步是评估基于植物病毒的表达技术在可食用植物系统中生产重组蛋白的适用性。为此，我们首先选用eGFP作为模型蛋白，并在两种可食用的叶用植物系统——红甜菜和菠菜中进行表达。通过人工农杆菌浸润法，将携带eGFP重组表达载体的A. tumefaciens菌液接种至植物组织中。利用Western印迹分析（图1A,B,D,E）检测荧光蛋白的表达，并在紫外光下进行定量分析。结果显示，红甜菜系统的eGFP表达水平显著高于菠菜：红甜菜在接种后第9天（dpi）的eGFP表达量达到544.9 ± 10.9 µg/g鲜叶重（FLW）（图1C），而菠菜的最高表达量为113.4 ± 0.3 µg/g FLW，出现在接种后第11天（dpi）（<...

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讨论

本研究展示了针对自身免疫性糖尿病候选口服疫苗设计的初步分析。本实验的目标蛋白是一种突变型人源65 kDa谷氨酸脱羧酶，其表达与功能易于检测和定量12。该蛋白在不同可食用植物组织中的表达由载体介导5，这些载体可在极短时间内实现高水平的重组蛋白表达。最佳候选可食用植物宿主的筛选基于通过农杆菌介导的瞬时转化（agroinfiltration）在红甜菜和菠菜叶片中进行eGFP表达的结果。由于手工农杆菌转化过程耗时，且菠菜叶片组织较难渗透，该步骤可能成为工业化放大的关键限制因素。

确定收获时的具体天数（dpi），以获得重组蛋白的最高积累水平，是重组蛋白研究中的关键步骤，需根据具体情况逐一测试和筛选。通过对不同天数（4至12天）荧光蛋白表达水平的分析，可确定每种植物系统中表达量最高的时间点。在这些表达峰值日，比较增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的浓度（µg/g FLW），结果表明红菜头是重组蛋白产量表现最优的表达平台。

由于这一原因，进一步测试了...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由维罗纳大学在2014年项目征集框架下资助，联合项目“利用植物生产自身免疫性糖尿病可食用疫苗（eDIVA）”（项目编号：891854）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2-μm Minisart RC4 膜过滤器Sartorius-Stedim17764
2–巯基乙醇SigmaM3148有毒；4% 与甘油、SDS 和 Tris-HCl 配制成上样缓冲液
4-吗啉乙磺酸（MES）SigmaM8250pH 5.5
96 孔板Sarstedt833924
乙酸Sigma27221腐蚀性
色谱纯乙腈（LC-MS 级）Sigma34967
乙酰丁香酮SigmaD134406有毒 – 0.1 M DMSO 储存液
细菌级琼脂ApplichemA094915 g/L 与酵母提取物、NaCl 和胰蛋白胨配制 LB 培养基（NaOH 调节 pH 至 7.5）
甲酸铵Sigma70221
抗 eGFP 抗体ABCamab290
抗 GAD 65/67 抗体SigmaG5163
抗 LHCB2 抗体AgriseraAS01 003
亮蓝 R-250SigmaB7920
C18 柱Grace   -Alltima HP C18（150 mm × 2.1 mm；3 μm）色谱柱
C18 保护柱Grace   -Alltima HP C18（7.5 mm × 2.1 mm；5 μm）保护 柱
CalMag GrowerPeter Excel15-5-15肥料
羧苄青霉素二钠Duchefa BiochemieC0109有毒
化学发光成像系统BioRad1708370ChemiDoc Touch 成像系统
氯仿SigmaC2432
去垢剂SigmaP5927聚山梨酯 20
荧光读板仪Perkin-Elmer 1420-011VICTOR 多功能计数器
色谱纯甲酸（LC-MS 级）Sigma94318
甘油SigmaG551615% 与 Tris-HCl、SDS 和 2–巯基乙醇配制成上样缓冲液
GoTaq G2 聚合酶PromegaM7841
HClSigmaH1758腐蚀性
HILIC 柱Grace   -Ascentis Express HILIC（150 mm × 2.1 mm；粒径 2.7 μm）色谱柱
HILIC 保护柱Grace   -Vision HT HILIC（7.5 mm × 2.1 mm；3 μm）保护 柱
辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔抗体SigmaA6154避免反复冻融
HPLC 自动进样器Beckman Coulter   -System Gold 508 自动进样器
HPLC 系统Beckman Coulter   -System Gold 128 溶剂模块 HPLC
异丙醇Sigma24137易燃
硫酸卡那霉素SigmaK4000有毒
KClSigmaP95412 g/L 与 NaCl、Na2HPO4 和 KH2PO4 配制 PBS
KH2PO4SigmaP97912.4 g/L 与 NaCl、Na2HPO4 和 KCl 配制 PBS
上样缓冲液
鲁米诺溶液GE HealthcareRPN2232使用 ECL Prime Western Blot 试剂盒配制溶液
冷冻干燥机5PascalLIO5P0000DGT
质谱仪Bruker Daltonics  -Bruker Esquire 6000；质谱仪配备 ESI 源，分析器为离子阱
甲醇Sigma32213
MgSO4SigmaM7506
脱脂奶封闭液Ristora   -在 PBS 中配制成 3%
Na2HPO4SigmaS7907与 NaH2PO4 配制磷酸钠缓冲液
NaClSigmaS301480 g/L 与 KCl、Na2HPO4 和 KH2PO4 配制 PBS；10 g/L 与酵母提取物、胰蛋白胨和细菌级琼脂配制 LB 培养基（NaOH 调节 pH 至 7.5）
NaH2PO4SigmaS8282 与 Na2HPO4 配制磷酸钠缓冲液；14.4 g/L 配制 PBS
NaOHSigmaS8045
硝酸纤维素膜Ge Healthcare10600002
猪胃黏膜来源胃蛋白酶SigmaP7000
过氧化物酶底物 ECLGE HealthcareRPN2235避光材料
真空加压泵VWR111400000098
试剂 ASigmaB9643将此试剂 50 份与试剂 B 1 份混合，配制 BCA 工作液
试剂 BSigmaB9643将此试剂 1 份与试剂 A 50 份混合，配制 BCA 工作液
利福平Duchefa BiochemieR0146有毒 – 25 mg/mL DMSO 储存液
SDS（十二烷基硫酸钠）SigmaL3771易燃、有毒、腐蚀性—10% 储存液；3% 与 Tris-HCl、甘油和 2–巯基乙醇配制成上样缓冲液
焦亚硫酸钠Sigma7681-57-4
超声破碎系统Soltec090.003.0003Sonica® 2200 MH；频率 40 kHz
注射器Terumo   -
透明固定式 300-µL 插入式玻璃管Thermo Scientific11573680
Trizma BaseSigmaT1503用 1N HCl 调节 pH 配制 Tris-HCl 缓冲液，使用 1.5 M Tris-HCl（pH 6.8）与 SDS、甘油和 2–巯基乙醇配制上样缓冲液
胰蛋白胨FormediumTRP0310 g/L 与酵母提取物、NaCl 和细菌级琼脂配制 LB 培养基（NaOH 调节 pH 至 7.5）
真空浓缩仪Heto3878 F1-3Speed-vac 系统
色谱纯水（LC-MS 级）Sigma39253
酵母提取物SigmaY13335 g/L 与胰蛋白胨、NaCl 和细菌级琼脂配制 LB 培养基（NaOH 调节 pH 至 7.5）

参考文献

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