实时监测活体系统中G蛋白偶联受体与β-阻遏蛋白1/2的相互作用以加速药物发现

摘要

GPCR与β-阻遏蛋白相互作用是GPCR药物发现领域的一个新兴方向。为了在活体系统中监测此类相互作用，亟需准确、精确且易于建立的方法。本文展示了一种结构互补检测法，可用于实时监测活细胞中GPCR与β-阻遏蛋白的相互作用，并且该方法可拓展应用于任何GPCR。

摘要

G蛋白偶联受体（GPCR）与β-阻遏蛋白（β-arrestin）之间的相互作用是具有重要生理意义的关键过程。目前，在GPCR药物研发领域，尤其是在研究GPCR偏向性激动作用时，对新型药物与β-arrestin及其他胞质蛋白相互作用的表征具有极高价值。本文展示了应用一种新型结构互补检测方法，以在活体系统中实时精确监测受体与β-arrestin的相互作用。该方法简便、准确，可轻松扩展至任何感兴趣的GPCR，并且具有克服非特异性相互作用的优势，原因在于每个载体系统均含有低表达启动子。这种结构互补检测技术具备若干关键特性，能够实现对受体-β-arrestin相互作用的准确和精确监测，适用于研究任何GPCR系统的偏向性激动作用，以及由不同GPCR激酶（GRKs）所建立的GPCR羧基末端“磷酸化编码”，和影响受体-β-arrestin复合物稳定性或不稳定性的阻遏蛋白翻译后修饰。

引言

G蛋白偶联受体（GPCR）是目前市场上近35%药物的作用靶点^1,2，对其药理学特性的清晰理解在新型治疗药物的研发中至关重要³。在GPCR药物发现中，特别是在偏向性激动剂的开发过程中，一个关键环节是对新型配体在受体-β-阻遏蛋白相互作用方面的表征⁴，以及β-阻遏蛋白与其他胞质蛋白（如网格蛋白）之间的相互作用⁵。

已有文献记载，β-抑制蛋白依赖性信号转导在双相情感障碍、重度抑郁症和精神分裂症等神经系统疾病中发挥关键作用⁶，同时也与某些药物（如吗啡）的严重副作用相关⁷。

目前用于监测这些相互作用的方法通常无法真实反映研究中蛋白质的内源性生理水平，某些情况下信号较弱、存在光漂白现象，并且根据不同的G蛋白偶联受体（GPCR），实验建立可能在技术上具有挑战性⁸。这种新型的结构互补检测方法采用低表达启动子载体，以模拟内源性生理表达水平，并且与现有方法相比具有更高的灵敏度⁹。利用该方法，可轻....

方案

1. 引物设计策略

1. 设计引物，将目的基因插入 pBiT1.1-C [TK/LgBiT]、pBiT2.1-C [TK/SmBiT]、pBiT1.1-N [TK/LgBiT] 和 pBiT2.1-N [TK/SmBiT] 载体中。
2. 从这三个位点中至少选择一个，作为定向克隆所需的两种独特限制性酶切位点之一，因为存在一个同框终止密码子，可将多克隆位点分割，如图所示。 图1¹¹.
3. 在引物中加入所示的核苷酸序列 表1 用于编码图中红色显示的连接区残基 表 2¹¹.
4. 对于 pBiT1.1-C [TK/LgBiT] 和 pBiT2.1-C [TK/SmBiT] 载体，确保 5 ́ 引物包含一个ATG密码子和一个强效的Kozak共识序列（GCCGCCACC）。
5. 对于 pBiT1.1-N [TK/LgBiT] 和 pBiT2.1-N [TK/SmBiT] 载体，确保 3 ́ 引物包含一个终止密码子。
   注意：每个载体均含有HSV-TK启动子，以最大限度减少非特异性结合并降低实验假象；此外，每个载体还包含一个用于细菌中氨苄青霉素抗性的表达盒。

结果

使用本文所述方法，监测了原型G蛋白偶联受体（GPCR）与两种β-抑制蛋白（β-arrestin）亚型之间的相互作用。胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1r）构建体通过含有NheI和EcoRI酶切位点的引物制备，并克隆至pBiT1.1-C [TK/LgBiT] 和 pBiT2.1-C [TK/SmBiT] 载体中；而对于β-抑制蛋白，分别使用BgIII和EcoRI（β-arrestin2）以及NheI和XhoI（β-arrestin1）酶切位点，将其构建至另外两种载体pBiT1.1-N [TK/LgBiT] 和 pBiT2.1-N [TK/SmBiT] 中。使用50 ng GLP-1r-LgBiT/SmBiT质粒和50 ng在N端或C端标记有LgBiT或SmBiT的β-抑制蛋白质粒转染HEK293细胞。共筛选了四种不同的质粒组合（图3）并选择发光信号最强的一个进行后续实验（图4）。为了确定每种β-阻遏蛋白亚型招募的EC50值，采用剂量-反应曲线进行测定 10 μM, 1 μM，100 nM、10 nM 和 1 nM 的 G.......

讨论

利用本文所述方法，可通过GPCR-β-阻遏蛋白结构互补检测法，在活体系统中实时监测任何GPCR与β-阻遏蛋白1/2之间的相互作用。在此方面，我们观察到GLP-1受体（一种典型的B类GPCR）对两种β-阻遏蛋白亚型的招募存在差异，并且在发光信号达到峰值数分钟后，还观察到受体-β-阻遏蛋白复合物的解离。

为了在结构互补实验体系中获得最佳的检测灵敏度，我们筛选了受体与每种β-抑制蛋白亚型之间的四种不同空间取向，选择其中发光信号最强的一种用于后续研究，例如剂量-反应刺激曲线（图4）。利用该方法，可对具有重要治疗价值的G蛋白偶联受体（GPCR）——如与内分泌疾病糖尿病¹⁵相关的受体——其与β-抑制蛋白的相互作用进行表征。同样，该策略可通过将感兴趣的GPCR在C末端标记LgBiT或SmBiT，并结合本文所述的β-抑制蛋白1/2构建体，轻松适配于任意GPCR研究，因而成为现有方法的一种强大替代方案，无需复杂的实验设置，避免了如BRET和FRET中常见的供体与受体间信号重叠所导致的技术障碍。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗生素 青霉素 链霉素	Welgene	LS202-02	Penicillin/Streptomycin
细菌培养箱	JEIO Tech	IB-05G	Incubator (Air-Jacket), Basic
细胞培养基	Welgene	LM 001-05	DMEM Cell culture medium
细胞转染培养基	Gibco	31985-070	Optimem 1X cell culture medium
CO2 培养箱	NUAIRE	NU5720	Direct Heat CO2 Incubator
数字水浴锅	Lab Tech	LWB-122D	Digital water bath lab tech
DNA 聚合酶（校对功能）	ELPIS Biotech	EBT-1011	PfU DNA polymerase
DNA 纯化试剂盒	Cosmogenetech	CMP0112	miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini
DNA Taq 聚合酶	Enzynomics	P750	nTaq DNA polymerase
限制性内切酶 BglII	New England Biolabs	R0144L	BglII
限制性内切酶缓冲液	New England Biolabs	B72045	CutSmart 10X Buffer
限制性内切酶 EcoRI	New England Biolabs	R3101L	EcoRI-HF
限制性内切酶 NheI	New England Biolabs	R01315	NheI
限制性内切酶 XhoI	New England Biolabs	R0146L	XhoI
胎牛血清	Gibco Canada	12483020	Fetal Bovine Serum
凝胶/PCR DNA 小量提取试剂盒	Real Biotech Corporation	KH23108	HiYield Gel/PCR DNA MiniKit
连接酶	ELPIS Biotech	EBT-1025	T4 DNA Ligase
光学显微镜	Olympus	CKX53SF	CKX53 Microscope Olympus
脂质体转染试剂	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000
发光仪	Biotek/Fisher Scientific	12504386	Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers
NanoBiT 系统	Promega	N2014	NanoBiT PPI MCS Starter System
NanoLuc 荧光素酶底物	Promega	N2012	Nano-Glo Live Cell assay system
PCR 扩增仪	Eppendorf	6336000015	Master cycler Nexus SX1
聚-L-赖氨酸	Sigma Aldrich	P4707-50ML	Poly-L-lysine solution
胰蛋白酶 EDTA	Gibco	25200-056	Trysin EDTA 10X
白色细胞培养 96 孔板	Corning	3917	Assay Plate 96 well plate