本文演示了如何搭建一种低成本的可编程输出频率伏安计，该设备可与市售的筷子式电极配合使用，用于跨上皮/内皮电阻的测量。
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摘要
摘要
自20世纪80年代以来，跨上皮/内皮电阻（TEER）一直被用于评估体外屏障模型系统的汇合度和通透性。在大多数情况下，使用“筷子式”电极测定含有细胞单层的细胞培养滤膜插件系统上室与下室之间的电学阻抗。滤膜可使细胞附着、极化，并通过形成紧密连接相互作用。该技术已被应用于多种不同的细胞系（例如血脑屏障、脑脊液屏障、胃肠道和肺部组织的细胞）。TEER测量设备可从多家实验室仪器供应商处直接购买。然而，若能自行组装合适的伏安计，则可实现更具成本效益且可定制化的解决方案。本出版物的总体目标是构建一种可靠的设备，具备可编程输出频率，可与市售的筷子式电极配合用于TEER测量。
引言
上皮细胞和内皮细胞作为细胞边界，分隔机体的顶侧和基底外侧。当它们通过紧密连接相互连接时，可限制物质通过细胞旁间隙的被动扩散1，从而形成具有选择性通透性的屏障。目前已开发出多种人工屏障系统2，所用细胞包括微血管内皮细胞（HBMEC，血脑屏障3,4,5,6,7）、脉络丛上皮细胞（HIBCPP/PCPEC，血-脑脊液屏障8,9,10,11,12,13,14）、结直肠腺癌细胞（Caco-2，胃肠道模型15）或气道/肺泡细胞系（肺部模型16,17）。这些系统通常由生长在可渗透膜（即滤膜插入式系统）上的单层细胞构成，以便分别接触其顶侧和基底外侧。模型系统的完整性应尽可能接近体内真实条件。因此，已发展出多种技术，通过测定示踪化合物在细胞层间的细胞旁扩散来评估屏障功能。常用的示踪物包括放射性标记的蔗糖、染料标记的白蛋白、FITC标记的菊粉或染料标记的葡聚糖2。然而，化学染料可能使细胞无法用于后续实验。为实现对屏障系统的无创监测，可采用跨上皮/跨内皮电阻（TEER）测量法，检测细胞单层两侧的电阻力2,18,19。由于双极电极系统易受电极-电解质界面处电极极化阻抗的影响，通常采用四极测量法以克服这一局限20。该方法基于四端传感技术（4T），最早由威廉·汤姆森（开尔文勋爵）于1861年提出21。简而言之，由一对通电电极注入电流，同时由另一对电压检测电极测量电压降20。如今所谓的“筷子式”电极包含两对双电极，每对均含有一个用于测量电压的银/氯化银压片和一个用于传导电流的银电极2。在细胞层两侧的顶侧和基底外侧隔室之间测量电学阻抗（图1）。在外侧电极施加频率通常为12.5 Hz的方波信号，并测量产生的交流电流（AC）。同时，由第二对（内侧）电极测量细胞层上的电势降。随后根据欧姆定律计算电学阻抗。TEER值通过将测得的阻抗乘以细胞层表面积进行归一化处理，通常以 Ω ∙ cm2 表示。
某些系统以更复杂的方式排列细胞和电极，但仍基于四探针（4T）测量原理，并可使用相同的测量设备。例如，EndOhm系统包含一个插入滤膜的腔室和盖帽，其内部具有一对同心电极，结构与筷子式电极相同。这种电极形状可使跨膜电流密度分布更加均匀，从而减少读数之间的变异。更为复杂但精度更高的则是Ussing室系统，其中细胞层将两个充满林格氏液（Ringer's solution）的腔室分隔开22。该腔室本身可通入氧气、CO2或N2，并可进行搅拌或添加实验物质。当离子跨细胞层转运时，可通过靠近组织的两个电压感应电极测量电位差。该电压由紧邻细胞层的两个通电电极予以抵消。所测得的电流即可反映净离子转运量，同时可计算出跨上皮电阻（TEER），后者可反映屏障完整性22。TEER测量也可应用于“芯片上的器官”（body-on-a-chip）系统，这类系统模拟屏障组织模型23,24。这些系统可模拟细胞的体内环境，通常由多种细胞以层状结构堆叠组成。
以下方案介绍了如何构建一种经济高效且可靠的伏安计，该伏安计具有可编程输出频率，与市售测量系统相比，在TEER（经皮电阻）测量上不会产生统计学上的显著差异。
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方案
1. 组装用于测量TEER的基础伏特-安培计
- 准备一个标准的USB充电器作为5 V直流电源，一条USB延长线，一块用作可编程方波发生器的微控制器，两台能够以均方根值（真有效值，True-RMS）测量交流电流和电压的标准万用表，四根带香蕉插头的导线，一根带RJ14母头连接器的电话延长线（包含六个引脚，其中内部四个已接线，即6P4C），两根短导线，一个接线端子（luster terminal），一个120 kΩ的前置电阻，线端压接套管，以及焊接接线片。所需工具包括剥线钳、压接工具和电烙铁。
- 首先，将USB延长线连接至微控制器板。
- 剥去两根短导线末端的绝缘层。将每根导线的一端分别直接焊接到微控制器的0号和2号引脚，或焊接到焊接接线片上，再将接线片夹在相应的引脚上。将导线另一端压接上线端压接套管，并连接至接线端子，如图1所示。
- 将香蕉插头连接至万用表。剥去四根导线另一端的绝缘层并进行压接。
- 将电话延长线剪成两段，拆开并压接带有母头连接器一端的导线。检查导线与引脚之间的通路连续性。
- 第一台万用表用于测量单位为µA的电流（注意：必须明确设置为交流模式）。将其与一个120 kΩ的前置电阻串联后，连接至RJ14连接器的第5和第6引脚，对应筷子式电极的外侧电极对。
- 最后，将第二台万用表（用于测量单位为mV的跨上皮电压降）通过接线端子连接至RJ14连接器的第3和第4引脚，对应筷子式电极的内侧电极对。
- 如有需要，可将整个装置安装于外壳中。
2. 编程微控制器
- 根据需要修改提供的源代码（补充编码文件1）。在给定形式下，引脚0和2将在接地与+5 V之间切换，振荡半周期为40 ms。因此，将生成一个幅值为5 V、频率约为12.5 Hz的方波信号。由于微控制器时间发射器的不准确性，实际数值可能有所差异。
- 通过USB端口将微控制器连接至台式计算机，并使用配套软件上传源代码25。
3. 电压波形图的记录（可选）
- 使用一个 1 kΩ 的测试电阻跨接 RJ14 连接器的第 5 和第 6 引脚，并将其连接至示波器。
- 检查频率、峰值电压和波形。对数据进行数字化处理并导出。
- 如有需要，可同时记录参考设备（EVOM）和自制伏安计的示波图以进行比较。
注意：本实验中，数据使用数字存储示波器 HM 208 记录。由于该示波器功能较为基础，图像可在内部实现数字化（冻结），但必须通过模拟 PM 8143 X-Y 记录仪进行绘图，随后对图像进行扫描。
4. 细胞培养与TEER测量
- 在孔径为 3 µm 的细胞培养滤膜插件中接种人脉络丛乳头状瘤（HIBCPP）细胞，使用含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基（见材料表）9。按照 Dinner 等人9所述方法，在 37 °C、含 5% CO2 的水饱和气氛中培养细胞。
- 当滤膜电阻达到 70 Ω ∙ cm2 时，更换为无血清 DMEM/F12 培养基，并将该时间点定义为第 0 天。
- 将电极连接至自行组装的伏安计的 RJ14 接口，并插入 USB 电源。将万用表分别设置为交流电压模式（mV）和交流电流模式（µA）。
- 或者，将电极连接至市售的参考设备，并按照制造商说明开机。
- 将电极在 80% 乙醇中灭菌 10 分钟，随后在适当培养基中平衡 10 分钟。
- 将电极插入含 HIBCPP 细胞层的细胞培养滤膜插件系统的两个腔室中（电极较长部分置于下腔室，较短部分置于上腔室），直至测量值稳定。
- 对于参考设备，直接记录阻抗值；对于自行组装的伏安计，则根据欧姆定律（R = U/I）计算阻抗。注意电极角度会影响测量结果。
- 从第 0 天至第 4 天，重复进行跨上皮电阻（TEER）测量（步骤 3−6）。
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结果
为了比较自制伏安计与其商业对应设备的性能，记录了两种装置的电压波形图。
如图2A所示，当使用1 kΩ测试电阻进行负载操作时，参考仪器产生了一个振幅为80 mV、振荡时间为80 ms的方波信号，对应频率为12.5 Hz。
相比之下，自行组装设备的微控制器将供电电压切换为幅值为5 V的方波信号（图2B）若未设置前置电阻，则明显发现所产生的电流会破坏任何屏障功能，不适用于细胞培养实验（数据未显示）。另一个问题是，在此设置下，1 kΩ 的测试电阻会引起过载，导致电压下降图2B）。此外，由于时间发射器存在误差，微控制器的有效振荡时间为60 m...
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讨论
在将自制的伏安计用于日常操作之前，必须检查设备是否正常工作。在本例中，程序设定的振荡半周期为 40 ms（12.5 Hz），但实际测得的振荡时间为 60 ms（16.7 Hz）。这种微控制器时间发射器的不准确性对TEER测量未产生可检测的影响。建议最好使用万用表的频率测量功能来确定实际频率。若发现任何偏差，可相应调整源代码。此外，强烈建议验证测试电阻或其他已知配置是否能给出正确且可重复的结果。若使用人工细胞屏障系统，最好始终将分子通量与阻抗测量结果进行关联分析。
本实验中，通过使用一个120 kΩ的前置电阻来限制施加的电流。假设典型的跨上皮电阻（TEER）值范围为100 Ω−2,000 Ω，则可计算出细胞层上的电压降为4−83 mV。通过一个测试电阻模拟1 kΩ的TEER值，并确认其产生的电位降为40 mV（图2C）。
市售设备通常提供测量范围切换功能，通过切换前置电阻来将输出电流限制为不同的数值。在这种情况下，可以安装不同的前置电阻...
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披露
作者无竞争性财务利益或其他利益冲突。
致谢
作者谨此感谢 Herman Liggesmeyer 和 Marvin Bende 在电气工程与信息学领域提供的专业指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 120 kOhm 电阻器 | 通用（通用型）设备 | ||
| 香蕉插头线缆 | 通用（通用型）设备 | ||
| 线缆 | 通用（通用型）设备 | ||
| 筷子式电极 | 默克 Millicell | MERSSTX01 | |
| 筷子式电极（替代型号） | WPI 世界精密仪器公司 | STX2 | |
| 压接工具 | 通用工具 | ||
| Digispark / ATtiny85 | AZ-Delivery Vertriebs GmbH | Digispark Rev.3 Kickstarter | |
| DMEM:F12 | 吉布科（赛默飞世尔） | 31330038 | |
| 胎牛血清（FCS）/胎牛血清（FBS） | 生命技术公司 | 10270106 | |
| 3µm 透明滤插 | 格瑞纳 Bioone | 662631 | |
| HIBCPP | 石川博史 / 施罗滕 霍斯特 | ||
| 绝缘剥线器 | 通用工具 | ||
| 裸端子 | 通用（通用型）设备 | ||
| 示波器 | HAMEG | 数字存储示波器 HM 208 | |
| 绘图仪 | 飞利浦 | PM 8143 X-Y 记录仪 | |
| Arduino 软件 | https://www.arduino.cc | Arduino 1.8.9 | |
| 电烙铁 | 通用工具 | ||
| 焊接接线端子 | 通用（通用型）设备 | ||
| 带 RJ14（6P4C）连接器的电话线缆 | 通用（通用型）设备 | ||
| 测试电阻器 | 默克 Millicell | MERSSTX04 | |
| 真有效值万用表 | VOLTCRAFT | VC185 | |
| USB 充电器 | 通用（通用型）设备 | ||
| USB 延长线 | 通用（通用型）设备 | ||
| 用于 TEER 测量的伏欧表 | WPI 世界精密仪器公司 | EVOM | |
| 用于 TEER 测量的伏欧表（替代型号） | 默克 Millicell | ERS | |
| 电线端部护套 | 通用（通用型）设备 |
参考文献
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